全 文 ： 菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 March 2014, 33(2): 425‐432
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2014 IMCAS, all rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.130291
基金项目：国家食用菌产业技术体系（No. CARS‐24）
*Corresponding author. E‐mail: caiwm527@126.com
收稿日期: 2013‐12‐25, 接受日期: 2014‐01‐16
不同覆土基质微生物结构特征研究及其对双孢蘑菇产量的
影响
冯伟林 金群力 范丽军 刘佳楠 沈颖越 宋婷婷 田芳 蔡为明*
浙江省农业科学院园艺研究所 浙江 杭州 310021
摘 要：覆土是影响双孢蘑菇产量、质量和出菇整齐度的重要因子，利用现代分子生态学的方法快速、准确地对不
同覆土基质微生物结构特征进行检测，以进一步了解微生物群落与双孢蘑菇相互作用关系。测定了不同覆土的理化
特性，应用 PCR 技术对不同覆土材料提取总 DNA，扩增细菌 16S rDNA和真菌 28S rDNA，运用变性梯度凝胶电泳技术
对 PCR 产物进行分析，研究双孢蘑菇不同覆土基质微生物结构特征。结果表明：不同处理的覆土材料微生物群落的
基因具有多样性，其中细菌群落基因多样性存在差异，使用纯泥炭与粉碎稻草处理差异最大，相似性仅为 62%；通
过真菌 28S rDNA变性梯度凝胶电泳结果显示，粉碎稻草处理多样性指数最高，达 3.576，但随着泥炭比例的提高，覆
土处理中真菌群落的多样性相对减少；栽培试验发现，双孢蘑菇子实体形成量、总产量可能与覆土中的真菌群落多
样性呈负相关。
关键词：覆土，微生物群落，16S rDNA，28S rDNA，变性梯度凝胶电泳
Effects of different casing soil on microbial structure characteristics and
yield of Agaricus bisporus
FENG Wei‐Lin JIN Qun‐Li FAN Li‐Jun LIU Jia‐Nan SHEN Ying‐Yue SONG Ting‐Ting TIAN Fang
CAI Wei‐Ming*
Horticulture Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310021, China
Abstract: The casing soil is an important factor to affect Agaricus bisporus yield, quality, and fruiting uniformity. By using
modern molecular ecology rapid and accurate detection of microbial structural characteristics of different casing soils may
further know how the microbial community interacts with mushrooms. Physical and chemical properties of different
overburden material were detected, and the total DNA were extracted. The bacterial 16S rDNA and fungal 28S rDNA were
amplified and analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis to investigate microorganism structural features of
different casing soils. The results showed the different treatment of casing soils had genetic diversity of the microbial
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community. The result of bacterial community analysis showed the greatest difference in genetic diversity between the
pure peat casing soils and soil mixed with crushed straw, and the similarity was only 62%. The fungal 28S rDNA denaturing
gradient gel electrophoresis analysis showed that the diversity index in the casing soil comprising crushed straw was 3.576,
being the highest among all treatments. With the increase of peat proportion in the casing soil, the diversity of fungal
communities relatively reduced. Cultivation experiment showed that the amount of Agaricus bisporus fruiting body
formation and total yield were negatively correlated with the diversity of fungal communities in the casing soil.
