全 文 ：生物物理学报 第 n卷 第 1期
C T B I A AO PH Y SIC A S】NIC A V日 . 11
1望巧年 3 月
N O
.
I M留. 11巡巧
抗氧化剂对 H eL a 细胞在竹红菌甲素( H A )光敏
损伤下的保护作用的研究
许娜飞 曹恩华 李景福 党连凯
( 中国科学 院生物物理研究所 北 京 1 011 0 )
摘 要
通过细胞台盼 兰拒染检测 、 电镜观察以及 ’ H一 JU r 同位素掺入等方法 , 分别从细胞水平 及分子
水平上 , 定性定量测定 了维生素 E帅 t)E 、 丁羚基 甲苯 (B H T )、 阿魏酸钠 (S )F 三种抗氧化剂对 于竹 红
菌甲素 (H A ) 光敏所致 H e加 细胞损伤 的抑制作用 。 结果表明 : 三种抗氧化剂对 于细胞的损伤 均有不
同程度的抑制作用 , 其中 Vi tE 的抑制作 用最明显 , B H T 及 S F 的抑制作用则较弱 ,提示脂质过氧化在
细胞膜和细胞核损伤 中起着重要的作用
关键词 : 竹细菌甲素 光敏损伤 H e加 细胞 抗氧化剂 保护作 用
竹细菌甲素 ( H A )是我国发现的一种具有光敏活性的扎醒类衍生物 。 它被细胞摄取后 , 主
要滞 留在细胞膜和胞浆中 。 甲素在可见光照射下产生 自敏光氧化 , 并在光敏氧化 的过程 中产
生单线态氧及多种活性氧 自由基 , 这些产物可引发脂质过氧化 , 产生脂过氧化物和脂 自由基
等 , 进一步加强了对膜结构和功能的改变 。 以往实验 已观察到 H A 光敏化作用造成 的细胞膜
蛋白的交联 〔12] 、 膜流动性改变 3[] 、 膜上酶和受体的钝化 4I] 等 。 由于光敏产生的活性氧 自由基 , 虽
具有高的反应活性 , 但寿命很短 , 其扩散距离有限 , 如 ’ O : 的扩散距离小于 0 . 1拜m , 只能 与膜组
分反应 。 因此 , 光敏引起脂质过氧化导致膜损伤是 比较清楚 的 。 我们实验还观 察到 , 在 甲素
光敏损伤 的细胞中引发 D N A 的损伤包括 D N A 链断裂 , 交联和荧光产物 的生成 M , 并且其损
伤难于修复 , 提示核膜 与染 色质相接之处有 可能 发生脂质过氧化产物 与染色质直接相互作
用 。 对于一类主要滞留于膜和胞浆的光敏药物 , 所诱导的细胞核 D N A 结构改变和可能的遗
传学效应 , 可能与脂 自由基有关 。
本文 采用 3H 一 T dr 同位素掺人法及电镜观察等实验手段 , 研究 了三种抗 氧化 剂 维生 素
E
、 丁轻基 甲苯 、 阿魏酸钠对于 甲素光敏损伤培养 H e L a 细胞的抑制作 用 。 实验结果表 明脂溶
性维生素 E 是一种 比较有效的保护剂 。 本文使用体外培养的活细胞为材料 , 它 比模 型系统更
接近生物体系 , 目的在于探讨 H A 对细胞的损伤机理 , 三种抗氧化剂对细胞损伤的抑制作用可
作为光化学疗法 中对正常细胞进行保护的参考 。
1 材料与方法
L l 试剂
竹红菌 甲素由云南微生物所提供 , 纯化后溶于二 甲亚矾 , 配成 50m g问 原液备用 。
丁轻基 甲苯 ( BH )T 溶液的配制 :取 B H T 1 0gnI 加人 0
.
16耐 T
~
80
, 用无水 乙醇稀释至
Sln
, 终浓度为 0 . lmo l几
。
B H T 为 S ig am 产品
。
维生素 E即 t )E 溶液的配制 : 取 iV tE Z巧 gm 加人 1 2d T~ 80
, 用无水 乙醇稀释到 s d ,
第 1期 抗氧化剂对 H e助细胞在竹红菌 甲素 (H A )光敏损伤下 的保护作用的研究
终浓度为 0 . l o ml瓜
。
V itE 为 S i gl l u 产品 。
阿魏酸钠 ( S F )溶液的配制 :取 S F9 2. 5mg用 20 川 IN N a OH 溶解后加人磷酸盐缓冲液
至 2. 5耐 。 阿魏酸钠 由中国医学科学院药物研究所提供 。
1. 2方法
1
.
