全 文 ：中国药业 China Pharmaceuticals
2011年第 20卷第 9期
·4·
毛脉酸模叶中有效成分提取方法的比较研究＊
王振月1，刘颖新 1，2，刘利利 2
(1． 黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040; 2． 湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)
摘要:目的 筛选毛脉酸模叶有效成分的最佳提取工艺。方法 以毛脉酸模叶中白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄素及出膏率为考察指标，用正交
设计试验优化工艺，并通过多指标综合评分比较 3 种方法。结果 传统索氏提取法最佳提取工艺的综合评分为 35． 59;复合酶法最佳提取
工艺的综合评分为 86． 41;通过提取原生质体得到有效成分的方法的最佳提取工艺的综合评分为92． 17。结论 通过提取叶片中原生质体
得到有效成分的方法要优于另外两种方法。
关键词:毛脉酸模;提取方法;最佳提取工艺
中图分类号:TQ461;R282． 71 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2011 )09 － 0004 － 04
Comparative Study on the Extracting Methods for Effective Components in Leaf of Rumex Gmelini
Wang Zhenyue1， Liu Yingxin1，2， Liu Lili2
( 1． Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang， China 150040;
2． Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou， Hunan， China 412012 )
Abstract:Objective To compare the diffirent extracting methods on effective components in leaf of Rumex gmelini． Methods Use resver-
atrol glucoside，resveratrol，emodin and paste － forming rate as the indictator，adopt orthogonal design testing and multiple guidelines grading
method to compare three methods． Results The grade of the best extraction technology of the traditional soxhlet extraction method was
35． 59; compound enzyme method was 86． 41; the method of extracting protoplast was 92． 17． Conclusion The method of extracting protoplast
is better than the other two methods．
Key words:Rumex gmelini Turcz．;extracting methods;best extraction technology
溶解制备成约含苯丙哌林 100 mg / L和尼卡地平 100 mg / L的对照
品贮备液，将上述两种溶液于冰箱 － 20 ℃贮存，30 d 内使用。临用
前用甲醇稀释至所需质量浓度即可。
2．3 血样制备与测定方法
精密量取犬血浆样品 0． 5 mL，加入内标尼卡地平甲醇溶液
(10 μg / mL)25 μL，加入 4 mol / L 的 NaOH 水溶液 100 μL，旋涡混
匀，加入混合溶剂正己烷 －异丙醇(80 ∶ 20)2 mL，旋涡 2 min，以
10 000 r /min 离心 3 min。分取有机相 1． 5 mL，置另一离心管中，于
50 ℃水浴中以氮气流吹干。残渣用 100 μL流动相溶解，10 000 r /min
