全 文 ：皿庆医科大学学报 20 7 年第 3 2卷第 5期 ( Jo u r na l o f C ho ng qi ng M ed i a e. U niv ers iy t 20 7 . v o .3 2N o . s )一 4 9 8一
论 著 文章编号 : 0 3 2 5一36 26 ( 20 7 )0 5一04 9 8一04
制备高效液相色谱法从茅毒全草中分离悬钩子皂昔 R I
任凌燕 , 李惠芝 , 王继生 ,邱宗荫 ,周成林 ,徐 霞
(重庆医科大学药学院药物分析教研室 ,重庆 40() 0 16)
I摘 要】目的 :分离纯化茅萄全草中的一种皂昔类成分一悬钩子皂昔 R . 。 方法 :采用大孔吸附树脂与制备型反相高效液相色谱
组合分离技术 ,将茅墓水提醇沉后的粗制品经大孔吸附树脂柱色谱预分离后 , 再用 10 一 20 目硅胶柱色谱分离 , 用氯仿 一 甲醇
一 水 一 冰醋酸 ( 4 0 : 10 : l : .0 4% )洗脱 , 收集样品进行制备型 R P一 H P LC 纯化精制 。 结果 :产品经熔点 、 M s 、 IR 、 N M R 、 U v 和 HP LC 图
谱鉴定 ,并与文献比较 ,证明为悬钩子皂昔 R l ,其纯度 >9 8% 。 结论 :该方法较为简单可行 ,重复性好 ,采用的溶剂系统价廉易得 、
沸点低 、易于回收 ;悬钩子皂昔 R .产品可用做分析方法的对照品。
【关键词 】茅萄 ;悬钩子皂昔 R l ;制备高效液相色谱
【中国圈书分类法分类号】R 2 84 .2 【文献标识码】A 【收稿日期】20 6一 09一 21
P r e Pa r a t io n o f s u a v is s im o s jd e R l f r o m h e r b r u b i
Pa vr ifo lii b y P r e Pa rat iv e H P LC
R E N L i n 蔚望功 , e r 以
(D叩 art me n t of hP ar m ac e u z ie以 A n aly ` 15 , oC l le酬 of hP amr ac 少
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s tar o t lo勿e c t乞。 。 : T o d e v e lo p a m e th o d fo r th e is o la t io n a n d p u d if e a t io n o f , u a v i s s im o s id e R 、 for m H e r b R u h i p a vr ifo 一11.
几几忿九。 ds : M a e or p o or u , a d s o rP t i o n er s in a n d p er p a ar t i v e RP一 H PCL , t h e w a t e r e x tar o t s e d i m e n t a t e d b y e th a n o l w a , p邝一 is o la t e d by
a d s o印 t io n , s i n , a n d th e n afr o t io n a t e d by o o lu m n o h or m a t o脚 p hy o n s il io a 罗l ( 10 一 20 m e s h ) u s i n g o h lo or of rm 一 m e th a n o l一w a t e r一 a o e t i。
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10
: l : 0 4% )
.
T h e e o lle e t e d afr
e t io n w a s p u ir if e d of r s u a v is s i m o s id e R . b y p re p a ar t iv e RP一 H P L C w e re o o m b in e d as p , -
p a r e a t i
o n m e t h o d
. 刀召s ” l st : S u a v i s s i m o s id e R , w a ; id e n t iif e d h y m a s s s p e o tm m e t尽 ( MS ) , i n afr r e d , r e e t or m e t斗 ( IR ) , u lt r a v io le t
s
p
e e tor m
e t尽 ( U V ) , n u e le a r m铭 n e t ie re s o n a n e e ( N M R ) a n d h ig h p e orf rm a n o e li q u id e h or m a t o g r a p h y ( H p LC ) , a n d o o m p a er d w ith
th e 阳 le v a n t lit e ar t u 作 . T h e if n a l p u ir ty o f th e e o m p o u n d w a s m o er t h a n 9 8% . OC nc l舰名艺o n : T h e d e v e lo P e d m e thod i , , im Pl e , a n d
r e p or d u o i b le
.
Th e s o l v e n t 15 o h e a p
,
l o w in b o il in g p o in r a n d e a s il y er e o v e m d
.
Th e p odr
u e t o f s u a v is s im o , id e R一 。 a n b e u , e d a ,
er fe r e n o e , u h s t a n e e fo r a n a ly s is
.
【K e y w o rd s 】He r b ur h i p a vr ifo lii ; S u a v is s im o s id。 R , ; p er p a ar t iv 。 H p L C
茅墓 (R u b su 夕var lfo “ 舰 5 L
.
