全 文 ：生物物理学报 第十卷 第四期
A C T A B 10 P H I S IC A S IN IC A
1望玛年 1 2月
V . d 10 N o
.
D 4伙 . 1哭川
竹红菌乙素澳化物对 H 亡L a细胞形态结构的光敏损伤 *
庞素珍 秦静芬
( 中国科学院生物物理研究所
安静仪
( 中国科学院感光化学研究所
乐加 昌
北京 l的 10 1)
北京 l( ) X 10 1)
摘 要
以 离体培养的 H eL a细胞为材料 , 用激光共聚焦显微镜 , 多动能 图像分析仪 , 扫描电镜 , 透射 电
镜 , 荧光分光光度计等研究了一种新型 的竹红菌乙素修饰物 (5 一 B r 一 H B )被 H e La 细胞摄取的 时间进
程 、 药物在细胞内的显微定位以及对细胞形态结构的光动力损伤 。 结果表明 : eH U 细胞对 5一 Br 一 H B
摄取在 1小时之 内细胞 内药物 浓度随着药液培养时间的增加呈 线性增长 , 3小时后摄取基本达到饱
和 。 H e La 细胞在含 10声anO I压 5 一 Br 一 I J B培养基中37 ℃ 温育半小 时后
,敏化剂主要分布在细胞膜和
胞桨 中。 受光动 力损 伤 的细胞膜丧失连续结构 , 绒毛丧失 , 细胞表面 出现异形突起 。 加药并光照 5
分钟组细胞菜内产生大量空泡 , 线粒体 、 内质网等细胞器丧失结构完整性 , 在较高浓度下甚至 出现明
显的细胞膜破裂和核膜损伤 。 光动 力敏化对核形态产生明显 的损伤作用 , 表现为 N C/ 和N A减小 ,
N F F
, 增大 。
关键词 : 竹红菌乙素澳化物 eH加 细胞 形 态结构 光敏损伤
目前 , 寻找和研究新型的光敏剂 , 以期提高肿瘤光动力治疗效果 , 是 国内外光化学家和光
生物学家为之努力的一个主要 目标 , 而通过结构修饰或人工合成具备较高的消光系数 , 吸收
光谱红移和高 `O : 量子产额的新型光敏剂又是主要的研究方向 。 竹红菌素是我 国学者首先发
现的一种势酿类光敏剂 , 程龙生等 l[,q 就竹红菌甲素 (H A )对红细胞膜和完整红细胞的光敏损
伤进行 了较详细的研究 。 · 近年我们实验室以腹水肝癌细胞和完整红细胞为材料对竹红菌乙素
( H )B 光 敏 损伤性 质 方 面 也 作 了较 为 系统 的研究 。 实 验 证 明 HB 光 敏 损 伤引 起 膜 上
aN
十 贾 K + A Tp 酶活性和 aN + 大 + 离子通透性改变 l3,N , 同时也观察到 鼠腹水肝癌细胞游离钙浓
度升高与细胞存活率下降有相关的联系阎 , 对线粒体功能也有明显损伤 。 虽然 H A ,H B 有一定
光敏效果 ,但仍存在某些缺点 (如在 60( 厄m 以上没吸收峰 ,难溶于水等 ) 。 近年来 ,感光化学所蒋
丽金组 为克服 上述不 足 , 完 成 了一系列竹 红菌 素修饰物 的合成 16 一勿。 竹红 菌乙 素嗅 化 物
( 5 一 B r 一 H B )就是其中之一 。 对 5 一 Br 一 H B 的光化学性质研究表明 I叹该修饰物的最大吸收波
长 比 H B 红移 , 消光系数较大 , `O : 量子产率远大于 H B , 生成 5 一 Br 一 H B 二 能力也比 H B 强 。 因
此 , 对其光生物特性进行研究有着重要的意义 。
本文以离体培养的 eH aL 细胞为材料 , 用多种先进 的技术手段 (激光共聚焦显微镜 , 多功能
图象分析仪 , 扫描电镜 , 透射电镜 , 荧光分光光度计等 )研究了一种新型的竹红菌乙 素修饰物
( 5 一 Br 一 H )B 被 eH aL 细胞摄 取 的 时间 进 程 , 药物 在 细 胞 内的显微 定位 , 着重 地研究 了
5一 B r 一 H B 光敏损伤引起 eH肠 细胞形态结构的光动力损伤 。 到 目前为止 , 还未见系统的形态
* 国家自然科学基金支持课题 。
生 物 物 理 学 报 1望) 4年
结构光敏损伤的报道 。
材料和方法
1
、 药物 :
5 一 B r 一 H B 由中国科学院感光化学研究所安静仪等合成 。 敏化剂首先按 Z X I O一 3m o l瓜 的
浓度配制在二 甲基亚矾 (D M S O )中 , 经微孔过滤灭菌 , 保存于冰箱 中 , 使用 时用无血 清培养基
稀释到所需浓度 。
2
、 细胞培养 :
以离体培养的 H e aL 细胞为材料 , 采用常规的培养方法 。 培养基为 D M EM (s lg r 皿 公司 )和
GI B C O CO
Z
i n d e P en d en t m de ium
3户实验方法 :
( l) H e肠 细胞对光敏剂摄取的时间进程 : 首先按 1 X 10 6细胞 /瓶接种在 25 而 培养瓶 内 , 当
