全 文 ：化学与生物工程 ２０１５，Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１１ ｗｗｗ．ｈｘｙｓｗｇｃ．ｃｏｍ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
３１
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（２０１３Ｃ１１１）
收稿日期：２０１５－０８－０５
作者简介：乐薇（１９７９－），女，湖北沙市人，副教授，研究方向：生物分析，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｗｅｉ１１＠１２６．ｃｏｍ。
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５４２５．２０１５．１１．００９
提取方法对箬叶总黄酮抑菌效果的影响
乐 薇，佘雨珊，吴士筠
（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉４３００６５）
摘 要：通过抑菌圈直径及最低抑菌浓度的测定，分别考察了乙醇浸渍法、热回流法、微波法、超声波法提取的箬叶
总黄酮对细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）、真菌（白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌）的抑菌效果。结果表明，箬叶总黄
酮对细菌的抑制作用大于对真菌的抑制作用；且提取方法对箬叶总黄酮的抑菌能力有影响，不同提取方法提取的箬叶总
黄酮抑菌效果为：超声波法＞热回流法＞乙醇浸渍法＞微波法。超声波法比较适合于箬叶总黄酮的提取。
关键词：提取方法；箬叶；总黄酮；抑菌活性
中图分类号：Ｑ ９４９．９９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２－５４２５（２０１５）１１－００３１－０３
我国箬叶资源丰富但利用率低，目前主要用作食
品包装。黄酮类化合物是植物重要的次级代谢产物，
具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌等多种生理功
能［１－３］。研究表明，总黄酮是箬叶中的重要活性成分，
但目前的研究多限于黄酮的提取与测定［４－７］。
作者通过抑菌圈直径及最低抑菌浓度的测定，分
别考察乙醇浸渍法、热回流法、微波法、超声波法提取
的箬叶总黄酮的抑菌效果，选择提取箬叶总黄酮的最
优方法，以期为提高箬叶的附加值和箬叶总黄酮的开
发利用提供参考。
１ 实验
１．１ 材料、试剂与仪器
箬叶，采于湖北恩施武陵山区。
金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大肠
杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、酿酒酵
母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、白色念珠菌（Ｍｏｎｉｌ－
ｉａａｌｂｉｃａｎ），武汉工商学院生物实验室提供。
芦丁标准品、氨苄青霉素，中国药品生物制品检定所。
ＤＨＰ－９２７２型恒温培养箱、ＨＺＱ－Ｆ１６０型振荡培
养箱，哈尔滨东联生化仪器有限公司；ＹＸＱ－ＬＳ－ＳⅡ型
全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限
公司医疗设备厂；７２２Ｅ型可见分光光度计，上海光谱
仪器有限公司；ＫＱ－１００Ｅ型超声波清洗器，昆山超声
仪器有限公司；Ｍ７００型美的微波炉，广东美的微波炉
制造有限公司。
１．２ 方法
１．２．１ 箬叶总黄酮的提取及纯化
取适量箬叶清洗干净，５０℃烘干后粉碎，过１８目
筛，密封保存。按前期实验获得的优化条件（表１），分
别采用乙醇浸渍法、热回流法、超声波法及微波法提取
箬叶总黄酮，测定提取液中总黄酮含量并计算提取率。
提取液减压浓缩蒸去乙醇，并经 ＡＢ－８型大孔树脂吸
附饱和，用７５％乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩成
浸膏，用适量７５％乙醇溶解，使各种提取法所得总黄
酮的浓度尽可能一致，即得箬叶总黄酮样品液。
表１ ４种提取方法的优化条件
Ｔａｂ．１ Ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
提取方法 提取溶剂
料液比
ｇ∶ｍＬ
提取时间
ｍｉｎ
提取温度
℃
乙醇浸渍法 ７５％乙醇 １∶２０ ６０ ６０
热回流法 ７５％乙醇 １∶２０ ６０ ８５
超声波法 ７５％乙醇 １∶３０ ４０ －
微波法 ７５％乙醇 １∶２５ ２ （大火）
１．２．２ 箬叶总黄酮提取率的测定