Key words: casing soil, microbial community, 16S rDNA, 28S rDNA, denaturing gradient gel electrophoresis
在双孢蘑栽培中，菌丝长满培养料后，必
须覆土才能诱导形成子实体，获得商业性产量。
覆土是影响双孢蘑菇产量、质量和出菇整齐度
的重要因素。尽管覆土的确切作用目前还不十
分清楚，但理想的双孢蘑菇覆土必须具备特殊
的理化特性和微生物特性。已研究明确覆土的
某些理化性状，如空隙度、持水率、盐浓度、
渗透性和 pH 等可以影响双孢蘑菇生长。覆土
是双孢蘑菇生长发育所需水分的重要来源，据
研究，双孢蘑菇子实体生长发育所吸收的水分
54%–83%来自于培养料，17%–46%来自于覆土。
覆土材料是否具备适于双孢蘑菇生长发育的理
化特性，尤其是持水率的高低与双孢蘑菇产量
关系密切。
土壤层微生物群落非常庞大，有着丰富的
物种多样性，传统上研究土壤中的微生物群落
多样性大多是将微生物进行稀释分离培养，通
过染色显微观察或者一般的生物化学性状来展
开分析。近年发展起来的变性梯度凝胶电泳
（ Denaturing gradient gel electrophoresis，
DGGE）技术，在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，
加入了一定含量的变性剂，由于 DNA 在不同浓
度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移
率发生变化，从而可将片段大小相同而碱基组
成不同的 DNA片段分开（Edrick et al. 2000）。
目前 DGGE 技术广泛应用于生物多样性调查、
亲缘关系鉴定、基因突变检测等各种环境微生
物的生态研究中（Holmfeldt et al. 2009；Sanchez
& Royse 2009；杜萍等 2012），如湖泊、海洋、
土壤、发酵和肠道等环境微生物研究中
（Cetecioglu et al. 2009；Ning et al. 2009；Shen
et al. 2010）。双孢蘑菇栽培过程中必须覆土，
不覆土子实体难以形成，目前已有的研究主要
从覆土的物理作用方面入手（Gulser & Peksen
2003；Sanchez & Royse 2009；Sher et al. 2010），
相比之下对微生物的研究较少。微生物是双孢
蘑菇覆土层的重要组成部分，与覆土层的物理
结构、化学物质及双孢蘑菇子实体的生长发育
密切相关。因此，研究双孢蘑菇覆土层微生物
生态群落在双孢蘑菇生产上有重要意义。本研
究在前期研究的基础上，应用 DGGE 方法分析
了扩增产物的 DNA遗传多态性，研究双孢蘑菇
覆土层微生物生态群落结构组成，旨在揭示双
孢蘑菇覆土层微生物生态群落多样性，为进一
步开发利用微生物资源，尤其是对双孢蘑菇覆
土层有益微生物资源利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
按体积比配制 5 种覆土配方：Ⅰ：泥炭
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100%；Ⅱ：泥炭 50%，田土 50%；Ⅲ：泥炭 30%，
田土 70%；Ⅳ：砻糠 15%，田土 85%；Ⅴ：长
度 1cm 以下的粉碎稻草 50%，田土 50%。
1.2 理化性状测定
1.2.1 电导率（EC）和 pH值测定：以干样品和
蒸馏水重量比为 1:5，配制样品悬浮液，放置
1h后，用电导率仪和 pH计测定 EC值和 pH值。
1.2.2 空隙率和持水率测定：参照蔡为明等
（2008）的方法进行测定。
1.2.3 饱和容重测定：用测试筒及延长颈圈中
装满干样品，浸水过夜，取出沥水 1h，然后去
掉延长颈圈及多余的样品，使样品与测试筒口
齐平，称量总重（WT）和测试筒自重（Wc），
饱和容重为每升容器中样品的重量。
1.3 土壤全基因组提取方法
0.5g土壤加 2mL DNA 提取液，使用上海生
工生物工程技术有限公司UNIQ‐10柱式DNA胶
回收试剂盒进行提纯，加入 50μL TE 溶解。在
0.8%的琼脂糖凝胶中对获得的总 DNA 进行电
泳，以检测是否得到较为完整的总 DNA。
1.4 16S rDNA可变区的 PCR 扩增
以 DNA基因组作为模板，对 16S rDNA V3
可变区进行 PCR 扩增。扩增引物为通用的 F338
和 R518，其中正向引物 5′端连接有 GC 夹板，
以提高在后期 DGGE 电泳时的解链范围。引物
的序列分别为 F338：5′‐CGCCCGCCGCGCGCGGCG
GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGC
AGCAG‐3′；R518：5′‐ATTACCGCGGCTGCTGG‐3′。
扩增反应体系 50μL：5μL 10×PCR buffer，5μL
dNTP（2.0mmol/L），1μL引物（25μmol/L），1μL
Taq DNA 聚合酶（5U/μL），1μL 模板，ddH2O 补
足。扩增反应体系：94℃预变性 5min；94℃变
性 1min，56℃退火 1min，72℃延伸 1min，30
个循环；72℃孵化 6min；4℃保持。变性梯度
凝胶电泳（DGGE）采用 10%聚丙烯酰胺凝胶，
变性剂梯度为 30%–60%，PCR产物加样量 40μL，
在 60℃，1×TAE，150V条件下电泳 6h，电泳胶
