全 文 ：基金项目:中国人民解放军 “九五 ”军队医药卫生科研基金(96M028);全军 “九五 ”医学科研规划第二批科研基金(98M034);广东省中医药管理局科研基金(98483);广州市科技计划项目基金(2004Z3-E4131);广东省高等学校中药有效性与安全性重点实验室开放基金(Kf07004)作者简介:于占洋 ,男 ,副主任药师 ,从事药物研究;E-mail:yuzhy@mail.sysu.edu.cn。＊通讯作者:陈汝筑 , 男 ,教授 , Tel:020-87330561, E-mail:crz@mail.sysu.edu.cn;林永成 , 男 ,教授 , Tel:020-84113356, E-mail:ceslyc@mail.sysu.edu.cn。
茅莓根中对多巴胺神经元保护作用
成分的分离鉴定研究
于占洋 1 ,阮浩澜2 ,朱小南 2 ,汪雪兰 2 ,陈汝筑2＊ ,林永成 1＊
(1.中山大学化学与化学工程学院 ,广东广州 510275;2.中山大学中山医学院药理教研室 ,广东广州 ,
510080)
　　摘要　目的:从茅莓根中分离鉴定出具有保护多巴胺能神经元作用的甜叶苷 R1(SuavissimosideR1)。 方法:
用 1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)处理的小鼠帕金森病模型检测从茅莓根中提取出的粗提物以及二次
提取物(精提物)的保护作用 , 然后在此基础上对精提物进行分离纯化 , 最后分离出白色针状结晶性成分 , 根据化合
物的理化常数测定和用红外光谱数据分析鉴定该成分结构为甜叶苷 R1。以 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理
的大鼠中脑多巴胺能神经元为模型 ,检测了甜叶苷 R1对多巴胺能神经元的保护作用。结果:分离得到甜叶苷 R1。
甜叶苷 R1浓度在 100 μmol/L时 ,对 MPP+处理的多巴胺能神经元有明显的保护作用。结论:甜叶苷 R1对多巴胺
能神经元有保护作用。
关键词　茅莓;甜叶苷 R1;多巴胺能神经元;帕金森病
中图分类号:R285.5/R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)04-0554-04
IsolationandIdentificationofSuavissimosideR1 fromRootsofRubusparvifolus
UsedforProtectingDopaminergicNeuronsagainstMPP+ Toxicity
YUZhan-yang1 , RUANHao-lan2 , ZHUXiao-nan2 , WANGXue-lan2 , CHENRu-zhu2 , LINYong-cheng1
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering, SunYat-senUniversity, Guangzhou510275, China;2.DepartmentofPharmacolo-
gy, ZhongshanSchoolofMedicine, SunYat-senUniversity, Guangzhou510080, China)
Abstract　Objective:SuavissimosideR1 wasisolatedandidentifiedasanactiveingredientfromRootsofRubusparvifolusL.,
whichexhibitedprotectiveefectondopaminergicneuronsagainstMPP+toxicity.Methods:Theprotectiveefectsofcrudeextractswere
investigatedaftermiceweretreatedwith1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine(MPTP).Accordingtotheprotectiveefectsof
crudeextracts, suavissimosideR1, onekindoftriterpenoidsaponin, wasseparated.ItwasinvestigatedthatwhetherSuavissimosideR1
canprotectDAneuronsfromtoxicityinducedbyMPP+inratmesencephaliccultures.Results:SuavissimosideR1 wasisolatedfrom
RootsofRubusparvifolusL..Moreover, SuavissimosideR1, indoseof100μmol/L, aleviatedthedeathofDAneuronsinducedby
MPP+obviously.Conclusion:TheseresultssuggestthatsuavissimosideR1 possessespotentneuroprotectiveactivityandcanbedevel-
opedtobeapotentialanti-Parkinsonsdiseasedrugworthyforfurtherstudy.