)为蔷薇科悬钩子
属植物 ,具有清热凉血 、 止血 、散结止痛 、 利尿消肿
等功效 ! ’ !。 文献报道茅葛根中含有悬钩子皂昔 R , 、苦
墓普 F , 等多个皂普类化合物附 l。 本课题组研究发
现 , 以茅葛全草为原料提取得到的茅葛总皂昔具有
治疗脑缺血的作用 4`1 。 而进一步研究茅葛中各种皂
昔类化合物的药理活性作用及其在体内的代谢情
况 , 以及开发茅墓类新药和常规分析检测 , 都需要
高纯度的皂昔类单体 。 为此 , 本文采用制备型 R P -
作者介绍 : 任凌燕 ( 19 7 8一 ) , 女 , 硕士 ,
主要研究方向 : 从事中药的研究与开发 。
蓦金项目 : 重庆市重大科技专项课题资助项 目【渝科发计字(2 0 4 ) 27
号 ]。
H P LC 色谱方法从茅葛全草中分离获得悬钩子皂昔
R I单体 。
1 仪器与试剂
L c 一6 A D 半制备型高效液相色谱仪 、 sP D一 l o vA p 紫外 -
可见检测器 、 C la s s 一 V P 色谱工作站 旧本岛津 ) ; S H IM A DZ U
U V 一24 01 P C 型紫外可见分光光度计 ( 日本岛津 ) ; F T IR一87 0
型付立叶红外分光光度计旧 本岛津 ) 、综合热分析仪 (型号 :
N EzT SC H ST A科 g e ,德国耐弛公司 ) ; B i o T o r Q质谱仪 (瑞
士 B ur k e r 公司 ) : 600 M H z 核磁共振波谱仪 ( 型号 : B ur k e r
AV 6 00 ) (瑞士 B ur k e : 公司 ) 。
茅墓药材采集于重庆市璧山县 , 经重庆市中药研究院生
药室李泉森副研究员 鉴定为蔷薇科悬钩子属植 物茅萄
DOI : 10. 13406 /j . cnki . cyxb. 2007. 05. 003
一 4 9 0 一 盆庆医科大学学报珊7 年第 3 2卷第 s 期 ( Jo u m a . o f C ho ng qi ng Md e记a . u niv ers 勺 2佣 , . V o l. 3 z N o · 5 )
而 b哪 , “ 恻伽瓦璐 L . 的干燥全草 ; 1D 01 型大孔吸附树脂
(天津农药股份有限公司树脂分公司 ) ; 柱色谱用硅胶 ( 10
目一 20 目 、 30 目一 4 X() 目 ;青岛海洋化工厂 ;) 薄层色谱硅胶
G F澎青岛海洋化工厂 ) ;其余所有试剂均为分析纯 。
2 方法与结果
色谱条件
分析色谱 色谱柱 : Kor m a s i l e 18 ( 25 o m m x
.4 6m m
,
5林m ) ;流动相 : 甲醇一 H cA 水溶液 ( p H二 .3 3)
( 52
: 4 8 ) ;流速 : l . o m Fm i n ;检测波长 : 20 8 n m ; 柱温 :
室温 ;进样量 : 2 0林l 。
2
.
1
.
2 制备色谱 色谱柱 : S H IM A D z u e l: ( 2 5 o m m x
Zom m
,
15林m ) : 流动相 : 甲醇一 HA。 水溶液 ( pH = 3 . 3 )
( 52
: 4 8 ) ;流速 : g m F m i n ;检测波长 : 20 8 n m ;柱温 : 室
温 ;进样量 : lml 。
.2 2 粗提取物的制备
将茅蓦全草 Z k g , 加 10 倍水煎煮 2 次 , 每次
l h
。 滤过 ,合并滤液 ,浓缩至一定体积 ,加乙醇至含
醇量达 50 % ,搅拌后静置过夜 。 滤过 ,减压回收乙醇
至无醇味 。 水溶液上已处理好的大孔吸附树脂
D 101 柱 (分别用酸 、碱冲洗后 ,用蒸馏水洗至流出液
呈中性为止 ) , 吸附 hl 后 ,依次用蒸馏水 、 40%乙醇
进行洗脱 ,收集 40 % 乙醇洗脱溶液 。 减压蒸干后 ,得
总皂昔浸膏 .2 5 9。 再将此浸膏以约 2 9硅胶拌样 , 采
用 125 9 硅胶湿法装柱 ,干法上样 ,进行硅胶柱色谱
分离 , 以抓仿一甲醇一水一冰醋酸 ( 40 : or : 1 : .0 4% )为
洗脱剂 , T LC 监测 ( 10%硫酸乙醇溶液为显色剂 ,展
开剂同洗脱剂 ) , 收集比移值 R「约为 .0 27 的流份 ,
合并此比移值下的相同流份 , 减压蒸干后 , 同法上
样 , 继续反复用硅胶柱层析洗脱 , 最后得黄白色粉
末约 15 o m g ( 目标化合物粗品 ) 。
.2 3 制备色谱分离
将上述粗品用 10 而 甲醇溶解 ,每次进样 l ml ,
收集保留时间约为 18 ~ 22m in 的组分 , 见图 1。 合并
所有收集的流出液 , 减压蒸去有机溶剂 ( 40℃以下 )
后置冷冻干燥箱内冷冻干燥 2h4 , 最后得到白色絮
状物 25 m g ( 目标化合物 ) 。
.2 4 样品纯度检测及结构鉴定
2 :4 1 晶形确认 取少许冷冻干燥絮状物于表面皿
中 ,加少量无水乙醇溶解 ,常温下放置 3 天 ,无色针
状结晶析出。
2
.
