全 文 ：一株芘降解菌的分离鉴定及其降解效果*
张巧巧摇 赵叶君摇 杨超光摇 刘奋武摇 何摇 健摇 沈摇 标摇 冉摇 炜**
(南京农业大学固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室, 南京 210095)
摘摇 要摇 以芘为唯一碳源,采用平板升华法,从徐州市卧牛山焦化厂周围污染土壤中分离得
到一株芘降解菌 SE12.经形态观察、生理生化试验和 16S rDNA 鉴定,该菌株属于分枝杆菌属
(Mycobacterium sp. )菌株,与快速生长型非致病性南非分枝杆菌(M. austroafricanum ATCC
33464)的同源性达到 98% . SE12 降解芘的最适 pH和温度为 pH 9 和 30 益 .当土壤芘初始含
量为 100 和 200 mg·kg-1, SE12 接种量为 107 CFU·g-1时, 30 益培养 28 d 后土壤芘降解率
分别达到 97%和 99% .利用双加氧酶基因的同源序列引物 nidAF / nidAR和 nidBF / nidBR进行
扩增,得出了该菌株编码双加氧酶大亚基和小亚基的基因片段,它们与已知降解芘的分枝杆
菌的双加氧酶基因具有高度同源性.
关键词摇 芘摇 微生物降解摇 16S rDNA鉴定摇 双加氧酶基因摇 分枝杆菌
文章编号摇 1001-9332(2010)07-1851-08摇 中图分类号摇 X53摇 文献标识码摇 A
Isolation, identification, and degrading effect of a pyrene鄄degrading strain SE12. ZHANG
Qiao鄄qiao, ZHAO Ye鄄jun, YANG Chao鄄guang, LIU Fen鄄wu, HE Jian, SHEN Biao, RAN Wei
(Jiangsu Key Laboratory for Solid Organic Waste Utilization, Nanjing Agricultural University, Nan鄄
jing 210095, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(7): 1851-1858.
Abstract: Using pyrene as the sole carbon and energy source, and by the method of plate sublima鄄
tion, a strain SE12 was isolated from a contaminated soil near Woniushan Coking Plant in Xuzhou,
China. According to the morphological, biochemical, and 16S rDNA analyses, this strain was iden鄄
tified as Mycobacterium sp. , with 98% of homology to the rapid鄄growth nonpathogenic strain M.
austroafricanum ATCC 33464. The optimum pH and temperature for the degradation of pyrene by
SE12 were pH 9 and 30 益 . When the soil samples were added with 100 and 200 mg·kg-1 of py鄄
rene and inoculated with 107 CFU·g-1 of SE12, the degradation rates of pyrene reached to 97%
and 99% , respectively after 28 days incubation at 30 益 . By using primer鄄pairs nidAF / nidAR and
nidBF / nidBR for amplification of ring鄄hydroxylating dioxygenase genes, it was shown that SE12 had
the fragments of encoded large and small subunits of dioxygenase genes. Sequence analysis showed
that these fragments were highly homologous to the known dioxygenase genes from pyrene鄄degrading
Mycobacteria sp.
Key words: pyrene; microbial degradation; 16S rDNA identification; dioxygenase gene; Mycobac鄄
teria sp.
*国家自然科学基金项目(20677027)资助.
**通讯作者. E鄄mail: ranwei@ njau. edu. cn
2009鄄12鄄06 收稿,2010鄄05鄄06 接受.