离心 2 min，取 20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以内
标法将测量值带入随行工作曲线，计算血浆中磷酸苯丙哌林的质
量浓度。
2．4 分析方法验证
2. 4. 1 线性、检测限与定量限
于 0． 5 mL空白犬血浆中，加入不同质量浓度的磷酸苯丙哌林
对照品溶液和内标溶液(10 μg /mL)25 μL，使血中磷酸苯丙哌林质
量浓度依次为 0． 01，0． 02，0． 05，0． 10，0． 20，0． 40，0． 80 μg /mL，混
匀后依法萃取测定，记录色谱图。以峰面积比 A 样 / A 内为纵坐标、
磷酸苯丙哌林质量浓度 C (μg /mL)为横坐标进行线性回归，得标
准曲线方程 Y = 1． 880 7 X + 0． 013 2，r2 = 0． 998 ( n = 7 )。结果表明，
磷酸苯丙哌林质量浓度在 0． 01 ～ 0． 80 μg /mL 范围内与峰面积比
线性关系良好，检测限为 5 ng /mL(S / N = 3)，定量限为 10 ng /mL。
2. 4. 2 萃取回收率
取空白犬血浆 0． 5 mL，分别配制成高、中、低质量浓度(0． 40，
0． 10，0． 02 μg /mL)的磷酸苯丙哌林血浆样品(Cr)，按 2. 3 项下血
浆样品测定法处理后进样 3 次，测得峰面积，并求出各质量浓度下
3 次进样的峰面积均值 Ar。另取高、中、低已知质量浓度 ( Cs )的磷
酸苯丙哌林对照品甲醇溶液，氮气挥干，加入 100 μL 流动相溶解
后进样 20 μL测定，得峰面积 As。以前后两种处理测定得到的对照
品峰面积之比(Ar / As)计算提取回收率。结果平均萃取回收率为
89． 5%，RSD为 6． 42%(n = 9)。
2. 4. 3 精密度与方法回收率
取 0． 5 mL空白犬血浆，配制高、中、低 3 种质量浓度的血浆样
品，照 2． 3项下方法考察日内、日间精密度和回收率。结果见表 1。
2. 4. 4 溶液稳定性
取空白犬血浆 0． 5 mL，配制高、中、低 3 种质量浓度的含药血
浆样品，于冰箱 － 20 ℃放置，于不同时间取样，按 2． 3 项下方法进
行稳定性考察。结果含药血浆样品中磷酸苯丙哌林在 20 d内稳定。
3 讨论
文献中有关生物样品中磷酸苯丙哌林在检测方法很少 [ 2 ]，而现
有的检测方法检测限较高。本试验建立的高效液相色谱法，通过对
空白血样的干扰分析、内标物质的选择以及色谱条件和操作方法
的研究，提高了灵敏度，方法学考察结果符合 2005 年版《中国药典
(二部)》的要求，为磷酸苯丙哌林的药代动力学研究奠定了基础。
参考文献:
[ 1 ] 劳凤云，孙广利 ． 磷酸苯丙哌林微囊的制备 [ J ] ． 中华实用中西医杂
志，2003，3 (16 ) : 1 830 － 1 831.
[ 2 ] 栾 杨，刘拥军，仲 英，等． 高效液相色谱法测定血液中苯丙哌林 [ J ] ．
中国卫生检验杂志，2000，10(6):685 － 686.
(收稿日期:2011 － 01 － 08 )
方法回收率
(%)质量浓度(μg /mL )
0． 40
0． 10
0． 02
日内 RSD(%)
2． 63
3． 28
11． 35
日间 RSD(%)
2． 55
4． 29
10． 13
98． 61
96． 89
109． 30
表 1 精密度和方法回收率试验结果(n = 5)
精密度
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
＊国家自然科学基金项目，项目编号:30970300，30270156。
药物研究
中国药业 China Pharmaceuticals ·5·
2011年第 20卷第 9期
成分
白藜芦醇苷
白藜芦醇
大黄素
回归方程
Y = 1． 262 × 106 X － 19 970
Y = 9． 787 × 106 X － 81 250
Y = 8． 000 × 104 + 3． 328 × 106 X
r
0． 999 2
0． 999 8
0． 999 8
线性范围(μg)
0． 11 ～ 7． 7
0． 006 ～ 0． 40
0． 018 ～ 3． 990
表 1 线性关系考察结果
样品含量(mg)
0． 461
0． 455
0． 453