4
.
2 M o l i sh 反应和 L i e b e mr a n n 一B u cr h a dr 反应 结
果均呈阳性 ,证明其为三菇类皂昔类化合物 。
.2 .4 3 熔点测定 无明显的熔点 ,分解点 259 ~ 262 ℃ 。
.2 .4 4 薄层色谱检测 采用两种展开体系进行检测 ,
薄层板为 自制的 C Mc 一 N a 硅胶 G F , 板 。 展开剂为
氯仿一甲醇一水一冰醋酸 ( 4 0 : or : 1: 0 .4 % )时 , R f约为
.0 27 ; 展开剂为正丁醇一乙酸乙醋一水一冰醋酸 ( 30 :
20
: 6 : l) 时 , R ; 约为 .0 8 。 展开后 ,采用 1 0%硫酸乙
醇溶液显色后 ,至 or s℃下烘烤 s m in ,可见光下见蓝
色斑点 ,无其它杂质点 。
2 .4 5 紫外检测 目标化合物经紫外光谱扫描 ,结果
表明只在紫外末端略有强吸收 , 最大吸收波长为
2 0 7
.
8 n m
。
2 .4 6 HP L C 检测 目标化合物经分析型高效液相
色谱检测 ,经面积归一化法计算 ,其纯度大于 98 % ,
见图 2 。
.
己.二j1.
:
,白,自
2
.
4
.
7 结 构 鉴定 IR v肠石拟 e m 一 , : 34 14 、 2928 、 17 2 0 、
14 5 4
、
107 4
、
103 2
, 见图 3 。
E s l一 M s (而 z ) : 7 0 3 . 4 [M + N a ]+ 、 7 19 . 4 [M + K ]十 ,见
图 4 。
,
H 一 N M R ( C , D SN
,
6 X() M H
z
) 6
: 1
.
16
,
1
.
2 3
,
1
.
39
,
t庆医科大学学报 20 7 年第 3 2卷第 s 期 ( Jo ru a nl o f C ho ng qi ng M ed i ea l U niv er s iy t 20 , . v o l3 2 N o s ) 4 9 1
1
.
64
,
1
.
7 4 (各 3 H , s , s x C H 3 ) , 1 . 0 7 ( 3 H , d , J= 6 . SH z ,
CH 3C H )
,
2
.
9 3 ( I H
, s , H 一 18 )
,
4
.
2 1 一 4
.
4 7 ( 6 H
,
H 一 2 ’ ,
3
’ ,
4
’ ,
5
’ ,
6
’
)
,
5
.
5 5 ( I H
,
b r s
,
H 一 12 )
,
6
.
26 ( I H
,
d
,
J 二
8
.
2 H z
,
H一 l ’ )
,
1
.
0 8 ( H
一30 )
, 见图 5 。
, , C一 N M R ( C SD SN
,
600 M H : ) 8 : 4 8
.
3 ( C一 l )
,
68
.
4
( C
一2 )
,
8 0
.
8 ( C
一3 )
,
5 4
.
8 ( C 一4 )
,
5 2
.
0 ( C一5 )
,
2 1
.
2 ( C -
6 )
,
33
.
0 ( C
一7 )
,
40
.
4 (C
一 8 )
,
4 7
.
9 ( C一 9 )
,
38
.
5 ( C一 10 )
,
2 4
.
3 ( C
一 1 1 )
.
12 7
.
9 ( C
一 1 2 )
,
139
.
1 ( C 一 13 )
,
4 1
.
9 ( C -
14 )
,
2 8
.
9 ( C
一 1 5 )
,
2 6
.
5 ( C
一 16 )
,
48
.
0 ( C一 17 )
,
5 4
.