Keywords　RubusparvifolusL.;SuavissimosideR1;Dopaminergicneurons;Parkinson sdisease
　　蔷薇科植物茅莓(RubusparvifolusL.)民间全
株入药 ,具有清热解毒 , 消肿定痛 , 止血活血等功
效 〔1〕。民间发现茅莓根的酒浸剂可减轻帕金森病
(PD)患者的症状 。本文为证实茅莓的这种效应 ,利
用 PD小鼠模型 ,从其粗提物和精提物中逐步分离
纯化筛选出一种具有抗 PD的有效成分。经多种色
谱技术和红外光 、谱紫外光谱 、超导核磁共振等技术
鉴定该有效成分为甜叶苷 R1,并检测出甜叶苷 R1
具有保护多巴胺(DA)能神经元作用 。
1 　材料和方法
1.1 　动物与试剂　12周龄 C57BL/6J雄性小鼠和
孕 14 d的 SD大鼠由中山大学药学院实验动物中心
提供 。原植物经第二军医大学药学院郑汉臣教授鉴
定为茅莓 RubusparvifolusL.的干燥根 。 DMEM/
F12粉 、胎牛血清 、青 /链霉素均为 Gibco产品;其余
细胞培养试剂以及 MPTP和 MPP+等均购自 Sigma。
在细胞实验中 ,甜叶苷 R1用 DMSO溶解 ,培养液稀
释 , DMSO终浓度为 0.1%。特异性抗酪氨酸羟化酶
(TH)抗体 ,购自 Chemicon;驴抗小鼠(cy3标记)的
荧光二抗购自 Jackson公司 。
1.2　提取与分离　取茅莓根的干燥粉末 10 kg,
95%乙醇浸泡提取多次后 ,提取液回收乙醇(粗提
·554· 中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 4期 2008年 4月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.04.026
物)。残渣用石油醚去除脂溶性成分(精提物 Ⅰ )后
悬浮于水中 ,用乙酸乙酯萃取 ,回收乙酸乙酯得到棕
色粉末状物质(精提物 Ⅱ),不溶于乙酸乙酯的部分
用甲醇萃取 , 回收甲醇后得淡棕色物质 (精提物
Ⅲ)。
用 MPTP小鼠模型筛选测试精提物 Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ ,
发现精提物 Ⅱ具有升高 MPTP模型鼠纹状体 DA的
作用 ,精提物 Ⅰ 、Ⅲ作用不明显 。将精提物 Ⅱ滴加于
硅胶中 ,晾干。经反复硅胶析柱层析 ,用石油醚 、乙
酸乙酯梯度洗脱等方法 ,进一步分离出不同组分 。
用 MPP+处理原代培养大鼠中脑 DA能神经元为模
型进行筛选 ,阳性者进一步纯化 ,最后分离出一种白
色针状结晶性成分(化合物 Ⅰ )。该成分易溶于甲
醇 、乙醇 、碱性水溶液 、乙酸乙酯 、丙酮等溶剂 ,微溶
于水 ,不溶于氯仿 、石油醚 、乙醚 、二氯甲烷等溶剂 。
该提取方法得率约 0.1%,该成分遇香蓝醛浓硫酸
液加热变蓝色。
1.3 　茅莓粗提物对 MPTP降低小鼠纹状体 DA作
用的影响　C57BL/6J雄性小鼠分为对照组 、模型组
和茅莓粗提物组 。模型组和粗提物组用 MPTP腹腔
注射 , 20mg/kg, 2次 /d,连续注射 4 d。对照组给予
等量生理盐水注射。注射后第 4d,粗提物组给予茅
莓粗提物灌胃 ,剂量分别为 3.2、16 mg/kg, 2次 / d,
连续 18d。对照组和模型组用与粗提物同体积生理
盐水。第 19 d取脑 ,分离出双侧纹状体 ,称重 。用
荧光法 〔2〕测定并计算出纹状体 DA含量。
1.4 　茅莓精提物对 MPTP降低小鼠纹状体 DA作
用的影响　在粗提物的研究结果上 ,提取出三个精
提物组分(精提物 Ⅰ 、Ⅱ和 Ⅲ)。分别给模型组和精
提物Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ组小鼠 MPTP腹腔注射 ,剂量同前 。
MPTP注射第 5 d,给药组分别给予精提物 Ⅰ 、Ⅱ和
Ⅲ灌胃 ,剂量分别为 15、10、2 mg/kg, 2次 /d,连续
灌胃 18 d。第 19d取纹状体测 DA含量。
1.5 　大鼠中脑腹侧黑质 DA神经元培养　取孕 14
d的胎鼠 ,按文献方法 〔3〕进行操作。将细胞悬液以
5×105个 /ml接种到预先用 50 μg/ml多聚赖氨酸