0． 459
0． 462
加入量 (mg )
0． 411
0． 411
0． 411
0． 411
0． 411
测得量 (mg )
0． 884
0． 871
0． 861
0． 877
0． 882
回收率 (% )
102． 92
101． 22
99． 27
101． 70
102． 19
X(%)
101． 46
RSD(%)
1． 36
表 2 白藜芦醇苷加样回收试验结果(n = 5)
毛脉酸模 Rumex gmelini Turcz． 为蓼科酸模属植物，民间以根
入药，以治疗淋病、癣病、疮毒、止血、癌症和调血脂等著称 [ 1 ]。目前
已从毛脉酸模根中分离出酸模素、蒽醌类、二苯乙烯类等化合物。
药理研究表明，毛脉酸模具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。笔
者以毛脉酸模的叶片为研究对象，用 3 种不同方法提取叶中有效
成分，通过多指标综合评分来比较 3 种方法的优劣，以期为叶类药
材的成分提取提供新的途径。现报道如下。
1 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪;Mettler AE 240 型电子天平(瑞士
Mettler 公司); 电热恒温水浴锅(江苏金坛医疗仪器厂 );恒温电热
套(山东鄄城永兴仪器厂);DHG － 9140 A 型电热恒温鼓风干燥箱
(上海一恒科技有限公司)。毛脉酸模叶(采于黑龙江中医药大学药
用植物园温室，3 年生，质量鲜干比为 1 ∶ 0． 179 7);白藜芦醇、白藜
芦醇苷对照品(美国 SIGMA 公司); 大黄素对照品(中国药品生物
制品检定所); 纤维素酶、果胶酶(黑龙江肇东日成酶制剂有限公
司)。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 含量测定方法建立
2． 1． 1 色谱条件
色谱柱:Planetsil C18 柱(200 mm × 4． 6 mm，5 μm); 预柱:Phe-
nomenex ODS 柱 ( 4． 0 mm × 3． 0 mm); 流动相: 甲醇－ 0． 1%磷酸 －
水;梯度洗脱条件: 流动相从30%甲醇到 100%甲醇，分析时间为
50 min;流速:1 mL /min;检测波长:254 nm。
2． 1． 2 供试品溶液制备
传统索氏提取法提取试验供试品溶液:取3 年生毛脉酸模叶，
在 60 ℃下干燥至恒重。粉碎至不同粒度后精密称取适量，置索氏
提取器中，用不同体积分数的乙醇提取一定时间，滤过，滤液置蒸
发皿中蒸干，残渣用 5 mL甲醇溶解并定容至刻度，然后过 0． 45 μm
的微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。
复合酶法提取试验供试品溶液:取3年生毛脉酸模叶，在 60 ℃
下干燥至恒重。粉碎至不同粒度后精密称取适量，加入复合酶，倒
入适量一定 pH的蒸馏水中，在一定温度条件下反应一段时间后倒
入索氏提取器中，用 80%乙醇提取 4 h，将提取液倒入蒸发皿中蒸
干，残渣用 5 mL 甲醇溶解并定容至刻度，再过 0． 45 μm 的微孔滤
膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。
通过提取原生质体 [2 ]得到有效成分的方法(以下简称原生质体
提取法)提取试验供试品溶液:取3 年生新鲜毛脉酸模叶，经预处
理、灭菌、去下表皮、酶解、尼龙筛网过滤、离心处理等步骤后，将提
取液倒入蒸发皿中蒸干，残渣用 5 mL 甲醇溶解并定容至刻度，再
过 0． 45 μm的微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。
2． 1． 3 方法学考察
线性关系考察:精密称取白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄素对照
品适量，用甲醇配制成质量浓度分别为 0． 22，0． 02，0． 19 g / L的标
准溶液，进样测定峰面积。以峰面积 ( Y )对进样量 ( X )进行线性回
归。结果见表 1。
精密度试验:取同一供试品溶液，连续进样5 次，白藜芦醇苷、
白藜芦醇、大黄素峰面积积分值的 RSD ＜ 2%(n = 5)，表明仪器精
