全 文 ：Compa red w ithmode lg roup, BCPT cou ld obviously in-
crease the activity of ambula tion and rearing and the
number of positive neu ron of BDNF, decrease the num-
ber of positive neuron of Bax, and effective ly prevent
patho log ical damage induced by chronic unpred ictab le
stress. Conclusion　BCPT m ay exhibit the effects of
antidepression , up-regu late the expression of BDNF,
down-regulate the expression o f Bax, and improve o f
the u ltrastructure of hippocampus.
Key words:paec ilomyces tenuipes;chronic stress;BD-
NF;Bax
茅莓总皂苷对大鼠海马神经元细胞
缺氧损伤后胞内钙超载的影响
王继生 ,邱宗荫 ,李惠芝 ,周成林
(重庆医科大学药学院 , 重庆　621000)
中国图书分类号:R-322;R 282. 71;R 284.1;R 322.81;
R 348.2;R 743. 310.22;R 743. 310.53
文献标识码:A　文章编号:1001 - 1978(2007)07 - 0934 -04
摘要:目的　研究茅莓总皂苷对原代培养大鼠海马神经元缺
血损伤后胞内钙超载的影响。方法　大鼠海马神经元培养
后 , 用 F luo-2 /AM负载培养的神经细胞 ,氧糖剥夺 30 m in, 在
激光共聚焦显微镜下监测加入茅莓总皂苷后海马神经元的
[ Ca2+] i的变化。结果　茅莓总皂苷 10- 5 , 10- 4 , 10 - 3 g
L - 1和 N im 10- 5 mo l L - 1组能不同程度地降低大鼠海马神
经元细胞内 [ Ca2+] i。结论　茅莓总皂苷可通过减轻细胞内
的钙超载来对缺血神经元进行保护。
关键词:茅莓总皂苷;脑缺血;神经元;细胞内游离钙
　　茅莓为蔷薇科植物茅莓 Rubus parvifolius L的茎
叶 ,以往用于治疗吐血 、跌打刀伤 、产后瘀滞腹痛 、痢
疾 、痔疮 、疥疮等 [ 1] ,民间还用其根治疗女性月经过
多症[ 2] 。已有研究表明:茅莓提取物对脑缺血有很
好的保护作用 [ 3] 。作者实验室对茅莓水提物抗脑
缺血的有效部位进行筛选 ,发现茅莓水提物抗脑缺
血的有效部位为茅莓总皂苷 (TSRP)。 TSRP对脑缺
血再灌注大鼠有很好保护作用 ,它能改善行为学症
状 、减少脑梗死体积 ,降低脑含水量 ,降低血脑屏障
通透性 ,不同程度提高脑缺血 /再灌注损伤时脑组织
中的 SOD , GSH-Px活性 ,降低脑组织的 MDA含量 。
减低缺血周边区凋亡细胞的数目 ,促进抗凋亡基因
收稿日期:2007 - 03 - 20,修回日期:2007 - 04 - 20
基金项目:重庆市重大科技专项资助 [渝科发计字(2004)27号 ]
作者简介:王继生(1974 - ),男 , 博士 ,主管药师 , 研究方向:抗脑缺
血的新药开发 , E-m ail:w js327@ s ina. com;
邱宗荫(1941 -),男 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:新药
开发的药理学研究及蛋白质组学 , 通讯作者 , Tel:023-
68485272, E-m ail:zongyin@ sohu. com
bcl-2的表达上调 ,凋亡基因 bax表达下调 。其抗脑
缺血的机制可能与抗氧化和抗凋亡有关 [ 4] 。钙离
子([Ca2+ ] i)是各种细胞内具有重要生理作用的离
子之一 ,细胞内 [ Ca2 +] i的变化是细胞实现生理功
能的重要物质基础。在脑缺血等脑性疾病状态下 ,
细胞内 [ Ca2+ ] i均可发生明显变化 ,严重者还可以
导致钙超载[ 5] 。钙超载是多种脑性疾病所具有的
共同特性 ,也是神经元死亡的最后共同通路 [ 6] 。因
此 ,研究 TSRP对细胞内游离钙离子浓度的影响 ,对
于深入分析脑缺血 /再灌流损伤 、迟发性神经元死亡
的分子机制和开发药物用途有着十分重要的意义。
本部分研究利用海马神经元对缺氧损伤比较敏感的