摇 摇 多环芳烃 ( polycyclic aromatic hydrocarbons,
PAHs)是石油与煤焦油的组成成分,但自然界的多
环芳烃主要形成于不完全燃烧过程,是土壤与沉积
物的重要污染物质[1] . 芘(pyrene)是具有 4 个苯环
的难降解稠环芳烃,在环境中检出率高,并常作为检
测 PAHs污染的指示物[2] . 由于大部分多环芳烃具
有“三致(致畸、致癌、致突变)冶效应,使 PAHs 对自
然界的生物和人类健康具有潜在的危险性[3] . 微生
物降解过程是 PAHs 在环境分解消失的主要途
径[4-5] .虽然许多研究表明一些微生物对 PAHs有降
解作用,但能够用于降解土壤或沉积物 PAHs 的菌
株的报道并不多, 细菌类 PAHs 降解菌研究较多的
有假单胞菌属(Pseudomonas)和分枝杆菌(Mycobac鄄
terium)属. 1994 年 Takizawa等[6]首先鉴定和测序了
假单胞菌菌株 OUS82 的两个分别编码降解三环
PAHs萘和菲的第一个酶(双加氧酶)和第二个酶
(顺式鄄二氢二醇脱氢酶)的基因 pahA和 pahB,2001
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 7 月摇 第 21 卷摇 第 7 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jul. 2010,21(7): 1851-1858
年 Khan等[7]首先从分枝杆菌菌株 PYR鄄1 克隆出降
解四环 PAHs 芘的两个分别编码芳香环鄄羟基化双
加氧酶 琢和 茁亚基的基因 nidA和 nidB,为分离和筛
选 PAHs降解菌株提供了分子生物学依据. 由于
PAHs降解细菌菌株的功能基因、代谢特征和地理
分布有较大差异[8-10],因此分离和筛选高效功能菌
株仍是开发利用微生物资源、认识基于植物根际微
生物或底泥微生物的降解作用以及进行野外土壤或
沉积物修复、或利用微生物修复技术处理 PAHs 污
染的重要工作.
本研究对采自徐州市卧牛山焦化厂周围的污染
土壤样品进行富集培养,分离获得了一株能以芘作
为唯一碳源的细菌,对其进行了菌种鉴定和功能基
因分析,测定了该菌株在液体培养和土壤条件下对
不同浓度芘的降解率,旨在为芘污染土壤的生物修
复提供科学依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 试验材料
1郾 1郾 1 土壤样品来源及培养基的选择摇 分离芘降解
菌的土壤样品采自徐州市卧牛山焦化厂周围煤焦油
污染土壤 (pH 8郾 7),分别在 10 个点各取 10 个表层
土壤(0 ~ 10 cm)样品,放于自封袋中,封口,置于
4 益冰箱保存.土壤芘降解试验土壤样品采自江苏
省扬中市滨江湿地表层,自然风干,过 2 mm 筛备
用,该土壤为砂性土壤,有机质含量为 1郾 1% ,土壤
中芘浓度低于高效液相色谱(HPLC鄄安捷伦 1200)
紫外检测器的检测限,未被测出.
PAHs降解微生物筛选采用无机盐基础培养
基[11]:每升蒸馏水中含 MgSO4 · 7H2O 0郾 2 g,
CaCl2·2H2O 0郾 01 g,FeSO4 ·7H2O 5 mg,KH2PO4
0郾 4 g,MnSO4·H2O 0郾 02 g,NH4NO3 1 g,Na2HPO4
0郾 6 g,pH 7郾 0 ~ 7郾 2. 固体培养基加入 2 %琼脂. 芘
用丙酮配成 1 g·L-1的母液,用 0郾 22 滋m 的有机滤
膜过滤灭菌后加入已灭菌的无机盐培养基中作为碳
源和能源.菌种保藏用牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏
5 g,蛋白胨 10 g,NaCl 5 g,琼脂 2 % ,调整 pH 7郾 0 ~
7郾 2,无菌 H2O定容至 1 L.
1郾 1郾 2 主要化学试剂及仪器 摇 多环芳烃 ( Pyrene,
97% ,分析纯,德国 Fluka公司),溶于甲醇配成标准
溶液.标线采用逐步稀释法配制.丙酮、乙酸乙酯、二
氯甲烷、正己烷均为分析纯,甲醇为色谱纯. 高效液
相色谱(HPLC鄄安捷伦 1200)配有紫外检测器;恒温
摇床.
1郾 2摇 试验方法
1郾 2郾 1 降解菌的分离与纯化摇 称取煤焦油污染土壤
样品 5 g,放入 45 ml 无菌水中,在摇床振荡30 min
后,将土壤悬液系列稀释至 10-3后取 0郾 1 ml 涂布到
无机盐固体培养基上,后快速用升华法在固体培养
基上形成芘膜[12] . 成膜方法如下:把接种后的平板
倒扣在底部平铺有固体芘的 500 ml的烧杯上,且用
封口膜将平板与烧杯的接口处封闭,后将整体放在
电炉上加热,使芘升华后,在平板遇冷而冷却吸附在
培养基上,制备好的培养皿放置于 30 益恒温培养箱
培养,观察微生物在固体培养基上的生长情况,并及
时挑选出能够产生透明圈的单菌落在营养肉汤培养
基上多次划线纯化,纯化后的菌株再接种于含芘膜
的无机盐平板上验证其降解能力. 以能在芘平板上
生长而不产生明显透明圈的菌株 SE1 作为对照
(CK),比较降解菌株透明圈的大小. 对照菌株经形
态观察和 16S rDNA 鉴定为芽孢杆菌属 (Bacillus
sp. ) .