密度符合要求。
重现性试验:取同一样品粉末5 份，每份精密称取 0． 1 g，按传
统索氏提取法提取试验供试品溶液制备方法制成供试品溶液，测
定峰面积。结果 3 个次生代谢产物峰面积积分值的 RSD ＜ 4%
(n = 5)，表明方法重现性良好。
稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在0，2，6，18，24 h 时进
样测定。结果 3个次生代谢产物峰面积积分值的 RSD ＜ 4% ( n = 5)，
表明供试品溶液在 24 h内稳定。
加样回收试验:精密称取已知含量的毛脉酸模粉末样品，分别
加入一定量的白藜芦醇苷对照品，按传统索氏提取法提取试验供
试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定含量，计算加样回收率。
结果见表 2。
2．2 索氏提取法正交试验
2． 2． 1 提取条件优化
先进行单因素试验，对乙醇体积分数、提取时间、药材粉碎粒
度进行研究。分别测定毛脉酸模叶中有效成分的含量和出膏率，并
进行多指标综合评分 [ 3 ]。在此基础上，选取主要影响因素和合适的
水平，按 L9(34)正交试验设计表的条件进行试验，并作多指标综合
评分，确定最佳提取条件。评分时以各指标的最大值为参照，将数
据归一化，再给出不同的权重。白藜芦醇苷的权重系数设为 0． 3，白
藜芦醇的权重系数设为 0． 3，大黄素的权重系数设为 0． 2，以浸出
物多少来代表其他有效成分，并将出膏率设为正权重系数。考虑到
出膏率和其他已明确指标成分存在的矛盾，将出膏率的权重系数
定为 0． 2，以综合值进行统计分析。其中综合评分 Y = 0． 3 X1 ×
100 /此指标最大值 + 0． 3 X2 × 100 /此指标最大值 + 0． 2 X3 × 100 /
此指标最大值 + 0． 2 X4 × 100 /此指标最大值。
2． 2． 2 单因素试验
乙醇体积分数:精密称取毛脉酸模叶粉末( 80 目 ) 0． 500 0 g，在
其他条件相同的情况下，以不同体积分数的乙醇进行提取，分别测
定各有效成分的含量和出膏率，并进行多指标综合评分。结果乙醇
体积分数为 40% ，50% ，60% ，70% ，95% 时，综合评分分别为
89． 821 03，81． 782 24，78． 492 52，75． 401 99，72． 523 51。可见，乙醇
体积分数为 40%时提取效果最好，体积分数为 50%和 60%的乙醇
次之，故选这 3 个水平进行正交试验。
提取时间: 精密称取毛脉酸模叶粉末( 80 目 ) 0． 500 0 g，加入
体积分数为 50%的乙醇，提取不同的时间，其他条件相同。对得到
的滤液定容，分别测定不同提取时间有效成分的含量和出膏率，并
进行多指标综合评分。结果提取 3，4，5，6，7 h 时，综合评分分别为
90． 849 16，94． 934 91，92． 231 18，88． 832 37，87． 348 39。可见，提取
4 h已达到最佳效果，故选 3，4，5 h进行正交试验。
药材粒度:精密称取不同粒度的毛脉酸模叶粉末0． 500 0 g，加
体积分数为 50%的乙醇提取 4 h，其他条件相同。对得到的滤液定
容，分别测定不同药材粒度时有效成分的含量和出膏率，并进行多
指标综合评分。结果最细粉、细粉、中粉、粗粉、最粗粉的综合评分分
别为 69． 215 34，73． 264 15，85． 134 28，82． 897 08，77． 523 49。可见，
药物研究
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表 3 索氏提取法因素水平表
水平
1
2
3
因素 A(% )
40
50
60
因素 B(h)
3
4
5
因素 C
中
粗
最粗
注:F0． 05 (2，2 ) = 19． 00， F0． 01 (2，2 ) = 99． 00。
方差来源
A
B
C
误差
离均差平方和
235． 131
4． 217
22． 759
10． 85
自由度
2
2
2
2
均方
117． 566
2． 108 5
11． 379 5
5． 425
F值
21． 673
0． 389
2． 098
P
P ＜ 0． 05
表 5 索氏提取法方差分析表