特点 ,培养胚胎大鼠海马神经元 ,采用去除氧气和葡
萄糖 (oxygen and g luco se deprivation, OGD)方法模拟
临床脑缺血损伤过程 ,建立了海马神经元缺糖缺氧
模型 [ 7] 。以此为基础 ,观察 TSRP对海马神经元缺
氧损伤后细胞胞内 [Ca2 +] i变化的影响。
1　材料与方法
1. 1　材料　TSRP由重庆医科大学药物分析实验室
提供 ,纯度为 91.2%。多聚 L-赖氨酸 (PDL)、L-G lu-
tam ine、Fu ra2-AM均为美国 S igma公司产品 。
1. 2　实验动物　怀孕 18 d SD大鼠 6只 ,由第三军
医大学大坪医院实验动物中心提供 [许可证号:
SCXK(渝 )20020003] 。
1. 3　主要仪器 　细胞培养箱 TC2324-Shellab:美
国;生物超净工作台 BCM-1000:苏州;相差显微镜
O lympus-IX50:日本;手术显微镜:苏州。
1. 4　主要试剂　NB(N eurobasa lmedium )培养基 、
B-27、L-G lutam ine-200mmo l L -1均为美国 G ibco产
品;胎牛血清 (FBS);Hyclone美国;多聚 L-赖氨酸
(PDL)、Fura2-AM 、g lutam ic ac id均为美国 Sigma产
品;小鼠抗人神经丝蛋白 (NF-200)单抗 、羊抗小鼠
934 中国药理学通报　Ch inese Pharm acological Bu lletin　2007 Jul;23(7):934 ～ 7
TRITC为北京中杉金桥公司产品。
1. 5　种植培养基　N eurobasa lM edium培养基 、2%
B-27、0.5 μmol L- 1 L-谷胺酰胺 、25 μmol L -1谷
氨酸 、0.5% FBS。
1. 6　维持培养基　N eurobasa lM edium培养基 、2%
B-27、0.5 μmo l L -1 L-谷胺酰胺 。
2　实验方法
2. 1　海马神经元培养　培养皿处理:于细胞培养前
1 d将培养皿中放置盖玻片 ,每个培养皿(35mm)中
加入 0.01 g L- 1的 PDL(0.15 mo l L -1硼酸缓冲
液配制 )2 m l,培养箱内静置过夜;弃去 PDL溶液 ,
消毒双蒸水洗 3次 ,加入 2 m l培养基 ,置培养箱内
预温。
取材:取孕龄 18 d的 SD胚胎大鼠 ,麻醉后断头
处死 , 2%碘酒和 75%乙醇消毒腹部 ,剖腹取出胚胎
于无菌盘内 ,于水平式超净工作台内剥掉胎盘 ,完全
暴露出胚胎后 ,断头 ,并将胚胎头部移置预冷的 HB-
SS分离液培养皿中;解剖显微镜下剔除颅骨和脑
膜 ,分离双侧海马。用加样枪将海马组织移入含有
2 m l种植培养基的刻度吸管中 ,反复吹打直至成为
匀浆悬液 ,筛网过滤。
细胞计数:取 100μl细胞悬液 ,加 0.4%台盼蓝
50 μl,加 PBS缓冲液 350μl,混匀 ,轻轻加样于血球
计数池内 ,显微镜下分别计数活细胞和死细胞数量;
活细胞数量 >70%,方可继续进行神经元种植过程 ,
否则放弃此次实验。
种植与培养:按每孔 106个细胞于 35 mm培养
皿中或 12孔培养板中培养 ,每孔加种植培养基 2
m l, 37℃ 5% CO2孵箱内培养;3 d后更换为无血清
维持培养基 ,以后每 3天更换 1次。培养 12 d后神
经元发育成熟 ,神经元轴突和树突交织成网状 。
2. 2　神经元鉴定　取体外培养(载玻片上)12 d的
大鼠海马神经元 , 去除培养基并经 PBS漂洗 3次
后 ,采用免疫荧光染色方法对体外培养大鼠海马神
经元进行鉴定。
2. 3　药物配制　TSRP 1 mg,加入 1 m l容量瓶中 ,
加蒸馏水定容为 1 m l,样品的浓度为 1 g L- 1 ,取
0.1m l,加入另一容量瓶 ,定容为 1 m l,样品的浓度
为 10-1 g L, 以此类推 , 样品配置成 10-3 , 10-4 ,
10
- 5 , 10-6 , 10-7 g L -1系列浓度。尼莫地平参照文
献配制为 10- 6 mol L - 1 [ 8] 。
2. 4　药物干预　按 2.1原代培养海马神经元 ,按每
孔 106个细胞于 12孔培养板中培养 ,每孔加种植培
养基 2m l, 37℃ 5% CO2孵箱内培养;3 d后更换为
无血清维持培养基 ,以后每 3天更换 1次 。培养 12
d后神经元发育成熟 ,神经元轴突和树突交织成网
状。将培养液分别换为含葡萄糖和不含葡萄糖的
Earle液 ,不含葡萄糖组置入一个经改造的保鲜盒内