1郾 2郾 2 菌株的鉴定摇 菌株形态和生理生化特性分析
参照文献[13].菌株透射电镜试验在南京农业大学
生命科学实验中心完成. 16S rDNA扩增及系统发育
分析参照文献[14]. 提取分离菌株基因组 DNA 作
为 PCR反应模板[15] . 16S rDNA序列的 PCR扩增引
物: 27f: 5 爷鄄AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG鄄3 爷;
1492r: 5爷鄄TACGGCTA CCTTGTTACGACTT鄄3忆[16] .反
应体系:50 滋l,10 伊Buffer (缓冲液) 5 滋l,Mg2+ (25
mmol·L-1) 4 滋l,dNTPmix (5 mmol·L-1) 2 滋l,上
下游引物(10 pmol·L-1) 各 2 滋l,模板 2 滋l,rTaq(5
U·滋l-1)1 滋l,ddH2O 32 滋l.反应程序:94 益预变性
5 min,然后进入循环,94 益变性 30 s,52 益退火
30 s,72 益延伸 90 s,35 个循环,最后 72 益延伸
10 min.
1郾 2郾 3 芘降解菌液体摇瓶降解效率摇 灭好菌的20 ml
无机盐培养基中加入 2 ml芘丙酮母液,振荡过夜至
丙酮完全挥发.取在液体牛肉膏中生长 3 d 的菌株
培养物,离心后经去离子水重悬后取 1 ml 接入无机
盐培养基中,在温度 30 益转速 170 r·min-1下振荡
培养,定时取样,分别测定生物量和培养基中芘的残
余量.以未接菌的含芘液体培养基为对照.每次测定
均设 3 个重复.采用平板稀释涂布法测定培养液中
的活菌数量.
1郾 2郾 4 环境条件对 SE12 降解芘的影响试验摇 1) 芘
初始浓度对 SE12 降解芘的影响试验:取 1 ml 菌液
接入 20 ml以芘为碳源和能源的无机盐培养基中,
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使初始芘的浓度为 50、100 和 200 mg·L-1,在温度
30 益转速 170 r·min-1下振荡培养;2) pH 对 SE12
降解芘的影响试验:取 1 ml 菌液接入 20 ml 事先用
2 mol·L-1的 HCl 或 NaOH 调好 pH 值分别为 5、6、
7、8、9 和 10 的含100 mg·L-1芘的无机盐培养基中,
在温度 30 益转速 170 r·min-1摇瓶中振荡培养;3)
温度对 SE12降解芘的影响:取 1 ml 菌液到 20 ml 含
100 mg·L-1芘的无机盐培养基中,在 20、25、30、35 和
40 益温度、pH为 8、转速 170 r·min-1下振荡培养.
1郾 2郾 5 降解菌对土壤中芘的降解效率试验摇 降解菌
对土壤中芘的降解效率试验参考胡淼等[17]的方法
进行.准确称取 100 g滨江湿地土壤样品放入250 ml
烧杯中,土壤样品中加入 1 g·L-1芘丙酮母液,使土
壤染毒浓度达到 100、200 mg·kg-1土壤(烘干质
量),烧杯放入通风橱中 24 h,每隔 30 min搅拌样品
一次,使丙酮完全挥发及使芘与土壤混合均匀,老化
7 d,维持含水率约 20% ,避光、通气、室温培养,定时
定量补水.本试验设 6 个处理:1) CK100:加芘 100
mg·kg-1,不接入降解菌,土壤不灭菌;2) CK200:加
芘 200 mg·kg-1,不接入降解菌,土壤不灭菌;3)
CK100S:加芘 100 mg·kg-1,不接入降解菌,土壤灭
菌;4) CK200S:加芘 200 mg·kg-1,不接入降解菌,
土壤灭菌;5) S100:加芘 100 mg·kg-1,土壤不灭
菌, 接入 SE12 菌悬液; 6) S200:加芘 200 mg·
kg-1,土壤不灭菌,接入 SE12 菌悬液. SE12 接入方
法为:取 SE12 纯培养菌液,在 10000 r·min-1下离
心获得菌体细胞,再将细胞用无菌去离子水重悬,使
菌悬液活菌数达到 109 CFU·ml-1, 取菌悬液 1 ml
稀释于 25 ml 无菌去离子水中混匀后加入土壤中,
使土壤中细胞数达到 107 CFU·g-1 .未接入 SE12 的
其他处理补入 26 ml 无菌去离子水. 每处理 3 个重
复.于第 0、3、7、14 和 28 天对染毒土壤定期采样分
析芘降解率.