片利用 10μL SYBER green I（Sigma）染色 30min，
在 BioRad 凝胶成像仪中观察、拍照。
1.5 28S rDNA片段的 PCR 扩增及检测
以 DNA 基因组作为模板，对 28S rDNA 进
行 PCR扩增。正反向引物的序列分别为 U1：5′‐G
TGAAATTGTTGAAAGGGAA‐3′；U2：5′‐CGCCCGCCG
CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGACTCCTTGGTCC
GTGTT‐3′。扩增反应体系 50μL：5μL 10×PCR
buffer，5μL dNTP（2.0mmol/L），1μL 引物
（25μmol/L），1μL Taq DNA 聚合酶（5U/μL），1μL
模板，ddH2O 补足。PCR 扩增条件：94℃预变
性 3min；94℃变性 45s，51℃退火 45s，72℃
延伸 1min，30 个循环；72℃孵化 10min；4℃
保持。电泳、染色结束，在 BioRad 凝胶成像仪
中观察、拍照。
1.6 电泳图谱的统计学分析
观察各个土壤样品的 PCR产物经变性梯度
凝胶电泳（DGGE）分离后的电泳图谱照片，并
采用 Quantity One 软件对 DGGE 图谱进行数字
化处理和聚类分析。
1.7 数据处理
数据采用 SPSS 11.5 统计软件进行方差分
析和聚类分析；对 DGGE 图谱进行软件分析，
用 Shannon‐Wiener 指数和均匀度指数来评价
土壤微生物群落的基因多样性。
1.8 栽培试验
试验于 2011年 9月至 2012年 4月在浙江省
农业科学院园艺研究所蘑菇试验基地进行。试验
小区随机设置在菇房不同层次床架上，每小区
1m2，每处理设 3 个重复；按常规栽培法管理。
观测采用不同覆土材料蘑菇出菇数量与产量。
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2 结果与分析
2.1 不同覆土理化性状
5 种覆土配方 pH 值多控制在 7.3–7.7 之
间；由于泥炭呈酸性，随着覆土中泥炭比例
的增加，用于调节 pH 的石灰用量随之增加，
而使覆土电导率增大；碎稻草 50%加田土 50%
配方样的空隙度较大，为 51.8%；持水率以
100%泥炭配方最高，达 75.0%，砻糠田泥配
方最低，仅 33.5%，覆土配方的持水率随着泥
炭比例的增加而增高。不同覆土基质的饱和
容重较高的是砻糠 15%加田土 85%配方样，
为 1 350.1g/L，其次是泥炭 30%加田土 70%配
方样（表 1）。
表 1 不同覆土的理化特性
Table 1 Physical and chemical properties of different casing soils
覆土体积比配方
Casing soil (volume proportion)
pH 电导率
(Μs/cm)
空隙度
AFP (%)
持水率
Water retention (%)
容重
CBD (g/L)
. 100% peatⅠ 7.4±0.07 1 532±35 8.8±0.23 75.0±2.12 925.5±11.2
. 50% peat+50% soilⅡ 7.3±0.11 1 112±37 6.1±0.45 51.1±0.85 1 119.2±15.1
. 30% peat+Ⅲ 70% soil 7.3±0.08 928±32 5.6±0.37 47.0±1.74 1 318.3±16.1
. 15% rice husk+70% soilⅣ 7.4±0.11 437±40 18.8±1.33 33.5±2.16 1 350.1±13.5
. 50% Ⅴ crushed straw+50% soil 7.61±0.06 844±25 51.8±1.12 48.4±1.21 739.6±10.2
2.2 V3‐PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳
将各处理样品的总 DNA 粗提液经过 1.0%的
琼脂糖凝胶电泳，发现所有覆土配方样品的总
DNA 粗提液均在 23kb 左右出现很亮的条带，表
明已获得较长片段的土壤微生物总 DNA，适合土
壤微生物 16S rDNA分析。将 16S rDNA的 V3‐PCR
扩增产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，5个覆土配
方样品均扩增获得大小在 200–300bp 之间的目
的片段（图 1），可用于后续 DGGE分析。
2.3 V3‐PCR 产物的 DGGE 图谱分析
不同细菌类群的 V3 区域，片段大小基本
一致，但其 DNA 的序列组成存在差异，利用
DGGE 可以将片段大小相同但序列组成不同的
细菌类群 V3 区域进行分离。覆土材料的细菌
群落 16S rDNA片段通过 DGGE被分离为若干条
带，发现 16S rDNA所出现的条带数目和在胶上
图 1 样品 V3‐PCR扩增的电泳图谱
Fig. 1 The electrophoresis of V3‐PCR products. M:
DL3000 marker; 1: 100% peat; 2: 50% peat+50% soil; 3:
30% peat+70% soil; 4: 15% rice husk+70% soil; 5: 50%
crushed straw+50% soil.