(体积2 000m l),密闭并通入混合气体 (含 95% N 2 ,
5% CO2)30m in,缺氧缺糖 30m in后取出培养板 , D-
hanks液洗涤 3次 ,加不含小牛血清的 D-hanks液 2
m l,预温至 37℃, 加 20 μl Fura 2-AM (1 mmo l
L
-1),孵育 30 m in, D-hanks洗涤 3次 ,加神经细胞
基础培养基 37℃孵育 30 m in ,即可置于激光共聚焦
显微镜下 。加入不同剂量的茅莓总皂苷 ,马上在激
光共聚焦显微镜下观察不同细胞内 Ca2 +的荧光强
度。以 340 nm波长为激发光在 510 nm处探测荧光
发射 ,每 200 ms采样 1次 ,其中采样时间为 196m s,
间隔时间为 4m s,在 110 s内连续记录给药前后同
一视野细胞内钙荧光强度的动态变化 ,该荧光强度
的强弱即反映胞质游离钙的相对浓度。
2. 5　统计学处理　各组数据用实验数据用 SPSS
10.0统计分析软件进行分析 ,采用单因素方差分析
(ANOVA),两两比较用 SNK检验。
3　结果
TSRP对缺血海马神经元细胞内钙离子浓度动
态变化的影响 (Tab 1, Fig 1, 2)。
Tab 1　E ffects o f TSRP on the ca lcium transient in
hypox ic h ippocam pa l neurons(–x±s, n=6)
G roup D ose
A verage fluorescence intens ity
Fm ax Fm in
M odel - 147. 35±8. 57 145. 37±4. 58
TSRP 10 - 6 g L -1 138. 32±4. 82 137. 52±7. 43*
10 - 5 g L -1 145. 09±7. 52 128. 86±6. 28**
10 - 4 g L -1 149. 65±26. 25 104. 92±7. 37**
10 - 3 g L -1 149. 65±17. 65 83. 00±4. 29**
N im 10 - 6 mo l L- 1 147. 36±11. 67 68. 28±9. 67**
　　*P <0. 05, **P <0. 01 vsm odel group
F ig 1　H ippocam pa l neurons fluorescence stain ing w ith NF-200
　　体外正常培养 12 d的大鼠海马神经元经 Fura
2-AM避光孵育 30 m in后 ,可见细胞染色良好。正
935 中国药理学通报　ChinesePharmacologica lB ulletin　2007 Ju l;23(7)
常对照组胞内荧光强度为 (58.65±2.69),海马神
经元模拟缺血处理 30 m in,细胞内 Ca2+荧光强度较
对照组升高 (142.35±2.52),与正常对照组相比细
F ig 2　The kinetic changes in average fluorescence intensity of
F luo-2 in ischem ic hippocam pa l neurons trea ted w ith d ifferent
concentrations of drugs w ithin 110 seconds
a:F luo-2 f luorescence on h ippocam pal neu rons before treatment w ith
TSRP;b:Fluo-2 fluorescence on h ippocampa lneu ron s after treatm en tw ith
TSRP;c:H ippocam pl neu rons in LCSM w ithou t fluo-2;A. M ode l;B. TSRP
10 -6 g L- 1;C. TSRP 10 - 5 g L -1;D. TSRP 10 - 4 g L- 1;E. TSRP
10 -3 g L- 1;F. N im 10 - 6m ol L -1
胞内荧光强度差异有显著性。茅莓总皂苷 10-6 g
L
-1对缺氧损伤神经元细胞内钙离子的浓度影响不
明显 , TSRP 10- 5、10-4 、10- 3 g L - 1和组能不同程度
降低缺氧缺糖 30 m in后大鼠海马神经元细胞内
Ca
2 +浓度 ,并且成一定的剂量依赖性。
4　讨论
细胞内游离钙是一种重要的第二信使 ,有着广
泛而复杂的生物学活性 。大多数神经元内游离