1郾 2郾 6 芘的提取和分析摇 1) 摇瓶中芘的提取:将三
角瓶中的菌液全部倒入分液漏斗,加入提取剂乙酸
乙酯 40 ml提取 3 次,合并提取液于磨口三角瓶中.
在水温为 38 益的旋转蒸发仪中旋转浓缩至干[18] .
加 2 ml甲醇溶解,过 0郾 22 滋m有机滤膜后用高效液
相色谱(HPLC)测定,该方法的回收率达 97郾 6% . 2)
土壤中芘的提取:称取 2 g土样于 50 ml的玻璃离心
管中,加提取剂二氯甲烷 20 ml,盖紧后超声萃取
1 h,在 3800 rpm下离心 10 min,吸取 2 ml上清液过
2 g硅胶柱(硅胶在装柱前在 105 益下活化6 h),用
20 ml的二氯甲烷和正己烷(体积比 1 颐 1)的混合液
洗脱,洗脱液收集经旋转蒸发仪 38 益恒温蒸干,用
2 ml甲醇溶解,过 0郾 22 滋m滤膜后 HPLC 测定.流动
相为色谱甲醇,流速为 1 ml·min-1,检测波长为
254 nm,进样量为 20 滋l,测定时间为10 min[19] .
1郾 2郾 7 芘降解菌 SE12 降解基因序列分析 摇 采用基
于菌株 Mycobacterium vanbaalenii sp. nov郾 的芳香环
羟基化双加氧酶 琢和 茁亚基基因 nidA和 nidB 序列
设计的引物分析 SE12 菌株的降解芘的基因. 采用
PCR分析基因 nidA 和 nidB 的引物对序列分别为:
nidAF, 5 爷鄄ATGACCACCGAAACAACCGGA鄄3 爷, ni鄄
dAR,5爷鄄TCAAGCACGCCCGCCGAATGC鄄3爷; nidBF,
5 爷鄄ATGAACGCGGTTGCGGTCGAT鄄3 爷, nidBR, 5 爷鄄
CTACAGGACTACCGACAGG TT鄄3爷 [10] . PCR 扩增的
反应程序为:94 益下预变性 5 min;94 益下变性
50 s,63 益下退火 50 s,72 益下延伸 1 min,30 次循
环;72 益下再延伸 7 min,4 益下保存[12] . PCR 扩增
产物送上海英骏生物技术公司完成测序. 测序结果
通过在线分析(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov),与
GenBank 中的 16S rRNA 基因序列进行相似性比较,
并用 Mega 3郾 1 等软件进行系统进化分析,以 Kimu鄄
ra2鄄Parameter Distance模型计算进化距离,用 Neigh鄄
bor鄄Joining法构建系统发育树,通过 1000 次随机抽
样,计算自引导值(Bootstrap)以评估系统发育树的
置信度.
1郾 3摇 数据处理
采用 Excel 2003 和 SPSS 13郾 0 对数据进行整理
和分析.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 降解菌分离与筛选
经过对徐州市卧牛山焦化厂周围污染土壤样品
进行多次分离试验,分离得到 13 株以芘为唯一碳源
生长的菌株,将这些菌株接种于含有芘膜的无机盐
固体平板上,恒温 30 益下培养 20 d 后,观察和比较
是否产生降解透明圈及透明圈的大小. 从图 1 可以
看出,菌株 SE12 在含有芘膜的无机盐培养基上产
生了明显的透明圈,而对照菌株 CK没有产生.