准确称取芦丁标准品１５ｍｇ溶于３０％乙醇，定容
至１００ｍＬ。用移液管分别取一定量的芦丁标准溶液
于１０ｍＬ容量瓶中，加入５％亚硝酸钠溶液０．３ｍＬ，
乐 薇等：提取方法对箬叶总黄酮抑菌效果的影响／２０１５年第１１期３２
混匀，静置６ｍｉｎ后加入１０％硝酸铝溶液０．３ｍＬ，摇
匀，静置６ｍｉｎ后加入４ｍＬ ４％氢氧化钠溶液，以
３０％乙醇定容，摇匀，静置１０ｍｉｎ后在５１０ｎｍ波长处
测定吸光度，参比为不加芦丁标准品的溶液。以吸光
度（Ａ）为纵坐标、芦丁标准溶液浓度（ｃ）为横坐标绘制
标准曲线，拟合得到线性回归方程为Ａ＝０．０１０５ｃ＋
０．００１７，Ｒ２＝０．９９９８。
以箬叶总黄酮提取液代替芦丁标准溶液同法测定
总黄酮浓度，箬叶总黄酮提取率按下式计算：
总黄酮提取率＝ｎ×ｃ×Ｖｍ×１０６ ×１００％
式中：ｃ为总黄酮浓度，μｇ·ｍＬ
－１；ｍ为箬叶粉末
质量，ｇ；Ｖ 为溶液体积，ｍＬ；ｎ为稀释倍数。
１．２．３ 箬叶总黄酮的抑菌实验
１）抑菌圈的测定
将供试菌种分别接种于相应的培养基斜面上，细
菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）于３７℃培养２４ｈ进
行活化，真菌（白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌）于
２８℃培养２４ｈ进行活化。从活化后的斜面上挑取菌
体于相应的液体培养基中，３７℃培养至对数生长期。
分别吸取各对数生长期菌液５００μＬ至一定量的无菌
水中，配制浓度为１×１０６ ＣＦＵ·ｍＬ－１的菌悬液，摇瓶
培养４８ｈ，备用。
将约１５ｍＬ的固体培养基倒入平板（直径９ｃｍ）
中，水平放置，待其凝固后用移液器取０．５ｍＬ菌悬液
注入平板，并用三角棒涂布均匀，每种菌设置３个重复
平板。取灭菌滤纸片（直径６ｍｍ）放入上述各总黄酮
样品液中浸泡２４ｈ，取出贴在含菌平板上，用７５％乙
醇和氨苄青霉素作对 照，每皿贴 ３ 片。细 菌 置
（３７±１）℃培养１８～２４ｈ、真菌置２８℃培养４８ｈ后
观察结果。测定滤纸片的抑菌圈直径，比较抑菌效果。
２）最低抑菌浓度的测定
采用连续稀释法测定最低抑菌浓度。在无菌条件
下，量取一定量箬叶总黄酮提取液，倒入已灭菌的空试
管中，再加入相应的液体培养基，使培养基中箬叶总黄
酮提取液的质量浓度（ｍｇ·ｍＬ－１）分别为２、４、９、２０、
４０，混合均匀，分别接入１００μＬ的菌液后在相应条件
下培养一段时间，观察菌体生长情况。
２ 结果与讨论
２．１ 提取方法对箬叶总黄酮提取率的影响（表２）
表２ 提取方法对箬叶总黄酮提取率的影响
Ｔａｂ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ
ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｏｃｏｌａｍｕｓ ｌｅａｖｅｓ
提取方法 乙醇浸渍法 热回流法 超声波法 微波法
提取率／％ ２．０２ ２．６５ ２．４５ １．８９
由表２可知，热回流法和超声波法的总黄酮提取
率相当，乙醇浸渍法的提取率略低，微波法的提取率最
低。
２．２ 不同提取方法提取的箬叶总黄酮的抑菌效果（表
３）
表３ 不同提取方法提取的箬叶总黄酮的抑菌效果（ｎ＝３）
Ｔａｂ．３ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ ｌｅａｖｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ（ｎ＝３）
供试菌种
抑菌圈直径／ｍｍ
箬叶总黄酮
乙醇浸渍法 热回流法 超声波法 微波法
对照
７５％乙醇 氨苄青霉素
大肠杆菌 ２４．５ ２３．０ ２４．０ ２１．０ １０．０ ３６．５
金黄色葡萄球菌 １７．０ １７．５ １７．５ １５．５ ７．５ ２８．０
白色念珠菌 ７．０ １０．０ ６．５ ８．０ ７．０ ７．０
酿酒酵母菌 １０．５ ７．０ ８．５ １２．０ １３．５ ７．０
青霉菌 ９．０ ６．０ １２．０ ６．０ ８．５ ６．０
由表３可知，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对４种
箬叶总黄酮均较为敏感，酿酒酵母菌对４种箬叶总黄
酮均不敏感，白色念珠菌和青霉菌对４种箬叶总黄酮
部分敏感。其中，大肠杆菌对４种箬叶总黄酮的敏感
程度为：乙醇浸渍法＞超声波法＞热回流法＞微波法；
金黄色葡萄球菌对４种箬叶总黄酮的敏感程度为：超
声波法／热回流法＞乙醇浸渍法＞微波法。超声波法
提取的箬叶总黄酮对青霉菌有一定的抑制作用，热回
流法提取的箬叶总黄酮对白色念珠菌有一定的抑制作
用。表明，箬叶总黄酮对细菌的抑制作用大于对真菌
的抑制作用，且提取方法对箬叶总黄酮的抑菌能力有
影响。这可能是由于不同的提取方法获得的黄酮种类
乐 薇等：提取方法对箬叶总黄酮抑菌效果的影响／２０１５年第１１期 ３３
有差异，但具体原因还有待进一步研究。