表 4 索氏提取法正交试验结果 ( n = 3 )
因素 含量 (% )
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
201. 82
224. 74
239. 05
37. 23
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
219. 35
221. 88
224. 38
5. 03
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
215. 13
224. 98
225. 50
10. 37
D(误差)
1
2
3
3
1
2
2
3
1
218. 43
220. 87
226. 31
7. 88
白藜芦醇苷
0. 051 54
0. 062 81
0. 082 87
0. 101 01
0. 099 89
0. 100 84
0. 062 91
0. 087 06
0. 093 73
白藜芦醇
0. 001 5
0. 002 7
0. 001 9
0. 001 3
0. 002 3
0. 001 0
0. 004 3
0. 002 8
0. 002 4
大黄素
0. 037 66
0. 026 41
0. 030 33
0. 034 65
0. 019 78
0. 033 28
0. 020 78
0. 028 26
0. 030 21
出膏率
(%)
23. 78
22. 68
23. 18
25. 18
25. 85
25. 58
27. 55
25. 53
27. 38
综合
评分
63. 04
67. 98
70. 80
76. 59
74. 98
73. 17
79. 72
78. 92
80. 41
中粉已能达到最佳效果，因此选中粉、粗粉、最粗粉进行正交试验。
2． 2． 3 正交试验设计
为进一步考察索氏提取的提取工艺，精密称取 3 年生毛脉酸
模叶粉末 0． 503 2 g，对影响提取效果的主要因素乙醇体积分数 (因
素 A)、提取时间 (因素 B)、药材粒度 (因素 C)进行正交试验。因素
水平见表 3。按 L9 (34 )正交试验表分别制备各样品溶液，滤过，蒸干，
残渣以甲醇溶解并定容至 25 mL，用微孔滤膜滤过，滤液作为供试品
溶液。分别吸取上述各供试品溶液 10 μL，注入高效液相色谱仪，测定
各指标成分含量和出膏率，并进行多指标综合评分，结果见表 4，方
差分析见表 5。方差分析表明，乙醇体积分数对结果有显著影响，提
取时间和粉碎粒度对结果影响不显著。结合直观分析，选定最佳提
取条件为 A3B3C3，即将药材粉碎成最粗粉，以 60%乙醇提取 5 h。
2． 2． 4 验证试验
对筛选出的最佳工艺 A3B3C3进行验证试验。结果白藜芦醇苷含量
为 0． 096%，白藜芦醇含量为 0． 002 9%，大黄素含量为 0． 038 16%，
浸膏得率为 27． 17% ( n = 3 )，表明工艺达到了优化目的。
2．3 复合酶法提取正交试验
2． 3． 1 提取条件优化
复合酶法提取中药有效成分的主要影响因素为酶解时间、酶
用量、酶解 pH和酶解温度。故选取主要影响因素和合适的水平，按
L9 (34 )正交试验设计表的条件进行试验，并作多指标综合评分(评
分方法同索氏提取法)，以确定毛脉酸模叶提取的最佳条件。
2． 3． 2 单因素试验
pH: 根据酶制剂产品说明和文献[ 4 ]，酶解时最适宜的 pH 为
5，故选 pH为 4，5，6这 3 个水平进行正交试验。
温度: 根据酶制剂产品说明和文献[ 4 ]，酶解时最适宜的温度
为 50 ℃，故选 40，50，60 ℃这 3个水平进行正交试验。
时间: 根据酶制剂产品说明和文献[ 4 ]，最适宜的酶解时间为
1． 5 h，故选 1． 0，1． 5，2． 0 h这 3个水平进行正交试验。
复合酶用量:根据文献[5 ]确定纤维素酶与果胶酶的配比为 1 ∶ 1
时，有效成分的提取效果最佳。精密称取 0． 500 0 g 毛脉酸模叶粉
末 ( 80 目 )，分别加入质量为毛脉酸模叶粉末 0． 5%，1%，2%，3%，
4%，5%的复合酶，在相同温度下酶解相同时间后，用 80%乙醇提
取 4 h。对得到的滤液定容，然后分别测定不同酶量提取条件下有
效成分的含量以及出膏率，并进行多指标综合评分。结果酶用量为