2郾 2摇 菌株的鉴定
菌株 SE12 在 LB培养基上 7 d出现肉眼可见的
清晰菌落,但在 PDF 培养基上的生长速度较 LB 平
板上快.在 LB平板上菌落起初为乳白色,之后颜色
逐渐变深,最后呈橘黄色;菌落均呈规则圆型,中间
略凸起,表面光滑,边缘整齐,质地粘稠.在透射电子
显微镜下观察(图2),菌体都为细长杆状略有弯曲,
35817 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张巧巧等: 一株芘降解菌的分离鉴定及其降解效果摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 菌株 SE12 和芽胞杆菌对照菌株在含有芘膜的固体平
板上的生长状况(培养 20 d)
Fig. 1摇 Strain SE12 and CK strain (Bacillus sp. ) grown at solid
culture medium coated with pyrene (incubated for 20 d).
图 2摇 菌株 SE12 单菌株在透射电镜(伊4000)下的形态
Fig. 2 摇 Cellular morphology of SE12 strain under transmission
electron microscope (伊4000).
不产生孢子,不运动,无芽孢,无荚膜.革兰氏染色弱
阳性,抗酸染色为阳性. 菌株的生理生化性状见表
1 .根据形态和生理生化特征初步鉴定SE12为快速
表 1摇 菌株 SE12 的生理生化鉴定特征
Tab. 1 摇 Identifying physiological鄄biochemical characteris鄄
tics of strain SE12
项目 Item 结果
Result
接触酶 Catalase +
脲酶(7 天)Urease (7 days) ++
5%NaCl生长 5% Sodium chloride +
硝酸盐还原 Nitrate reduction +
亚硝酸盐还原(7 天)Nitrite reduction (7 days) +
45 益生长 Growth at 45 益 -
卫矛醇 Galactitol +
柠檬酸盐 Citrate -
甘露醇 Mannitol +
阿拉伯糖 Arabinose +
海藻糖 Trehalose +
鼠李糖 Rhamnose +
铁离子吸收(3 周) Iron ion absorption(3 weeks) ++
果糖 Fructose +
木糖 Xylose +
葡萄糖 Glucose -
肌醇 Inositol +
半乳糖 Galactose +
苹果酸 Malic acid +
琥珀酸 Butanedioic acid +
草酸 Dicarboxyl -
暗产色素 Scotochromogenic pigment +
谷氨酸钠葡萄糖培养基 Sodium glutamate and glucose -
+:阳性 Positive; -: 阴性 Negative; ++: 强阳性 Strongly positive.
生长型、暗产色分枝杆菌菌株.
摇 摇 利用细菌 16S rDNA 的通用引物进行扩增,最
终得到 1403 bp 的基因序列 ( GenBank 登录号为
GU134623).将基因序列在 GenBank 上进行序列同
源性比较,下载相似性大于 96%的 16S rDNA 序列,
对其进行系统发育树的构建如图 3.从中可以看出,
菌株SE12与南非分枝杆菌(Mycobacterium austroaf鄄
图 3摇 基于分枝杆菌 SE12 和亲缘关系相近的分枝杆菌的 16S rDNA序列的系统发育树
Fig. 3摇 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of SE12 and sequences of relating species.
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ricanum ATCC 33464)聚于一类,同源性达到 98% .
综合菌株形态和生理生化特征与 16S rDNA 系统发
育树位置,可确定 SE12 为分枝杆菌属菌株.
2郾 3摇 芘降解菌 SE12 降解基因序列分析
根据已报道的芳香环羟基化双加氧酶 琢 和 茁
亚基基因序列的引物对芘降解菌 SE12 基因组 DNA
进行 PCR扩增,获得了编码芳香环羟基化双加氧酶
琢 和 茁亚基基因 nidA和 nidB片段(图 4),大小分别
约为 1500 bp和 600 bp. GenBank授予 SE12 nidA和
nidB的登录号分别为 GU586859 和 GU586860.将序
列输入 GenBank以 Blast软件进行序列分析,比对结
果表明菌株 SE12 nidA 与浅黄分枝杆菌(Mycobacte鄄
rium gilvum,登录号为 DQ537942)的 nidA 序列完全
相同,与 M. frederiksbergens、浅黄分枝杆菌菌株
PYR鄄GCK等的 nidA序列相似性为 99% . SE12 nidB
与分枝杆菌菌株 MCS 和 JLS (登录号分别为
AY330101 和 CP000580 ) 的 nidB 序列相似性为
99% ,与分枝杆菌菌株 Spyr1 A和 MHP鄄1 等的 SE12
nidA序列相似性为 98% .用 SE12 nidA和 nidB序列
图 4摇 菌株 SE12 双加氧酶基因 nidA 和 nidB 的 PCR 扩增产
物凝胶电泳图
Fig. 4摇 Gel electrophoresis of dioxygenase genes nidA and nidB
PCR production from strain SE12.