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迁移的位置样品之间存在一定的差异。其中泥
炭 30%加田土 70%覆土配方（Ⅲ）的条带数量
最多，细菌多样性指数（3.226）略高于其他覆
土配方的 Shannon 指数，分别为 3.201（Ⅰ）、
3.215（Ⅱ）、3.014（Ⅳ）、3.006（Ⅴ），相互之
间无极显著差异。
从不同覆土材料细菌类群的 UPGMA 聚类
分析结果可以看出（图 2），树状图分为两个大
的分支，其中砻糠 15%加田土 85%覆土配方
（Ⅳ）和碎稻草 50%加田土 50%覆土配方（Ⅴ）
聚为一类，配方Ⅱ和配方Ⅲ聚为一类，说明砻
糠与田土、碎稻草与田土的混合覆土中的细菌
类群与不同比例泥炭覆土存在较大的差异，其
图 2 DGGE指纹图谱聚类分析树状图
Fig. 2 Cluster map of similarity coefficient of the DGGE
profiles.
炭覆土与碎稻草 50%加田土 50%覆土的相似性
仅为 62%。不同比例泥炭覆土间的微生物群落
中，100%泥结构的相似性较大，其中泥炭 50%
加田土 50%（Ⅱ）与泥炭 30%加田土 70%（Ⅲ）
两种覆土的微生物群落结构相似性达到 99%。
2.4 28S rDNA PCR 扩增产物的 DGGE 图谱分析
不同真菌类群的28S rDNA PCR扩增片段大
小基本一致，但其 DNA的序列组成存在差异，
利用 DGGE 可以将片段大小相同但序列组成不
同的真菌类群 28S rDNA PCR 扩增片段进行分
离。在 30%–60%的变性梯度范围内，5 种不同
覆土材料其28S rDNA PCR扩增产物都实现了较
好的分离。DGGE 指纹图谱上一些条带在所有
覆土配方样品中都存在，有一些条带不能被分
辨，也有一些条带消失而一些条带变强，表明
供试覆土配方样品的微生物群落相当复杂。
运用 Bio‐Rad 公司的 Quantity One 图像分
析软件对 DGGE 指纹图谱进行分析，扣除背景
强度，检测每个泳道的条带数目，分析每个条
带的强度，再计算每个土壤样品的多样性指数
（表 2）；供试处理材料之间真菌的丰富度（S）、
均匀度（EH）、Shannon 指数（H）存在明显区
别，其中碎稻草 50%加田土 50%覆土配方（V）
的丰富度（S）比 100%泥炭覆土（Ⅰ）高出 5.4
倍；5 种不同覆土材料配方的均匀度指数介于
表 2 不同覆土材料真菌群落基因多样性指数
Table 2 Genetic diversity indices of fungal communities of different casing soils
覆土体积比配方
Casing soil (volume proportion)
条带数目
The band number (S)
均匀度指数
Evenness (EH)
多样性指数
Shannon’s diversity index (H)
. 100% peatⅠ 7 e 0.651 e 1.266 e
. 50% peat+50% soilⅡ 17 d 0.682 d 1.932 d
. 30% peat+70% soilⅢ 20 c 0.758 c 2.271 c
. 15% rice husk+70% soilⅣ 30 b 0.914 b 3.109 b
. 50% crushed straw+50% soilⅤ 38 a 0.983 a 3.576 a
注：表中字母表示多重比较的结果，不同字母的值间差异达 0.05显著水平.
Note: Values followed by different letters are significantly different at 0.05 level.
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0.651–0.983之间，而多样性指数以覆土配方Ⅴ
最大，覆土配方Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ次之，覆土配方Ⅰ
最小，这表明泥炭比例的提高，覆土处理中真
菌类群的多样性相对减少。
2.5 不同覆土材料蘑菇出菇量与产量
首潮菇蕾形成量随着覆土中泥炭含量的增
加而增多；不同比例泥炭覆土配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
的首潮菇蕾形成量均显著高于砻糠与田土、碎
稻草与田土的混合覆土配方Ⅳ和Ⅴ，以 100%
泥炭覆土配方Ⅰ最高，每平方米平均菇蕾数达
286 个，碎稻草与田土的混合覆土配方Ⅴ只有
101 个，添加不同比例泥炭的覆土配方Ⅰ和Ⅱ
之间无显著性差异（图 3）。双孢蘑菇产量随着
覆土中泥炭含量减少而降低（图 4）；不同比例
泥炭覆土配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的产量均显著高于砻
糠与田土、碎稻草与田土的混合覆土配方Ⅳ和
Ⅴ，以 100%泥炭覆土配方Ⅰ产量最高，每平方
米平均产量达 11.3kg，比碎稻草与田土的混合
覆土配方Ⅴ增产 151.1%，其次是泥炭 50%加田
土 50%覆土配方Ⅱ，平均产量达 10.9kg，泥炭
30%加田土 70%覆土配方Ⅲ也显著高于砻糠与
田土、碎稻草与田土的混合覆土配方Ⅳ和Ⅴ。
图 3 不同覆土材料首潮菇蕾形成量
Fig. 3 Primordial number of first flush of different casing
soil treatments.
