全 文 ：生物物理学报 第 n 卷 第 2 期
T A C AB IOP J I、 S IC A SL、 IC AV J . 11
1望巧年 6 月
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H eL a细胞对竹红菌甲素摄取的直接观察
与动态过程分析
许娜飞 李景福 曹恩华 * *
(中国科学院生物物理研究所 北京
陈天 明 俞 信 王苏生
(北京理工大学工程光学系 北京
王家珍
l (X ) 10 1)
孙江政
以刃8 1 )
摘 要
利用 荧光光语测定 方 法和高灵敏度荧光显微镜成像技术研究了竹红菌甲素 (H 犯不` r ell in A,
H A )在 H e La 细胞中的分布 , 动 态过程及其影响 因素和光敏损伤效应 。 结果显示 : H A 主要分布于 细
胞膜及胞策中 , 只有很少量 的 H A 进入细胞核中 。 细胞对 H A 的吸收 , 随着培养液中 H A 浓度的增
大和保温时 间的延长而增加 , 当保温 时间超过 16 小 时 , 或 当 H A 浓度达 87服饲 以上时 , 细胞对 H A
的吸收呈现饱和趋势 。 保温时间在 24 小时以 内 , 对 H A 排 出较快 , 24 小时的排出量为 见% 。 实验还
表明H A加上光照后时细胞具有明显的杀伤作用 , 使细胞存活率显著降低 , 提示 H A 光敏作用靶部位
是细胞膜 , 而引发的脂 自由基等产物可能是诱导 D N A 等损伤 , 最终导致细胞死亡的重要因素 。
关健词 : H e La 细胞 竹红菌甲素 光敏损伤 荧光图像
竹红菌甲素 ( H A ) 是我国发现的具有光敏活性的势醒类衍生物 , 临床上治疗疤痕疙瘩及某
些皮肤顽疾有显著疗效 lI] , 对动物肿瘤有明显的杀伤抑制作用 , 是一种新型 的光敏剂及光疗药
物 。 一些研究 已证明 H A 光敏化作用可引起膜蛋白交联阴 , 膜脂过氧化 间 , 膜 流动性 改变阎、 诱
导细胞 D N A 损伤同 和引起酶的失活阁 . 一些研究还表明 H A 光敏作用对细胞和生物大分子
的损伤与 0 2几 · O H , `0 2等活性氧 自由基产生有关 。 最近的研究还表明 , H A 的光敏作用可
导致细胞骨架的损伤 , 并使细胞周期部分阻断于 S 期网 。 为进一步探讨 H A 对细胞光敏作用的
分子机理 , 在上述研究基础上 , 采用荧光光谱测定和高灵敏度荧光显微镜成像技术直接观察
和测定了 H A 在体外培养 eH aL 细胞中的分布 、 动态过程和光敏损伤效应 。
1 材料和方法
L l 试剂
竹红菌甲素 由云南微生物所提供 。 纯化后溶于二 甲基亚矾 , 配成 50 Ign 阿 备用 。 其他试
剂均为国产分析纯试剂 。
L Z 方法
1
.
.21 细胞培养 实验细胞采 用 H e。 细胞 , 在 RP M I 1 64 0 培养液中 , 37 ℃ , 5% CO Z
培养箱中培养 。 培 养液 中含 有青 链霉素各 l o l ln ist 问 , 谷 氨酞胺 30 m g八, 小牛 血清 10 %
(中)。
* 国家自然科学基金资助项 目 。 * 巾通讯联系人 。
生 物 物 理 学 报 19 5 年
1
.