细胞处于指数生长期 时加人 I X I O - smo l瓜 的 5 一Br 一 H B , 37 ℃ 培 养箱 中分别培 养 10 分 , 30
分 , l h, h3 ,6 h和 24 h , 在规定的时间取出细胞 , 用 P B S 洗去药液并制备细胞悬液 , 在 日立 850 荧
光分光光度计测荧光发 射强度 。 xE = 4 8 n 丁n , E m 二 62 0n m 。 每个 数据点代表 3 个样 品平 均
值 , 误差是 S D , 没标误差棒的点其值小于符号 。
( 2) 药物在细胞内的显微定位系采用德国产 的激光扫描共聚焦显微镜 (比M 一 10 型 )进行
观察摄像 。 首先将细胞培养在放有盖玻片的培养皿中 , 用无需 C O : 的 D M EM 培养 , 当细胞处
于指数生长期时倒掉培养基 , 用 P B S 洗一遍 , 然后加人 1 x 10 一 smo l瓜 的 5 一 Br 一 H B ,37 ℃ 温育
半小时 , 再用 P B S 洗三遍以去除 残存药 液 , 在 比 M 显 微镜 下观察细胞 内 由敏 化剂 产生 的
荧光 。
( 3) 细 胞 形 态 特 征 是 通 过 多 功 能 图 象 分 析 仪 ( L E仃Z M P V 一 T AS P L U S M U L -
n 一 F U N C T IO N IM A G E A N A L Y SES
,
WE S T G E R M A刊Y L E IT Z L T D ) 进行观察 , 细胞培
养在盖玻片上 , 经药物和光照处理后 , 再加上培养基 37 ℃ 培养 24 h , 吸掉培养基 , 用 P B S 洗两
遍后经苏木精 一 伊红染色 , 在多功能图像分析仪上测细胞核质 比 (N /C ) , 核面积 (N A )和核形
态 因子 (Nu d e us F o mr F a cot )r
。
(4) 用 EJ X 一 IOOX 透射 电镜和 SJ M 一 3 45 C F 扫描电镜观察细胞膜表面和细胞 内显微结构
变化 , 电镜样品按常规方法制备 。
4
、 光源为自制的卤钨灯 , 辐射强度为 25 W lm Z。
结果和讨论
一 、 H e L a 细胞对 5 一 Br 一 H B 摄取的时间进程
图 1给出的是用含有 10 1肛 10 1瓜 的 5一 Br 一 H B 的培养基培养不 同时间 , H e L a 细胞摄取药
物后的荧光强度随加药时间变化曲线 。 从图可以看出 , 在 1小时之内随着药物培养时间的增
加 , 细胞内药物浓度呈线性增长 , 3 小时后药物的摄取基本达到饱和 。
二 、 5 一 Br 一 H B 在 H e L a 细胞内的显微定位
图 2 是用 LS M 一 10 激光共聚焦显微镜观察到的 5一 B r 一 H B 被细胞摄取后 , 细胞 内分布


第 4 期 竹红菌 乙素澳化物对 H eL a 细胞形态结构的光敏损伤
间增加而上升 , 5一 B r 一 H B 对 H e aL 细胞的光敏杀伤作用大于 H B (另文发表 ) 。 说明该药物 的
光动力作用影响到核和生命的关键部位 。 从以前我们对光敏损伤机制的探讨中已经证明 : 竹
红菌甲素和乙素光敏产生多种活性氧 自由基和敏化剂负离子 自由基 , 姜颖等网用 ES R 测定结
果也表明 5一 Br 一 H B 光敏反应过程中和 H B 一样均产生 ’ 0 2, 0 2几O H ’ 和 5 一 B r 一 H B元且 `O : 相
对量子产率远大于 H B 。 但活性氧 自由基的寿命很短 , 在细胞内达到的距离也不可能长 , 因此
推论很可能是 由自由基引起生物分子的一系列继发反应产物调控整个细胞功能 , 使损伤不局
限于膜和胞浆 , 继而造成核损伤 , 深人的反应机理有待进一步探讨 。
20l0
n一、é月一吕JOó名日二Z
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
N F F N F F N F F
瑰 . 6 11咒 ha ot g 旧 n 签 of n u c】eus fo mr af c to r by 止以 lg e a n a l犷配 r . a . co n tor l b . 2 而 n u t巴 泊么 din沈d
戊儿 c . 5 m in u比 止m d ia tde c ls . Th e e x te nr al eC l t il a r co ll ce n加it o n of s 一 Br 一 H B aws s娜 nO呱 .以h e r co n d iit o ns is 此 ~ as in F
】
ig此 .5
参考文献
程龙生 , 王家珍 : 实验生物学报 , 19 85 , 18 ( :1) 89 一 97 .