Ca
2 +浓度静息时大约为 0.1 μmol L -1 ,约为细胞
外 Ca2 +浓度的 0.01%[ 9] 。在脑缺血等脑性疾病状
态下 ,细胞内 Ca2+均可发生明显变化 ,严重者还可
以导致钙超载 [ 10] 。钙超载是多种脑性疾病所具有
的共同特性 ,也是神经元死亡的最后共同通路[ 11] 。
神经元内的钙离子超载引起的损伤的可能机制
包括:①胞内 Ca2+浓度异常增加 ,触发 Ca2+依赖的
级联反应 ,如 Ca2 +依赖的蛋白激酶 、磷脂酶 、蛋白
酶 、nNOS、核酸内切酶的激活 ,直接损伤靶细胞或产
生细胞毒性物质 ,如自由基等 ,最终导致神经细胞的
损伤和死亡;②线粒体内钙离子超载 ,钙离子抑制
ATP合成 ,最终使线粒体通透性转换孔 (PTP)呈高
通透状态 ,线粒体肿胀破坏 ,细胞能量耗竭 ,同时触
发其释放大量钙离子 ,致使细胞内超过承受钙离子
的限度时 ,可使多种酶激活 ,细胞功能紊乱 ,死亡;③
钙离子增加可能诱发细胞凋亡 ,一些可以轻度提高
钙离子浓度的物质如谷氨酸受体激活剂 ,在使钙离
子升高的水平低于可引起细胞坏死时即可诱导细胞
凋亡 [ 12 ～ 14] 。
Ca
2+超载与迟发性神经元凋亡的发生密切相
关。本研究也发现 ,体外培养大鼠海马神经元缺血 /
再灌注损伤后 ,细胞内 Ca2+荧光强度增高 ,缺血处
理 30 m in,细胞内 Ca2+荧光强度较对照组即见升
高;结合上述凋亡的研究 ,提示钙超载在缺血所致延
迟性脑损伤中的重要作用。
本试验用低糖低氧处理胎鼠海马神经元 ,以模
拟整体动物脑缺血时的病理症状 ,造成细胞内钙升
高 ,并观察药物对其升高的抑制作用 。实验结果表
明 ,低糖低氧处理胎鼠神经细胞可使细胞内钙明显
升高 。我们采用 LCSM动态观察活细胞钙的变化趋
势 , TSRP 10- 5、10-4 、10- 3 g L- 1能不同程度降低缺
氧损伤海马神经元细胞内 [ Ca2 +] i。提示 TSRP可
能通过降低细胞内 Ca2+超载 ,从而达到缺血所致延
迟性脑损伤中的保护作用。 TSRP降低缺氧损伤海
马神经元细胞内 [ Ca2 +] i较 N im表现出不同特点 ,
下降趋势缓慢 ,在观察过程中一直呈下降趋势。而
N im作用后 ,海马神经元细胞内 [ Ca2+ ] i开始下降
936 中国药理学通报　ChinesePharmacologica lB ulletin　2007 Ju l;23(7)
幅度较大 ,一定时间后下降趋缓 ,波动幅度不大 。提
示 TSRP降低缺氧损伤海马神经元细胞内 [ Ca2+ ] i
与 N im降低缺氧损伤海马神经元细胞 [ Ca2+ ] i机制
可能不相同 。茅莓总皂苷对缺血神经元的保护是通
过减轻细胞内的钙超载。 TSRP降低缺氧损伤海马
神经元细胞内 [ Ca2 +] i机制目前还不清楚 ,有待进
一步研究。
参考文献:
[ 1] 　江苏新医学院.中药大辞典 (下)[M ] . 上海:上海科学技术出
版社, 1986:2652:43 - 5.
[ 1] 　 Jiangsu New m edica l college. The dict ionary of trad itiona lCh inese
med icine[M ] . Shanghai:Shangh ai science＆ technology pub lish-
ers, 1986, 2652:43 - 5.
[ 2] 　朱志华 ,张惠勤 ,袁永军.茅莓的药理研究 [ J] .中国中药杂志 ,
1990, 15(7):43 -5.
[ 2] 　Zhu Z H , Zhang H Q , Yuan Y J. Pharm aco logy study of rubus
parvifoliu s[ J] . China J Ch in Ma terM ed, 1990, 15(7):43 - 5.
[ 3] 　郑永玲 ,胡常林.茅莓提取物对局灶性脑缺血的实验研究 [ J] .
中医药研究 , 2002, 18(2):37 - 9.
[ 3] 　Zh ong Y L, H u C L. The experim en t s tudy of focal cerebral ische-
m ic treated by rubus parvifo lius[ J] . Res Trad it Ch in Med, 2002,
18(2):37 - 9.
[ 4] 　王继生 ,邱宗荫 ,夏永鹏 ,等.茅莓总皂苷对大鼠局灶性脑缺血
的保护作用 [ J] .中国中药杂志 , 2006, 32(2):141 - 3.