2. 2细胞处理 细胞接种于培养瓶中 , 待其贴壁后 ( 6 小 时 ) , 加入 H A 。 光照组细胞
用 PBS 代替培养基后 , 在可见光源下照光 , 光源为 10 0 w 碘钨灯 , 照射强度为 60 L ux , 照光时
间为 1分钟 。
实验设置对照组及 H A 处理组 。 对照组 细胞 不用 H A 处理 ; H A 处理 组 (H A 10雌 inl/ ,
1h6 )
, 再分为以下几组 :
a
. 用消毒的 P B S 洗一遍后 , 加一定体积的 P B S 进行光照 。
b
. 用消毒的 P B S 洗一遍后 , 不光照 。
c
. 不用 PBS 代替培养液 , 直接进行光照 。
d
. 不用 P B S 代替培养液 , 不光照 。
所有各组细胞按每瓶 20 个细胞接种于含小牛血清 20 % 的 R PM n 64 0 培养液中 , 培养 10
天左右 (H A 处理组需避光培养 ) , 活存细胞长成克隆 。 用甲醇固定 , G~
a 染色 , 计数形成的
克隆数 。 各组细胞形成的克隆数除以对照组细胞形成的克隆数为细胞存活百分数 。
1
.
.2 3 细胞 内光敏剂 H A 含量的检测 H A 被细胞吸收后 , 在 细胞 中的分布可用荧光
法进行定量测定 。 根据有关文献的方法 1m[ , 细胞计数后 , 将 H e aL 细胞悬 浮于 Iinl 的破 细胞缓
冲液 ( 10m l n 〔〕1压 T irS 一 H a , P H 7 . 5 , 0 . 15mo l瓜 s u cor s e , 0
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,室温下搅拌 5分钟后 , 离心 3分
钟 , 10 ,0 0中 m , 收集上清液 , 为细胞 质蛋 白组 份 。 在沉淀 中加人 1耐 破核缓冲液 ( 10 1扭 110 1瓜
T isr 一 H C I , p H 7
.
5
,
l
nmor
l瓜 p M s F ) , 充分混合 l 分钟 , 离心 10 分钟 , 10 , o o r /而 n , 上清液为核
液蛋白组份 。 在沉淀中加 l d T irS 一 HO 混匀 , 即为染色质组份 。 在 E X 465 n m , EM 608 nm
处测各组份的相对荧光强度 , 以此计算 H A 在细胞 内的胞浆 、 核液及染色质部分所 占百分比 。
细胞对 H A 的吸收 、 排泄 、 血清影响等各组实验中 , 细胞内的 H A 摄人量也由荧光法测得 , 经光
敏剂温育后的各组细胞 , 用冷 P B S 洗 4 次后 , 计数 , 用 O . I N aN O H .0 8而 , .0 7耐 冷的 PB S 将
细胞溶解 , 混匀 , 此溶液的最大激发波长为 4 65 n m , 最大发射波长为 6 On m (在碱性溶液中 , 最
大发射波长红移到 6 《) n m ) , 则以 4 65n m 为激发波 长 , 测定 6 0n m 处的相对荧光强度 , 荧光测
试使用 日本 H IT A C H I 850 荧光光度仪 。
1
.
.2 4 细胞 内 H A 分布及光敏损伤的直接观察 贴壁生长于盖玻 片上 的 H e L a 细胞固
定后 , 在高灵敏度图象荧光显微镜下进行直接观察 。 该装置是用高灵敏度弱光成象探 测器作
为图像接收器的新型荧光显微镜 , 仪器中采用的像增强器亮度增益为 50 , (X叉〕, 较常规荧光显微
镜探测灵敏度提高了 10 4倍 , 可探测到亮度为 10 一 ’ L ux 的微弱荧光 , 一般荧光显微镜为 10 一飞ux
的发光 。 细胞发出的荧光经像增强器放大后 , 输入到 C C D 面上 , 再由图像采集板输人到计算
机内 , 将图象存人磁盘或在监视器上直接观察 .