郑建华 , 程龙生 : 实验生物学报 , 19 86 , 19( :4) 4 5一 4 5 .
孙继 山 , 庞素珍等 : 实验生物学报 , 19 1 , 24 ; 223 一 228 .
庞素珍 , 陈云俊 , 乐加昌等 : 波谱学杂志 , 19 3 , 1仪:3) 2 67 一 2 73
乐加 昌 , 庞素珍 , 张莉 : 实验生物学报 , 19 3 , 2《 3) : 23 一 237 .
姜颖 , 安静仪 , 蒋丽金 : 科学通报 , 1卯3 , 3城:9) 797 一 81洲) ,
叭 一 Z he n H u , iJ ng 一肠 A刀 a n d L i一 iJ n J ian g : J hP o t o hc 翻 . hP o t o b io l. B : B i o l . , l卯3 , 17 : 19 5一 20 1 .
砚 一 Z h e 们 H u , iJ ng 一肠 A l l a nd L i 一 iJ n iJ a n g J hP 口 t o hc 酬 . hP o t o b iol . A : hc 洲 , 19 3 , 7:0 30 1一 30 8
夏万林 , 张曼华 , 蒋丽金 : 有机化学 , 1卯2 , :12 61 8 一 6 23 .
665 生 物 物 理 学 报 1如4年
D 川竹A G E T O M O RPH O L O G Y O F H下 I A C F l l 只 B Y
B RO M DOE O F H Y P OC E RL L L呵 侧5 一 Br 一 H B )
P a n g S场山ne Q毗 」泊沙们 Y ue J盆I cha n g
(加艺葱。戒之c of B 交训D ,流 s , A a习劝刀妇 S理川 a 理, 及叮呷 , 1田 101 )
A l l 」in颤 `
(五巧找之之越己 of P j刃众犷喇此 c儿曰” 台￡叮、 A c因h ” 必 5动沈“ , 倒 U够, 1田 101 )
AE S T R A C T
aL s er oC
n fo ca l M icro
sco P e
,
M ul t i 一 F u n ct io n l r 口 g e A n a ly戮 , SE M , T EM a dn
lF uo 璐 Ce n c e S P。沈or Ph o t o lne t yr et a l we er us 时 ot s tdu y t h e t ime co 明 e o f u P at k e o f a n e w
yt P e d ier va t ive o f H y P
o a 吧 l i n (5一 B r 一 H B ) b y H e aL 代 15 i n v it or
.
hT
e fl u o esr cen ce l
o ca tio n o f
5一 B r ` H B in 此 115 a s 认℃11 a s Ph o 份 d yn a而 c d a anr g e ot 优 l ul a r mo 中 h o l o g y we er o b s e vr de .
hT
e
esr ul st s ho w de ht a t t h e
u P at k e o f s 一 B r 一 H B b y H e aL eC ls aw s lin 服 ir y i n c 代么 s拟1 Wh il e
~
ign
o f t ln 记 d而 n g the fus t l h o ur a n d aw s s a t二初 a ft e r 3 h o二 . hT e fl u o esr cen ce l o -
ca it o n o f s 一 B r 一 H B aw s in n r m b ar ne a n d yCt o Pal s m hw en H e加 代Us w e r e cul t u r de in 皿-
d iu m co n at in ign 10
12 r lo l压 5一 B r 一 H B a t 3 7 oC fo r 30 而 n u此 . hT e eC l s u afr ce d u e t o
P h o ot d yn
a而 c d a h五t g e h a ve lo s t co n t in u o us s utr ct uer , t h e 而cor v hl o n ht e ce ls d is a P P ae l℃d
a n d u n n a t t lar l j
u t tes a P Pae der
.
A ft e r 5
imn
u此 沮
~
a t io n i n t h e P璐 en ce o f s 一 B r 一 H B , rU P -
t毗 o f Pal s而 e ner m bar n e a dn a g aer t dae l o f 唱 ie】巴 in yCt o P l a sm a P P份l .de , i n at ct s t ur ct u e
o f 而ot ch o n d ir a a n d en d o P la s而 c r eC ticul us wer d es otr y de
a n d ht e n cul
e ic 订le m b ar n es we er a l
-
50 d a anr g de
.
P h o ot d邓 a而 e d a am g e o b v i o us ly 阁 u a 沉I N /C a dn N A a n d i n~ sde N l干F
.
K e y W
o川 5 B or 而d e o f h y P o cr e l i n B H e aL eC l ls M o pr h o lo g y
P h o t o s ens i
t访n g d a am g e
本文 于 19 4 年 6 月 23 日收到