包被的 24孔板内 。培养基为含青 /链霉素和 15%
胎牛血清的 DMEM/F12。在 37℃、5%CO2孵箱内
培养 , 24 h后在培养液内加入 10μmol/L阿糖胞苷
抑制胶质细胞生长。每 3d换一半培养液。
1.6 　神经细胞形态学观察与神经元存活率测定　
细胞培养的第 5d,以 1、10、100、300 μmol/L的甜叶
苷 R1预孵细胞 。 2 h后在模型组和给药组中加入
10 μmol/L的 MPP+。 48h后参照文献〔3〕进行 TH免
疫组化荧光染色 。将胞体饱满 ,至少有一个突触 ,突
触长度是胞体直径两倍的细胞定义为存活细胞 〔4〕。
保护作用以存活率表示:
存活率 =各处理组存活细胞总数对照组存活细胞总数 ×100%。
1.7　统计学处理　数据均以 x±s表示 ,用 SPSS
11.0软件进行 One-WayANOVA统计分析 , P<0.05
为有统计学意义。
2　结果
2.1　结构鉴定　从精提物Ⅱ提取分离出的化合物
Ⅰ白色针状结晶 , mp247.4 ～ 248.8℃, [ α] +20.0D =
0.036°。可溶于甲醇和乙醇 ,微溶于乙酸乙酯 ,不溶
于石油醚 。
FABMS(m/z):519, 501, 473 , 455, 437, 409,
391, 375, 279 , 277, 255 , 239 , 201, 185, 159, 131, 119,
93, 57 。
元素 分析 实 测 值 (计 算 值 ):C 60.25%
(60.30%), H8.40%(8.44%)。
1H-NMR(DMSO-d6):δ1.98(4.5Hz, 12.5Hz),
3.63(dd, 10Hz, 4.5Hz), 3.73(d, 10Hz), 1.62,
1.73 (13Hz, 3.5Hz), 1.28 (m), 1.85 (8Hz,
12.5Hz), 2.03(9.5Hz, 3.5Hz), 5.33(dd, 13.5Hz,
3.5Hz), 0.98(4Hz, 11.5Hz), 1.14, 1.62(4 Hz, 9
Hz), 2.52, 1.35(m), 1.26(8.8Hz), 1.65(m),
1.11(s), 0.76(s), 1.04, 0.77, 1.34(s), 0.93(d,
6.5Hz), 1.20 (s), 5.32 (d, 8Hz), 3.28 (dd,
13.5Hz, 3.5Hz), 3.38(dd, 2.5Hz, 12Hz), 3.34,
3.345 (d, 3.5Hz), 3.67 (12Hz, 4.5Hz), 3.79
(12Hz, 2Hz)。
13C-NMR(DMSO-d6):48.3(C-1), 69.3(C-2),
81(C-3), 55.1(C-4), 52.7(C-5), 38.2(C-6),
33.7(C-7), 41.3(C-8), 48.8(C-9), 39.2(C-10),
24.8(C-11), 129.3(C-12), 139.7(C-13), 42.7(C-
14), 29.6(C-15), 21.8(C-16), 49.3(C-17), 54.9
(C-18), 73.6(C-19), 42.9(C-20), 27.2(C-21),
26.5(C-22), 180.7(C-23), 12.8(C-24), 17.7(C-
25), 17.5(C-26), 24.7(C-27), 178.5(C-28), 16.6
(C-29), 27.1(C-30), 95.7(C-1′), 73.8(C-2′),
78.3(C-3′), 71.2(C-4′), 78.5(C-5′), 62.5(C-6′)。
IR(KBr)cm-1:3414.69, 2928.52, 1727.35,
1458.25, 1390.07, 1260.38, 1075.97, 896.61,
771.44, 680.19。
UV(CH3OH)λmax:213nm, Abs2.8395。
最终确定化合物 Ⅰ为甜叶苷 R1,其分子式为
C36H56 O12 · 2H2O,分子量为 716。与文献报道一
致〔5、6、9〕。
·555·中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 4期 2008年 4月