2 ( C -
18 )
,
72
.
4 ( C
一 19 )
,
4 1
.
9 ( C一20 )
,
26
.
7 ( C
一 2 1 )
,
37
.
5 ( C -
22 )
,
17 9
.
7 ( C
一23 )
,
13
.
2 ( C 一 2 4 )
,
17
.
1 ( C 一 25 )
,
17
.
2
( C
一26 )
,
2 4
.
6 ( C
一2 7 )
,
176
.
7 ( C一 28 )
,
28
.
5 ( C
一 29 )
,
16
.
6 ( C
一 30 )
,
95
.
6 (C
一 l ’ )
,
7 3
.
8 ( C一2
’
)
,
7 8
.
7 ( C一 3
’
)
,
7 1
.
0 ( C
一 4 ’ )
,
7 9
.
1 ( C
一 5 ’ )
,
6 2
.
1( C一6
’
)
, 见图 6 。
经以上光谱检测 , 其检测数据与与文献报道 l5]
的悬钩子皂昔 R : 的测定结果一致 ,确定该化合物为
悬钩子皂昔 R : , 其分子量 : 680 ,分子式 : C尹 58 0 : 2 。 经
H P LC 测定其纯度达到 98 % 以上 , 可用作分析的对
照品 。
3 讨 论
图 4 悬钩子皂昔 R l 的质谱图
本实验在采用高效液相色谱制备前 ,把提取的
样品进行了大孔吸附树脂及硅胶柱色谱预处理 , 以
去除样品中大量的杂质 ,利于 目标组分的分离和富
集 , 防止对色谱柱污染 。
图 5 悬钩子皂普 R l 的 I H一 N M R 谱图
一 4 9 2一 t庆医科大学学报 2侧” 年第 3 2卷第 5期 ( Jo u m a l o f C ho ng i q ng M ed ica l U n沁 ers 勺 2加 ,
.
V o l
.
3 z N o
.
5 )
图 6 悬钩子皂普 R I的 13 C一 N M R 谱图
在高效液相制备色谱分离纯化过程中 ,需要使
用大量的流动相作为洗脱溶剂 。 选择制备色谱的流
动相在考虑分离效率时 , 应该尽量依照组成简单 、
成本低廉及易回收处理的原则来选择 ,本研究首先
选择甲醇一水体系作为流动相 。 而制备型色谱条件
常是在分析型色谱条件基础上的适当放大 , 因此分
析型 R P 一HPCL 的参数在制备色谱中有重要参考价
值。
经优化 , 悬钩子皂昔 R , 的 HP Lc 分析条件中 ,
流动相选择甲醇一水 (52 : 48 ,冰醋酸调节 pH=3 . 3 ) 。
该流动相粘度适中 , 加人少量的冰醋酸调节溶液
p H 值 , 有利于增加溶质分子在反相键合相上的保
留时间 ,提高分离度和色谱的重现性 。
在分析型色谱条件基础上对制备型色谱的流
动相组成和流速进行研究 , 结果表明 : 当选择流动
相为甲醇一 HA。 水溶液 ( p H=3 . 3 ) ( 52 : 48 ;) 流速为
g m F m i n ; 进样量为 l m F m i n 时 , 目标组分主峰保留
时间约 20m in ,整个制备分离在 30 m in 内完成 。
(通讯作者 : 李惠芝 , 重庆医科大学教授 ,联系电话 : 0 23 -
684 85 72 7
、
68 806 27 8 )
(第一作者现工作单位 : 重庆科技学院 ,联系电话 : 02 3 -
66 350 83 9 )
参 考 文 献
l[] 江苏新医学院 .中药大辞典 (下 )l M] .第 2 版 ,上海 :上海科学技术
出版社 , 19 97 .26 9 .
12 王先荣 , 杜安全 .中药茅墓化学成分的研究 J[] .中国中药杂志 ,
19 9 4 ; 19 ( 8 )
: 4 8 5一 8 6 .
l3] 都述虎 , 冯 芳 , 刘文英 , 等 .茅毒化学成分的分离鉴定IJ] .中国
天然药物 . 2X() 5 ; 3 ( l ) : 17 一 20 .
41[ 王继生 , 邱宗荫 ,夏永鹏 , 等 .茅毒总皂昔对大鼠局灶性脑缺血
再灌注后神经细胞凋亡及相关蛋白 cB l一 2 , Bax 表达的影响 IJ] .中国
药理学通报 , 2仪巧 ; 2 2 ( 2 ) : 22 4 一 22 8 .
[5 ] F
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,
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n g 一h u a i C , Tan ak a T , e t al
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19 85 : 3 3 ( l )
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