2
.
1 细胞培养
实验细胞为 H eLa细胞 , 在 R PM I 一 164 0 培养液中 , 37 ℃ , 5% C O Z培养箱 中培养 。 其中培
养液中含有青链霉素各 l o U in st 阿 , 谷氨酸胺 30 0gnI 八, 小牛血清体积分数为 10 % 。
1
.
.2 2 细胞损伤检测
H e L a 细胞于 30 % 血清 的 R PM I 一 164 0 培养液 中贴壁 20 小时后 , 分别加人三种保护 剂
(对照组除外 ) , B H T 、 Vi tE 、 S F 的终浓 度分别 为 51逮m 0 1压 、 2 5# mo l瓜
、
0
.
43
~
l瓜 。 半小 时后各
实验组加人 H A (终浓度为 15尽mo l瓜 , 培液中小牛血清的含量换 3% , 于 37 ℃ 培 养箱 内作 用 2
小时后 , 各组换 P B S 照光 (对照组只换 P B S 不照光 ) , 光源为 2 20 V , 100 w 碘钨灯 , 光 照强度为
84
x 10 L ux
, 光照时间为 45 分秒 。 细胞照射后立 即更换含 30 % 小牛血清的培养液 , 培养箱 中
培养 4 小时后 , 以 .0 25 % 胰酶消化细胞 , 用 P B sl 耐 制成细胞悬液 , 滴一滴台盼兰染液于细胞
悬液中 , 染色 2 分钟 , 用血球计数 板 , 显微镜下观察 , 计数死活细胞数 , 以此计算细胞的存活
率 。 保护剂对细胞损伤的保护效率 Q按公式 ( l) 计算 , Q 值越大 , 表 明保护作用越强 。
存活细胞数
细胞总数 xl 0 %
,
:v 细胞存 活率 。
鱼竺丝二兰些迪 一 x 一0 00,0味 A一 咋 A十 Lihgt (l )
其 中 , :Q 保护效率 ; 珠 A + P 十 iL ght : 加保护剂后 的细 胞存活率 ; 咋 、 +卿 :t 加 H A 并光照的细胞
存活率 ; F H八 : 加 H A 不光照的细胞存 活率 。
1
.
2
.
3 细胞 D N A 合成的测定
接种 H e L a 细胞 2 X 105 /瓶于含 30 % 小牛血清的 R P M I一 1640 培养液中 , 置 37 ℃ 培 养培
中 2 0 小时后 , 加入不 同的保 护剂 , 温育半 小 时 , 各 实验组 再分 别 加入 H A 溶 液 (终浓 度 为
15祥mo l瓜 )
。 培养箱 中避光吸收 2 小时后 , 照光 45 秒 , 光照 时将含 H A 的培液换成 P B S , 光源
及光强同前 。 照后换含 ’ H 一 dT r 及 30 % 血清的培液 2耐 , 同位素浓度为 2匹八川 , 避光掺人 4 小
时后 , 收获细胞制样 。 以 P B S 洗去掺人的同位素 , 以 0 . 5% 胰酶消化细胞 , 并转移至微孔 滤膜
抽滤 , 50 % 三氯醋酸洗一遍抽干 , 最后以 95 % 乙 醇脱脂干燥并继续抽干 , 滤膜 干后放 人闪烁
瓶内 , 瓶 中有 sd 闪烁液 , 于暗盒 中放置半天 , 用全 自动液体闪烁仪测 ’ H 放射性 。 正常细胞能
够不断进行 D N A 的复制合成 , 受损伤的细胞及死亡细胞其 D N A 合成受到抑制或甚至不能进
行 D N A 合成 。 我们以 D N A 合成的百分率表示细胞的受损程度 , 计算公式表示如下 :
实验组的 C PM
对照组的 C PM xl o %
,
S : D N A 合成百分率 。
保护剂的保护效率以 Q 表示 , 其计算公式如下 :
S队 十 P + L I沙 t 一 S队+ L ;沙 t
凡、 一 S-lIA + L ight
X 10 %
生 物 物 理 学 报 19 5年
:Q 保护效率 ; 毓+P +L咖 : 加保护剂后细胞 D N A 合成百分率 ; 际、 lthg : 加 H A 并光照 的细
胞 D N A 合成百分率 ; S H A二 加 H A 不光照的细胞 D N A 合成百分率 。
1
.