2.2 　茅莓粗提物对 MPTP降低小鼠纹状体 DA作
用的影响　给予茅莓粗提物处理的 PD小鼠能拮抗
MPTP导致的小鼠纹状体 DA含量的下降 。结果见
表 1。
　表 1　　　　茅莓粗提物对 MPTP降低小鼠
纹状体 DA作用的影响( x±s)
分组
剂量(mg/kg)
MPTP 茅莓粗提物
动物数(只) 多巴胺含量(μg/g) 百分率(%)
Vehicle - - 9 16.9±5.5 100
MPTP 20 - 8 4.7±3.6＊＊ 27.8＊＊
茅莓粗提物 1 20 3.2 8 10.8±4.8＊ 63.4＊
茅莓粗提物 2 20 16 8 12.0±7.8＊ 71＊
　注:与 MPTP模型组比较 , ＊P<0.05;与对照组比较 , ＊＊P<0.01
2.3 　茅莓精提物对 MPTP降低小鼠纹状体 DA作
用的影响　给予茅莓精提物 Ⅱ处理的 PD小鼠能拮
抗 MPTP导致的小鼠纹状体 DA含量的下降 。精提
物 Ⅰ 、Ⅲ对 DA含量无明显影响 。结果见表 2。
　表 2　　　　茅莓精提物对 MPTP降低小鼠
纹状体 DA作用的影响( x±s)
分组
剂量(mg/kg)
MPTP 茅莓粗提物
动物数(只) 多巴胺含量(μg/g) 百分率(%)
Vehicle - - 10 24.9±12.1 100
MPTP 20 - 11 9.9±7.2■■ 39.8■■
茅莓精提物 Ⅰ 20 15 7 11.1±4.2 44.6
茅莓精提物 Ⅱ 20 10 8 25.1±6.8＊＊ 100.8＊＊
茅莓精提物 Ⅲ 20 2 8 13.6±8.3 54.6
　　注:与 MPTP模型组比较 , ＊＊P<0.01;与对照组比较 , ■■P<
0.01
2.4　甜叶苷 R1在 MPP+诱导体外培养的大鼠中
脑腹侧 DA能神经元凋亡中的保护作用　TH阳性
细胞形态改变见图 1(A)。相对于对照组 , 给予
MPP+作用 48 h后 ,细胞突触数目和长度明显减少 ,
部分呈串珠样膨胀 。 MPP+处理前给予 100 μmol/L
甜叶苷 R1预孵 ,上述形态改变不明显 ,比较接近正
常 TH阳性细胞形态 。对存活细胞计数后 ,图 1
(B),发现用 MPP+处理后 TH阳性细胞存活率只有
正常对照组的 57.8%,用甜叶苷 R1预处理后 , 100
μmol/L组甜叶苷 R1与 MPP+组有明显的统计学差
异 ,存活率为 80.2%。提示在一定剂量范围内 ,甜
叶苷 R1可减少 MPP+对 DA能神经元的毒性效应 。
3　讨论
DA能神经元凋亡及纹状体 DA含量下降是 PD
发病机制之一 〔7〕。甜叶苷 R1最早是从蔷薇科植物
甜茶中分离出来〔6〕 ,国内已有从茅莓根中提取出甜
叶苷 R1的报道 〔8、9〕 ,但尚未见甜叶苷 R1具有 DA
能神经元保护作用和用于 PD治疗的研究。
在茅莓粗提物的研究上观察到其可拮抗 MPTP
导致的小鼠纹状体 DA含量降低 。再从粗提物继续
进行层析分离和鉴定 ,取得三个组分:精提物 Ⅰ溶于
水;精提物 Ⅱ难溶于水及有机溶剂;精提物 Ⅲ量稀
少 ,可溶于有机溶剂 。实验结果显示 ,茅莓精提物 Ⅰ
和Ⅲ对 MPTP处理小鼠纹状体 DA含量无明显升高
作用 ,而精提物 Ⅱ能明显升高MPTP处理小鼠纹状
(A) (B)
图 1　甜叶苷 R1对 MPP+损伤的体
外培养多巴胺能神经元的影响
(A)甜叶苷 R1改善了 MPP+导致的多巴胺能神经元形态
改变(200 ×)　A.对照组　B.MPP+模型组　C.甜叶苷
R1 100μmol/L
(B)甜叶苷 R1抑制了 MPP+导致的多巴胺能神经元的死
亡。与对照组比较 , ＊＊P<0.01;与 MPP+模型组比较 , ■■P
<0.01。 n=3
·556· 中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 4期 2008年 4月
体 DA含量 ,提示精提物 Ⅱ中存在可以拮抗 MPTP
对 DA能神经元的毒性效应以及升高纹状体 DA含
量的有效成分。通过对精提物 Ⅱ进一步的分离提纯
和验证 , 最终确定该有效成分是甜叶苷 R1。用
MPP+诱导体外培养的大鼠中脑腹侧 DA能神经元
凋亡模型检验甜叶苷 R1的作用 ,结果表明甜叶苷
R1能明显拮抗 MPP+毒性 ,减少 DA能神经元死亡 ,