0． 5% ，1% ，2% ，3% ，4% ，5% 时，综合评分分别为 76． 182 32，
81． 482 60，85． 927 43，89． 284 68，84． 128 45，80． 928 46。可见，提取
酶量为 3%时已达最佳效果。
2． 3． 3 正交试验设计
精密称取 3 年生毛脉酸模叶粉末 0． 503 2 g，对影响提取效果
的主要因素酶解时间 (因素 A)、酶解温度 (因素 B )、pH(因素 C )进
行正交试验。因素水平见表 6。按 L9 ( 34 )正交试验表分别制备各样
品溶液，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至 25 mL，用微孔滤膜
滤过，滤液作为供试品溶液。分别吸取上述各供试品溶液 10 μL，注
入高效液相色谱仪，测定各指标成分含量和出膏率，并进行多指标
综合评分，结果见表 7，方差分析见表 8。由方差分析可知，酶解时
间对结果影响显著，酶解温度和 pH 对结果影响不显著。结合直观
分析，选定最佳提取条件为 A2B3C3，即酶解时间 90 min，酶解温度
60 ℃，pH = 6。
2． 3． 4 验证试验
对筛选出的最佳工艺 A2B3C3 进行验证试验。结果白藜芦醇
注:F0． 1 (2，2 ) = 9． 0， F0． 01 (2，2 ) = 99． 00。
方差来源
A
B
C
误差
离均差平方和
139． 778
9． 635
30． 738
6． 28
自由度
2
2
2
2
均方
69． 889
4． 818
15． 369
3． 14
F值
22． 265
1． 535
4． 896
P
P ＜ 0． 05
表 8 复合酶法方差分析表
表 6 复合酶法因素水平表
水平
1
2
3
因素 A(min)
60
90
120
因素 B(℃ )
40
50
60
因素 C
4
5
6
表 7 复合酶法正交试验结果 ( n = 3 )
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
220. 39
246. 09
244. 80
25. 70
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
235. 30
234. 52
241. 46
6. 94
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
229. 40
239. 64
242. 25
12. 85
D(误差)
1
2
3
3
1
2
2
3
1
238. 86
233. 55
238. 87
5. 32
白藜芦醇苷
0. 125 8
0. 202 9
0. 243 7
0. 150 4
0. 231 1
0. 114 8
0. 217 4
0. 180 2
0. 169 1
白藜芦醇
0. 054 92
0. 038 19
0. 027 31
0. 056 24
0. 050 57
0. 064 72
0. 043 78
0. 049 39
0. 060 53
大黄素
0. 083 2
0. 086 7
0. 107 2
0. 129 7
0. 091 5
0. 113 9
0. 110 9
0. 097 7
0. 100 8
出膏率
(%)
26. 71
25. 32
28. 19
28. 56
27. 28
28. 17
27. 15
26. 08
31. 22
综合
评分
70. 89
72. 27
77. 23
82. 87
83. 48
79. 74
81. 54
78. 77
84. 49
因素 含量 (% )
药物研究
中国药业 China Pharmaceuticals ·7·
2011年第 20卷第 9期
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
252. 41
245. 29
230. 95
21. 46
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
239. 70
246. 61
242. 34
6. 91
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
236. 96
251. 01
240. 68
14. 05