.2 4 细胞的形态学观察
细胞处理方法同步骤 2 , 各实验组的细胞制成 PBS 细胞悬液 , 用滴管滴于载玻片上 , 在相
差倒置显微镜下观察各组细胞的形态差异 , 并进行活细胞照相 。
另外 , 按常规方法 , 将各组细胞制成电镜样品 , 进行 电镜观察 。
2 结果和讨论
.2 1 保护剂对细胞损伤的抑制作用
表 1是台盼兰染色法检测细胞损伤的统计结果 。 从表中可以看到 H A 照光组其细胞的存
活率是 70 . 5% , 与对照组和单独 H A 组相 比均有显著的降低 , 说明细胞受到 了明显 的光敏损
伤 。 加 人 iV tE 、 S F 、 B H T 后 , 细 胞存 活 率 分 别 为 7 .8 % 、 73 .5 % 、 71 . 1% , 保护 效率分别 为
37 名% 、 15 . 5% 、 3 . 1% , 细胞受损伤程度均有不 同的减 弱 , 其中 Vi tE 的保护作用在三者 中最明
显 。 因台盼兰染色法是 以膜损伤为检测基础的 , 反映脂溶性的 iV tE 对膜脂过氧化有最强 的抑
制作用 。
J汕bk l 刃 l e 姗 bil yt of eH aL eC刀5 a n d p or teC t ive
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C o n t l t〕1 1的
H A 15声江 n o lL/ 89
.
8 士 1 2
H A 151翻0 1瓜 + L igll t 70 . 5士 2 5 0
B H T S声汀n o l瓜 + L ig h t 71 . 1士 4 . 6 3 . 1
V it E 251用 1 0 1瓜 + L ight 77 8士 2 9 37名
S F 0
.
4 3
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〕1瓜 + L ig ll t 73万士 5 . 1 15 . 5
aT 城 2 D N A synt 比is o f H e助 优!】s a dn
p or 往戈 t ive e if c l e l l cy a fl e r a d d iiot n of a n tjo x yda n t
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C o n tor l l田
H A 151口刀。 l压 87 .4 士 4名
H A 15产` n o l压 + L ig ll t 56 . 2士 11 0
BH T s l a n OL I压+ L ig h t 564 士 8 9 0石
vi tE 2 5声` n 0 1瓜 + L ig ll t 70 3士 4 9 45 . 2
S F 0
.
4 3
mo
l瓜 + L igl l t 58 . 2士 6 3 64
.2 2 细胞 D N A 合成的测定结果
表 2 是 伙 一 dT r 掺人法测定各组细胞 D N A 合成情况的结果 。 H A 光照组 的 D N A 合成百
分率 S 为 56 2 % , 与对照组相 比 , 其 D N A 的合成受到显著的抑制 , 表 明 HA 的光敏 反应对细
胞 D N A 的合成有明显的抑制作用 。 而保护剂 Vi tE 的加人使 D N A 合成 的受抑制程度较 H A
光照组有较大的缓解 , 但 B H T 和 S F 的加人 , S 值分别 为 56 .4 % 、 58 .2 % , 未能明显改善 D N A
合成的受抑制程度 。 保护剂的保护效率依次分别为 iV tE 45 2 % , S F .6 4% , B H T .0 6% , 与细
胞存活率的结果一致 , 反映膜脂过氧化 程度直接影响细胞 D N A 合成 , 而 V it E 有 明显 的保护
作用 。
.2 3 保护剂对细胞形态的影响
活细胞照相 的结果显示 (图 1 ) : H A 照光组细胞的形态产生了大的变化 , 细胞膜 向外突起
形成一个大 的囊泡 , 这提示着细胞膜受到了损伤 。 我们 以前的实验证明 H A 主要分布于细胞