2 结果和讨论
.2 1 H A 在细胞内的分布
表 1列出了细胞与 H A 保温 16 小时以上后 , H A 在 H e助 细胞内的分布情况 。 从 中可以
看出 H A 主要分布于细胞膜和胞浆中 (约占 93 % ) , 进人细胞核的量很少 (约 占 7% ) 。 这和以
往的研究结果 : H A 主要作用于细胞膜引起膜损伤是一致的 12 一司。 照光组及不照光组的 H A 分

生 物 物 理 学 报 1男5 年
图中可以看出 , 随着保温时间的延长 , 细胞吸收 H A 的量连续增加 , 到 16 小时达到 近饱和程
度 , 时间的进一步延长 , H A 的吸收量没有明显的提高 。
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细胞在一定浓度 H A (56 . 6咫问 )的培养液 中温育 16 小时后 , 用 BP S 洗去未被细胞吸收的
H A
, 换成含 10 % 小牛血清的 R PM I 164 0 继续培养 , 并在不同的时间测定细胞内 H A 的含量 。
图 4 是细胞内 H A 的含量 随时间的变化关系 , 随着时间的延 长 , H A 的含量 减少 , 24 小 时以前
对 H A 的排出较快 , 24 小时其排出量为 50 % , 24 小时以后 对 HA 的排 出速度变慢 。 而与此作
参 比的未经 H A 处理 的对照组 , 其荧光强度一直保持在一水平线上 。
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第 2期 He La 细胞对竹细菌甲素摄取的直接观察与动态过程分析
2.3 2.血清浓度
在相同 HA 浓度 ( 7 5脂阿)不 同血清浓度下 , 细胞对 H A 的摄取情况见表 2 。 当血清含量
分别为 3% 、 10 % 、 30 % 时 , 其相 对吸收量 为 l :.0 64 :.0 36 . 血 清含 量越高 , 越不利于 细胞 吸收
H A
。 该现象提示 H A 易与血清结合 , 从而影响细胞对 H A 的吸收 。
.2 3 H A 对细胞的光敏杀伤作用
表 3 是 H A 对 H e L a 细胞克隆形成能力影响的实验结果 。 由该表可 以看 出 , 经 H A 处理的
各组细胞的存活率均低于对照组 , 两照光组 的存活率分别为 53 % , 24 % 均低于其对应不 照光
组的存活率 8 % ,78 % , 以上结果说明 H A 在不照光的条件下亦对细胞有毒性损伤作用 , 而 H A
吸收光后的光敏反应 , 则对细胞有更强的杀伤作用 . 另外不用 P B S 洗的组与用 P B S 洗的组相
比 , 前者的存活率低于后者 。 这可能是由于细胞外一部分构散结合的 H A 被 PBS 洗去 , 而这
部分 H A 在加重膜脂的过氧化方面起着重要作用 , 已有证据证明膜脂过氧化过程 中所产生 的
自由基与非 自由基产物 , 特别是脂 自由基由于其寿命较长和很高的反 应活性 , 并能跨膜作用
于 D N A 可诱导 D N A 损伤 1’ ] , 是降低细胞存活率不可忽视的重要因素之一 。
H A 光照后 , 细胞荧光成像发 生明显变化 ( F咭. l b) , 细胞收缩变小 , 细胞边缘变得模糊不
齐 , 荧光呈无规则分布 , 显示细胞发生严重损伤 。 若在光照前加人脂 自由基清除剂 iVt (E if g . 1c),
细胞形态接近正常 , 细胞损伤得以保护 , 进一步说明光敏剂引发脂质过氧化及其脂 自由基在
细胞损伤中的作用 。
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州七 仕` u加 tde 俪 ht H A fo r 16 h fo lo 珊习 by
谊成血石0 幻 .
综上所述 , 细胞提取液荧光测定 与高灵敏度图象荧光显微镜直接观察都表明 H A 被体外
培养 H e L a 细胞摄取后 , 主要富集于细胞膜及胞浆中 , iV t E 抗 氧化剂的保护作用研究进一步
证明细胞膜是光敏损伤的主要靶部位 。 在光敏化过程 中 , 脂质过氧化反应产生多种 自由基和
非 自由基产物 , 特别是脂 自由基可能通过直接作用和间接作用机制引起 D N A 等生物大分子
的损伤 , 可能是最终导致细胞死亡重要 因素之一 。 细胞吸收动态过程研究表明 , 细胞对 H A 摄
取量在 16 小时后已达饱和 , 并具有代谢快的特点 , 与目前常用的光敏剂血叶琳衍生物相 比 ,表
明 H A 具有较低的细胞毒性 。 但 H A 是脂溶性药物 , 如制备成合适的剂型 , 将具有适应临床的
潜力 。
2砧 生 物 物 理 学 报 1卯 5年
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本文于 1创科 年 9月 27 日收到 。