图 4 不同覆土材料蘑菇产量
Fig. 4 Mushroom yield of different casing soil treatments.
3 讨论
随着人们对土壤微生物的深入研究，发现
常规培养方法分析仅仅反映极少数微生物的信
息，通过纯培养分离出的微生物只占其中
0.01%–10.0%，不能充分解析土壤微生物生态状
况，无法进一步全面地评价微生物群落多样性
及相互作用原理。结合运用 PCR 扩增产物与
DGGE 技术，依据 DGGE指纹图谱上的条带数目
和迁移的距离，区别微生物群落基因多样性指
数，是评价不同土壤微生物群落多样性非常有
效的方法。本研究显示，不同比例泥炭与田土
混合覆土配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的细菌群落 Shannon
指数和丰富度略高于砻糠与田土、碎稻草与田
土的混合覆土配方Ⅳ和Ⅴ，聚类分析把 5 种不
同覆土配方区分为 2 类，可能是由于覆土材料
与配方比例不同导致微生物群落基因多样性略
有差异；通过前期纯培养、PFLA法研究中我们
发现，不同覆土的细菌数量与其中的双孢蘑菇
菌丝生物量呈正相关，覆土中的细菌与双孢蘑
菇菌丝存在营养共生关系（Cai et al. 2009；蔡
为明等 2008），采用 DGGE 方法进一步证明了
这一观点。细菌群落在农业生态系统中占有十
分重要的地位，大型真菌与细菌群落之间存在
微妙的互作关系。细菌可通过影响菌丝细胞膜
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透性和代谢活动、对菌丝分泌物的吸收作用和
改变菌丝养分的生物有效性等方式影响其子实
体的生长；另一方面，大型真菌可通过分泌大
量有机物质来影响细菌群落在其“菌际”的吸
附和生存，从而调节土壤微生物种群结构及有
益的共生关系（Fitter & Garbaye 1994；Frey et al.
1997）。一些研究发现土壤有益微生物荧光假
单胞杆菌接种在平菇上促进原基形成，增强了
平菇子实体的膨大（Cho et al. 2003）；这些有
益微生物可以通过分泌化合物、分解连作土壤
中存在的有害物质或与特定的病原菌竞争营养
和空间等来诱导大型真菌子实体形成，减少病
原菌的数量并提高产质量（Ouhdouch et al.
2001）。因此，细菌数量和结构在子实体发生
和发育中起着重要作用，通过提高、改善双孢
蘑菇有益微生物量和群落结构是诱导子实体形
成和提高产量的一个重要研究方向。
大量研究表明，农作物土壤中真菌的数量
显著上升，病原菌数量急剧增大，土壤微生物
从细菌主导型向真菌主导型转化，病原真菌通
过侵入寄主、降解酶系、降解防卫性物质、形
成毒素等方式更易使植物感染（Creelman &
Mullet 1997；Durner et al. 1997；申卫收和林先
贵 2011），真菌型土壤是地力衰竭的标志。本
研究表明，随着真菌群落的丰富度、均匀度、
Shannon 指数增加，双孢蘑菇的出菇量与产量
反而减少；从 28S rDNA PCR 扩增产物的 DGGE
图谱分析看，其中一些条带消失而一些条带变
强，并且一些条带是不同处理中所特有的条带，
暗示它们来自于不同覆土材料配方的共有真菌
或由同样 GC含量的不同真菌种类所组成，需通
过序列测定等进一步确定。通过栽培试验发现，
双孢蘑菇子实体形成量、产量可能与真菌群落
多样性呈负相关。其影响机制需进一步研究不
同双孢蘑菇覆土配方中除其本身菌丝外的其他
“杂菌”的种类、数量、结构及其互作关系。
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