２．３ 不同提取方法提取的箬叶总黄酮的最低抑菌浓
度（表４）
表４ 最低抑菌浓度的测定结果
Ｔａｂ．４ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
提取方法
总黄酮浓度
ｍｇ·ｍＬ－１
大肠杆菌
金黄色
葡萄球菌
白色念珠菌 青霉菌
２．２ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
４．４ ＋ ＋ ＋ ＋
乙醇浸渍法 ９．９ ＋ ＋ ＋ ＋
２２．０ ＋ － ＋ ＋
４４．０ － － ＋ ＋
２．３ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
４．６ ＋ ＋ ＋＋ ＋
热回流法 １０．４ ＋ ＋ ＋＋ ＋
２３．１ ＋ ＋ ＋ ＋
４６．２ － － － ＋
１．８ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
３．８ ＋ ＋ ＋＋ ＋
超声波法 ８．７ ＋ ＋ ＋ ＋
１９．８ ＋ ＋ ＋ ＋
３９．９ － － ＋ －
２．４ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
４．８ ＋ ＋ ＋＋ ＋
微波法 １０．８ ＋ ＋ ＋ ＋
２４．０ ＋ ＋ ＋ ＋
４８．０ － － ＋ ＋
注：“＋＋”表示菌体生长旺盛；“＋”表示有菌生长；“－”表示无菌生长。
由表４可知，超声波法提取的箬叶总黄酮对大肠
杆菌、金黄色葡萄球菌和青霉菌的最低抑菌浓度均为
３９．９ｍｇ·ｍＬ－１；热回流法提取的箬叶总黄酮对大肠
杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度
均为４６．２ｍｇ·ｍＬ－１；乙醇浸渍法提取的箬叶总黄酮
对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为２２．０ｍｇ·
ｍＬ－１，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为４４．０ｍｇ·
ｍＬ－１；微波法提取的箬叶总黄酮对大肠杆菌和金黄色
葡萄球菌的最低抑菌浓度均为４８．０ｍｇ·ｍＬ－１。
３ 结论
通过抑菌圈直径及最低抑菌浓度的测定，分别考
察乙醇浸渍法、热回流法、微波法、超声波法提取的箬
叶总黄酮对细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）、真菌
（白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌）的抑菌效果。结果
表明，箬叶总黄酮对细菌的抑制作用大于对真菌的抑
制作用，且提取方法对箬叶总黄酮的抑菌能力有影响，
不同提取方法提取的箬叶总黄酮抑菌效果为：超声波
法＞热回流法＞乙醇浸渍法＞微波法。超声波法比较
适合于箬叶总黄酮的提取。
参考文献：
［１］ 李水芳，文瑞芝，曾栋，等．阔叶箬竹叶和箬竹叶中挥发油的提取
及成分分析［Ｊ］．色谱，２００７，２５（１）：５３－５７．
［２］ 周熠．箬竹叶挥发油的提取、分析及抑菌效果研究［Ｄ］．长沙：湖南
农业大学，２００９．
［３］ 苏春花．箬竹林结构特征及竹叶生物活性成分研究［Ｄ］．南京：南
京林业大学，２０１１．
［４］ 崔健．箬竹属植物黄酮类物质与挥发性成分的研究［Ｄ］．北京：中
国林业科学研究院，２０１１．
［５］ 苏春花，王福升，丁雨龙．长节箬竹叶总黄酮提取工艺［Ｊ］．林业科
技开发，２０１０，２４（５）：８７－９０．
［６］ 龚金炎，吴晓琴，夏道宗，等．ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定竹叶提取物中黄酮
类和酚酸类成分［Ｊ］．中草药，２０１０，４１（１）：６３－６５．
［７］ 李水芳，喻勋林，李姣娟，等．箬叶总黄酮提取方法的研究［Ｊ］．安
徽农业科学，２００７，３５（２０）：６０３２－６０３３，６０３５．
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ Ｌｅａｖｅｓ
ＹＵＥ Ｗｅｉ，ＳＨＥ Ｙｕ－ｓｈａｎ，ＷＵ Ｓｈｉ－ｊｕｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００６５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ａｎｔｉ－
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｏｃａｌａｍｕｓ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｍｍｅｒ－
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