膜中 , 本实验结果则直观地显示 了 H A 光敏作用对细胞膜 的损 伤 。 加保护剂 B H T 和 S F 的


第 1期 抗氧化剂对 H e场细胞在竹细菌 甲素 (H A)光敏损伤下的保护作用的研究
组细胞 , 可见三种保护剂对细胞的光敏损伤有不 同程度的保护作用 , 而 iV tE 的保护作用最全
面明显 , 几近正常细胞 , S F 次之 , 而保护作用较差的 B H T 也可见细胞膜受到 了一定程度 的保
护 , 细胞骨架微绒毛系统 的损伤没有 H A 照光组严重 。 如前所述 , H A 主要滞留在膜和胞浆
中 , 光敏产生的活性氧的部位几乎就是它的反应部位 , 处于天然构象的染色质 的变化 , 并非是
甲素光敏产生活性氧 自由基的直接作用 , 而与核膜脂质过氧化有关 。 而在模 型系统中光敏剂
直接与底物相接触 , 并在水溶液 中进 行 , 很 难观 察到 脂质 过氧化 在引起 核变 化 中 的 重 要
作用 。
以上几方面的实验结果表明 : H A 的光敏反应对培养细胞作用的结果可引起细胞膜 、 细胞
骨架及胞浆中某些细胞器的损伤 , 以及细胞核染色质结构的改变 , 这与以往 H A 光敏作用所致
膜损伤和 D N A 损伤的结果一致 l[,z 5,q 。 综合这些实验结果 , 我们看到 , 无论是膜结构 的改 变或
染色质 (D N A )的损伤与脂质过氧化程度密切相关 。 我们已检测到小 鼠腹水肝癌细胞脂质过
氧产物与细胞 D N A 相互作用产生的荧光产物门 。 并且这一结果在三种保护剂 的研究 中得到
进一步说 明 口 三种保护剂的加人 , 使细胞的损伤程度均有降低 , 特别是细胞膜和核膜得到 了
保护 , 并且各实验结果都表明三者保护作用 由强而弱的次序为 iVt E 、 SF 、 BH T, iV tE 的作用较
后两者明显很多 。 三种保护剂的作用特点 , 与其 自身的化学结构及性质有关 。 iV tE 是 已知的
有效抗氧化剂 , 在生物膜 中可作 为 自由基清除剂 , 它是脂溶性 的 , 对于细胞膜有更大的亲和
力 , 能够发挥较大清除 自由基的作用 , 已有实验证明 , 它能清除 L , L O . , L (洲〕 . 和脂质过氧化
过程产生的 ’ q , 阻断脂质过氧化反应 8l[ 。 我们在最近的细胞核实验 中已证实甘露醇 、 Na 凡 等
对核膜的脂质过氧化作用有很弱的抑制作用 , 对 D N A 损伤 的保护作用也很小 , 而 iV tE 可以
明显降低丙二醛生成量 , 对 D N A 具有保护作用 9[] 。 S F 是 中药 当归的有效成份 , 最近报导 S F
对红细胞膜脂质过氧化有明显的抑制作用 10[ , 在我们的实验 中观察到它对细胞的光敏损伤确
有 定的保护作用 。 这可能与它抑制脂质过氧化有关 。 由于其亲水性能 , 故保护效果较 V itE
差 。 G ior it 等 {l ’〕在原叶琳光敏体系中加人 B H T 后 , 虽观 察到 M D A 稍有减少 , 但对膜蛋 白及
有关酶没有保护作用 , 这与在甲素光敏体系 中所得结果是一致 的 , BH T 不能有效地抑制膜蛋
白和 A T P a s e 的损伤 4[] , 对 H e L a 细胞核和染色质损伤及 D N A 合成没有保护作用 。 可能在细胞
体系中 B H T 并不是一种有效脂质过氧化抑制剂 , 这方面工作有待深人进行 。 本文保护剂所用
剂量是在初步试验 的基础上 选用的最佳剂量 , 本结果是它们最佳剂量的效果 比较 。 综上所
述 , 本文从细胞存活率 , D N A 合成率以及光镜和电镜观察结果表明 , H A 光敏化作用不仅直接
损伤膜系统 , 而且有可能通过脂质过氧化所产生的脂 自由基等产物作用于核染色质等生物大
分子 , 导致染色质的破坏 、 D N A 合成的改变 , 最终引起 细胞死 亡 , 有效地清 除脂 自由基 , 阻断
脂质过氧化 , 将减少染色质的损伤 , 提高细胞存活率 。
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本文于 19 4 年 7月 4 日收到