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
240. 84
228. 49
259. 32
30. 83
白藜芦醇苷
0. 251 9
0. 275 8
0. 171 9
0. 230 3
0. 217 5
0. 144 4
0. 133 6
0. 229 4
0. 209 7
白藜芦醇
0. 071 95
0. 072 07
0. 097 07
0. 092 45
0. 080 73
0. 085 64
0. 073 90
0. 080 01
0. 070 64
大黄素
0. 105 2
0. 108 6
0. 139 1
0. 123 2
0. 112 9
0. 124 5
0. 116 0
0. 111 5
0. 126 4
出膏率
(%)
26. 95
26. 55
34. 45
30. 25
28. 85
25. 38
28. 15
27. 24
27. 60
综合
评分
80. 42
83. 29
88. 70
88. 89
81. 59
74. 81
70. 39
81. 73
78. 83
表 10 原生质体提取法正交试验结果及其数据处理表 ( n = 3 )
因素 含量 (% )
水平
1
2
3
因素 A(h)
2
3
4
因素 B(mol /L)
0． 4
0． 5
0． 6
因素 C(% )
0． 5
1． 0
1． 5
因素 D(% )
0． 1
0． 3
0． 5
表 9 原生质体提取法因素水平表
苷含量为 0． 248 2%，白藜芦醇含量为 0． 065 27%，大黄素含量为
0． 132 2%，浸膏得率为 28． 97% ( n = 3 )，表明工艺达到了优化目的。
2．4 原生质体提取法正交试验
2． 4． 1 提取条件优化
先采用单因素试验，对纤维素酶用量、果胶酶用量、酶解时间、
酶液渗透压进行研究，分别测定原生质体提取产量。在此基础上，
选取主要影响因素和合适的水平，按 L9(34)正交试验表的条件进
行试验，并作多指标综合评分 (评分方法同索氏提取法 )，以确定毛
脉酸模叶提取的最佳条件。
2． 4． 2 单因素试验
纤维素酶用量:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0． 500 0 g，在温度
为 25 ℃、pH 为 5． 6、渗透压为 0． 5 mol / L 的条件下，每克药材加
0． 3%的果胶酶，在不同纤维素酶用量的处理条件下取样检测原生
质体的提取情况。结果纤维素酶用量为 0． 3% ，0． 5% ，1． 0% ，
1． 5%，2． 0%时，原生质体产量分别为 1． 2 × 106，4． 3 × 106，4． 8 ×
106，4． 1 × 106，3． 1 × 106个 / mL。因此，纤维素酶的最佳用量为 1%，
其次为 0． 5%和 1． 5%，故选这 3个水平进行正交试验。
果胶酶用量:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0． 500 0 g，在温度为
25 ℃、pH 为 5． 6、酶液渗透压为 0． 5 mol / L的条件下，每克药材加
1%的纤维素酶，在不同果胶酶用量的处理条件下取样检测原生质
体的提取情况。结果果胶酶用量为 0． 05%，0． 1%，0． 3%，0． 5%，
1． 0% 时，原生质体产量分别为 1． 4 × 106，3． 2 × 106，3． 7 × 106，
3． 4 × 106，2． 9 × 106 个 / mL。因此，果胶酶的最佳用量为 0． 3%，其
次为 0． 1%和 0． 5%，故选这 3个水平进行正交试验。
酶解时间: 精密称取毛脉酸模新鲜叶片0． 500 0 g，在温度为
25 ℃、pH为 5． 6、渗透压为 0． 5 mol /L的条件下，每克药材加 1%的
纤维素酶和 0． 3%的果胶酶，在不同时间取样检测原生质体的提取
情况。结果酶解时间为 1，2，3，4，5 h时，原生质体产量分别为 2． 1 ×
106，2． 4 × 106，2． 6 × 106，2． 5 × 106，2． 3 × 106 个 / mL。因此，最佳酶
解时间为 3 h，其次为 2 h和 4 h，故选取这 3个水平进行正交试验。