[ 4] 　Wang J S, Q iu Z Y, X ia Y P, et a.l The p reotective effects of the
total g lucosides of Rubu sparvif lolius L on cereb ral ischem ica in rat
[ J] . Ch in J Trad i Ch in med, 2006, 32(2):141 - 3.
[ 5] 　Tau skela S, M orley P. O n the role of C a2+ in cereb ral ischem ic
p recondi tion ing[ J] . CellCa lcium , 2004, 36(4):313 - 22.
[ 6] 　Osh ikaw a S, M iyake K , Tak agi N , et a.l E ffects of m onoch loro-
bimane on cerebral ischem ia-induced dam age tom itochond ria[ J] .
B iol Pharm B ul l, 2004, 27(2):166 -9.
[ 7] 　M atsuda T, A rakaw a N, Takum a K, et a.l SEA0400, a novel and se-
lect ive inh ib itor of the Na+ J-C a2+ exchanger, at tenuates reperfu-
sion in ju ry in the in vitro and in vivo cerebral ischem icm odels[ J] .
J Pharm acolE xp Ther, 2001, 298(1):249 - 56.
[ 8] 　 ShanM , H aylettG C a2+ channels invo lved in the generation of the
s low after hyperpo larization in cu ltu red rat h ippocam pal py ram idal
neu rons[ J] . J Neurophysio l, 2000, 83(2):2554 -61.
[ 9] 　 Tym ianski M , W allace M C, Sp igelm an I, et a.l Ce ll-perm ean t
C a2+ chelators reduce early excitotox ic and isch em ic neu rona l in ju-
ry in vi tro and in vivo[ J] . Neuron, 1993, 11(5):221 - 35.
[ 10] M ody I, M acDona ld J F. NMDA recep tor-dependen t excitotox icity:
the role of in tracellu lar C a2+ release[ J] . Trends P ha rmaco l S ci,
1995, 16(4):356 - 9.
[ 11] S ch ramm M , E im erl S, C os ta E. Serum and depolarizing agen ts
cause acu te neuro-toxicity in cu ltured cerebellar granu le cells:role
of the g lutam ate recep tor respo-nsive toN-methyl-D-aspartate[ J] .
Proc Nat lAcad S ciUSA, 1990, 87:1193 - 7.
[ 12] M ayer M L, M iller R J. E xcitatory am ino acid recep tors, second
m essengers and regu lation of in tracellu lar Ca2+ inm amm alian neu-
rons[ J] . Trend sPharm acol Sci, 1990, 11:254 -60.
[ 13] X ia J, S im onyi A, SunG Y. Changes in IP3R1 and SERCA2bmR-
NA levels in the gerb il brain af ter chronic ethano l adm in istration
and transien t cereb ral ischem ia-reperfu sion [ J] . B ra in R es Mol
B ra in Res, 1998, 56(2):22 - 8.
[ 14] Pas tiL, C arm ignoto G, Pozzan T, et a.l C ellu lar ca lcium hand ling in
brain slices from calb ind in D28k-defcien tm ice[ J] . Neuroreport ,
1999, 10(1), 2367 - 72.
Effect of the total sapon ins ofRubus parvifolius on the
intracellular free calcium in ischem ic h ippocampal neurons
WANG Ji-sheng, Q IU Zong-y in, LIHui-zhi, ZHOU Cheng-lin
(Depmartm ent of Pharmacy, Chongqing University of Med ica l Science, Chongqing　400016, Ch ina)
Abstract:A mi 　To study the effect o f the to tal sapo-
nins o f Rubus parvifolius(TSRP)on the in trace llular
free calcium leve ls in ischem ic hippocampus neu rons.
Methods　The cy toso lic free calc ium concen tra tion in
ischem ic hippocampal neurons was measured by using
Ca
2+-sensitive fluorescen t probe fluo-2 /AM w ith a la-
ser scanning con focal m icro scope. Results　App lica-
tion of TSRP inhibited free in trace llular ca lcium in is-
chem ic hippocampus neu rons in a concentration-de-
pendent manner. Conclusions　These resu lts suggest
tha t TSRP m igh t protect h ippocampus neu rons via at-
tenuating ca lcium ove rload induced by ischem ia.
Key words　 the tota l saponins of Rubus parvifolius
(TSRP);hippocampus neurons;ischem ia;intracellu lar
ca lcium
937 中国药理学通报　ChinesePharmacologica lB ulletin　2007 Ju l;23(7)