和下载的同源性进行聚类分析后构建发育树(图
5).从中可见,SE12 具有与所列分枝杆菌高度同源
的芳香环羟基化双加氧酶基因.
2郾 4摇 环境条件对菌株 SE12 芘降解率的影响
2郾 4郾 1 不同芘起始浓度 摇 在芘初始浓度为 50、100
和 200 mg·L-1的无机盐培养基中培养 15 d,芘的降
图 5摇 SE12 与亲缘关系相近的分枝杆菌 nidA (a)和 nidB (b)序列的系统发育树
Fig. 5摇 Phylogenetic trees based on the gene sequences of nidA (a) and nidB (b) from strain SE12 and closely related Mycobacterium strains.
55817 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张巧巧等: 一株芘降解菌的分离鉴定及其降解效果摇 摇 摇 摇 摇 摇
解率分别达到 86郾 4% 、96郾 4% 和 79郾 6% (图 6).
SE12 能将初始浓度 100 mg·L-1的芘在 15 d内几乎
完全降解,但当初始浓度低于或高于 100 mg·L-1时
降解率都有所降低,200 mg·L-1芘浓度时尤其明
显. 50 mg·L-1时在前 5 天对芘的去除率(65郾 9% )
均超过 100、150 和 200 mg·L-1,说明在降解前期 50
mg·L-1浓度的芘能够较好地被利用.从第 6 天开始
随着培养时间的延长,初始浓度为 100 mg·L-1芘的
去除率明显高于其他两个浓度,而且降解速度较快.
培养液由透明液体变成淡橘黄色的浑浊液体表明有
SE12 菌株生长.
2郾 4郾 2 不同 pH 下芘的降解摇 不同 pH 下菌株 SE12
对芘的降解效果有所不同.从图 7 可以看出,菌株在
pH 5 ~ 10 范围内均能降解 100 mg·L-1的芘,培养
7 d的降解率都超过了 60% ,说明此菌株具有较强
的环境适应能力,但中性及偏碱更适合芘的降解,在
pH值为9时降解效果最好,降解率达到97郾 1% ,故
图 6摇 不同芘浓度下 SE12 的降解曲线
Fig. 6 摇 Pyrene degradation by strain SE12 in different pyrene
concentrations (mean依SD).
图 7摇 不同初始 pH值下芘的降解率
Fig. 7 摇 Pyrene degradation of SE12 under different initial pH
values (mean依SD).
不同字母表示差异显著(P <0郾 05) Different letters meant significant
difference at 0郾 05 level. 下同 The same below.
选择最佳降解 pH值为 9郾 0.
2郾 4郾 3 不同培养温度对芘降解的影响摇 由图 8 可以
看出,菌株 SE12 对温度的适应范围较广,在 25 益 ~
40 益,菌体数量均大于 1伊107 个·ml-1,芘得到一定
程度的降解. 35 益下培养 7 d,芘的降解效果最好,
降解率达到 85郾 2% . 30 益 下芘降解率虽然低于
35 益,但从活菌数可以看出这两种温度对 SE12 降
解芘的影响差异不大,无论是降解率还是活菌数都
很接近.而当培养温度低于 25 益或高于 40 益时,芘
的降解率明显下降.
2郾 5摇 降解菌对土壤中芘的降解效率
在芘初始浓度为 100 和 200 mg·kg-1的土壤
中,添加菌株 SE12 的菌悬液 1 ml(即处理 S100 和
S200),30 益 培养 28 d. 灭菌土对照 CK100S 和
CK200S在培养过程中减少了 8%和 14%,非灭菌土
对照 CK100 和 CK200 在培养过程中降低了 45%和
37%,加菌株 SE12 处理 S100 和 S200 的降解率分别
为97%和99% ,比CK100和CK200高52%和62% .
图 8摇 不同培养温度对芘降解的影响
Fig. 8摇 Effect of different temperatures on pyrene degradation by
SE12 (mean依SD).