渗透压:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0． 500 0 g，在温度为 25 ℃、
pH 为 5． 6 的条件下，每克药材加 1%的纤维素酶和 0． 3%的果胶
酶，在不同渗透压下取样检测原生质体的提取情况。结果渗透压为
0． 3，0． 4，0． 5，0． 6，0． 7 mol / L 时，原生质体产量分别为 2． 0 × 106，
2． 4 × 106，2． 7 × 106，2． 6 × 106，2． 2 × 106 个 / mL。因此，最佳渗透压
为 0． 5 mol / L，其次为 0． 4 mol / L和 0． 6 mol / L，故选择这 3 个水平
进行正交试验。
2． 4． 3 正交试验设计
精密称取 3 年生毛脉酸模新鲜叶片 2． 800 g，对影响提取效果
的主要因素纤维素酶用量 (因素 A)、果胶酶用量 (因素 B)、酶解时
间 (因素 C)、渗透压 (因素 D)进行正交试验。因素水平见表 9。按 L9(34 )
正交试验表分别制备各样品液，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定
容至 25 mL，用微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。分别吸取上述
各供试品溶液 10 μL，注入高效液相色谱仪，测定各指标成分含量
以及出膏率，并进行多指标综合评分，结果见表 10，方差分析见
表 11。方差分析结果表明，果胶酶用量对结果影响显著，其他因素对
结果影响不显著。结合直观分析，选定最佳提取条件为 A1B2C2D3，即
纤维素酶 1． 0%，果胶酶 0． 5%，渗透压 0． 5 mol / L，酶解时间 2 h。
2． 4． 4 验证试验
对筛选出的最佳工艺 A1B2C2D3 进行验证试验。结果白藜芦醇
苷含量为 0． 278 8%，白藜芦醇含量为 0． 098 15%，大黄素含量为
0． 138 6%，浸膏得率为 26． 32% ( n = 3)，表明工艺达到了优化目的。
3 讨论
采用多指标综合评分方法对 3 种不同提取方法的最优工艺
进行综合评分(评分方法相同)，结果传统索氏提取法最佳提取工
艺的得分为 35． 59，复合酶法最佳提取工艺的得分为 86． 41，原生
质体提取法最佳提取工艺的得分为 92． 17。表明用原生质体提取
法，有效成分的得率较高，同时实现了白藜芦醇苷到白藜芦醇的
转化，转化效率也较高。试验证明此法在提取毛脉酸模叶片有效
成分方面是可行的，但是否适用于所有叶类药材尚需试验进一步
证明。原生质体提取法为叶类药材有效成分的提取提供了一种思
路。用复合酶法提取毛脉酸模叶中有效成分时，得率要低于原生
质体提取法，但操作相对简单，有效成分的得率要高于传统索氏
提取法。
作者简介:王振月(1956 －)，男，黑龙江哈尔滨人，教授，硕士
研究生导师，主要从事中药资源开发与生物技术研究工作，(电话)
0451 － 82196254(电子信箱)wangzhen_yue@163． com。
参考文献:
[ 1 ] 吉林省中医中药研究所 ． 长白山植物药志 [M ] ． 吉林: 吉林人民出版
社，1982:299．
[ 2 ] 朱至清 ． 植物细胞工程 [M ] ． 北京:化学工业出版社，2003:152．
[ 3 ] 张 彤，徐莲英，陶建生，等．多指标综合评分法优选葛根提取工艺 [ J ] ．
中草药， 2004，35(1):38 － 40．
[ 4 ] 李元波 ． 复合酶解法提取三七皂苷的实验研究 [ J ] ． 天然产物研究与
开发，2005，17(4):488 － 492．
[ 5 ] 张庆增 ． 复合酶法提取当归多糖及其生物活性研究 [D ] ． 吉林:吉林大
学，2006．
(收稿日期:2010 － 09 － 01;修回日期:2010 － 12 － 20 )
表 11 原生质体提取法方差分析表
方差来源
A
B
C
D
离均差平方和
79． 651
8． 106
35． 328
160． 502
自由度
2
2
2
2
均方
39． 826
4． 053
17． 664
80． 251
F值
9． 826
1． 000
4． 358
19． 800
P
P ＜ 0． 05
注:F0． 05 (2，2 ) = 19． 00， F0． 01 (2，2 ) = 99． 00。
药物研究