这与粗提物和精提物 Ⅱ的实验结果意义相一致 。有
关甜叶苷 R1的药效及作用机制仍需进一步研究 。
参 考 文 献
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中国天然药物 , 2005, 3(1):17-20.
(2007-08-07收稿)
昆明山海棠片对小鼠淋巴细胞体外增殖活化影响的研究
徐　艳 1 ,郑永唐 2 , 何　黎 1 ,万　屏 1＊ ,农　祥1
(1.昆明医学院第一附属医院皮肤科 ,云南昆明 650032;2.中国科学院昆明动物研究所 ,云南昆明 650223)
　　摘要　目的:研究昆明山海棠片对小鼠脾淋巴细胞增殖 、活化标志 CD69和 CD25及细胞因子 IL-4及 IFN-γ的
影响。方法:无菌分离小鼠脾淋巴细胞 ,加入不同浓度的昆明山海棠溶液 , MTT法检测刀豆蛋白 A刺激的小鼠脾淋
巴细胞增殖;流式细胞仪检测活化标志 CD69及 CD25;酶联免疫法检测细胞因子 IL-4及 IFN-γ。 结果:昆明山海棠
片对脾淋巴细胞增殖活化及分泌均有抑制作用。
关键词　昆明山海棠片;淋巴细胞增殖;淋巴细胞活化;免疫抑制;细胞因子
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编码:1001-4454(2008)04-0557-05
StudyofTripterygiumhypoglaucumHutchonMouse′s
SplenicLymphocyteActivationinvitro
XUYan1 , ZHENGYong-tang2 , HELi1 , WANPing1 , NONGXiang1
(1.DepartmentofDermatology, FirstAffiliatedHospitalofKunmingColege, Kunming650032, China;2.KunmingInstitueofZoolo-
gy, Kunming650223, China)
Abstract　objective:TostudytheeffectsofTripterygiumhypoglaucumHutch(THH)onthemouse′sspleniclymphocyteprolifer-
ation, activationmarksuchasCD69andCD25, cytokinesuchasIL-4andγ-IFN.Methods:Separatingthemouse′sspleniclymphocyte
sterilitilyandaddingTHHofdifferentdensity.TheproliferationoftheConA-stimulatedspleniclymphocytewasmeasuredwithMTT;
theactivationmarkssuchasCD69 andCD25weremeasuredwithflowcytometer;cytokinessuchasIL-4andγ-IFNweremeasuredwith
euzymelinkedimmunosorbentassay.Results:THHhadinhibitoryactiononbothproliferationandactivationofspleniclymphocyte.
KeyWords　TripterygiumhypoglaucumHutch;Lymphocyteproliferation;Lymphocyteactivation;Immunosuppression;Cytokine
基金项目:云南省教育厅资助项目(2003XY09)作者简介:徐艳(1978-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:免疫性皮肤病;Tel:13700664136, E-mail:xuyanfirst@ 163.com。＊通讯作者:万屏(1963-),女 ,教授 ,硕士研究生导师;Tel:13888022103, E-mail:huangyue1994@yahoo.com.cn。
·557·中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 4期 2008年 4月