图 9摇 不同处理土壤中芘的残留浓度
Fig. 9摇 Residual concentrations of pyrene in soil under different
treatments (mean依SD)郾
6581 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表明土壤中的一些土著微生物对芘也具有一定程度
的芘降解能力,接种菌株 SE12 后加入土壤中的芘
几乎全部被降解(图 9).
3摇 讨摇 摇 论
通常 PAHs 降解菌主要从石化厂和炼焦厂等
PAHs长期严重污染的土壤中分离,这类来源的降
解菌可能对较多种类 PAHs 都具有较强的降解能
力[4] .图 1 中对照菌株是一株芽胞杆菌属(Bacillus
sp. )菌株,虽然它能在芘平板上生长但没有明显的
透明圈,推测该菌株分泌降解酶的能力弱.在以芘为
唯一碳源的平板上能产生透明圈,表明 SE12 菌株
能利用芘且具有较强的分泌相关酶活性[20] .
分枝杆菌属于放线菌科,是含有 94 个种、进化
关系与生物化学分化非常复杂、在生物技术和生态
环境中十分重要的一个属[21-22] . 目前,根据自然生
境和分类特征将其划分为两组,即慢速生长型和快
速生长型.慢速生长型主要寄生在动物体内,一些是
人体病原菌;快速生长型广泛存在于自然界土壤和
水体环境中,几乎全部都是非病原菌[21-22] . 图 2 中
所有菌株[包括与 SE12 菌株同源性最高的南非分
枝杆菌(M. austroafricanum)]都是快速生长型、非
致病性分枝杆菌[21-22] . 有趣的是,虽然南非分枝杆
菌标准菌株 ATCC33464 对菲、荧蒽或芘的降解能力
十分有限[23],但许多从石化工业和垃圾填埋场污染
土壤中分离得到的 PAHs 和甲基叔丁基醚(MTBE)
降解菌株却与南非分枝杆菌有很高的同源性,表明
南非分枝杆菌在污染自然净化和污染修复中起重要
作用[23-28] .此外,本研究利用 PCR 技术也扩增出了
芘降解必需的编码芳香环羟基化双加氧酶 琢 和 茁
亚基的基因 nidA和 nidB,从基因水平上证明了菌株
SE12 能够降解芘的原因[7] .
对降解过程的研究表明,SE12 具有高效降解芘
的能力. 在以芘为唯一碳源和能源的培养基中,
SE12 菌株衰亡期的出现与芘的含量减少是一致的,
该结果与李全霞等[12]的报道相似. SE12 菌株降解
芘的最佳 pH 条件为 pH 9郾 0,可能与徐州市卧牛山
焦化厂周围煤焦油污染土壤偏碱性(pH 8郾 7)有关.
Habe等[29]报道的分枝杆菌菌株 MHP鄄1 对芘降解有
相同的最佳 pH 条件. SE12 降解芘的最适温度为
30 益,表明夏季高温季节可能是 PAHs 自然净化和
生物修复的最适条件. 此外,SE12 在土壤中较高的
芘降解率也可能与供试土壤质地粗、有机质含量低、
芘对微生物的有效性高有关[30] .
PAHs降解过程中间产物的积累与参与降解的
生物有关.人体内 PAHs 的降解中间产物主要是羟
基化中间产物如 1鄄羟基芘(1鄄Hydroxypyrene),它与
PAHs空气污染有直接关系[31] . 真菌对芘的降解中
间产物主要为反式鄄4,5鄄二氢二醇芘( trans鄄4,5鄄di鄄
hydrodiol pyrene),该产物对哺乳动物无毒,它会在
其他酶的作用下进一步分解或形成葡萄糖苷结合
物[32] .虽然在分枝杆菌菌株的代谢物中检测到少量
反式鄄4,5鄄二氢二醇芘,但主要为顺式鄄4,5鄄二氢二醇
芘,该产物在 48 h时浓度达到最高,在 72 h 时被进
一步氧化而消失,因此推测生成顺式鄄4,5鄄二氢二醇
芘是分枝杆菌降解芘的速率限制步骤,其后的步骤
为快反应,几乎不发生中间产物积累[33] .此外,应用
14C同位素示踪技术检测发现,14C 标记态萘和蒽在
天然和石油污染的沉积物中几乎没有中间产物积
累,分解产物为14CO2 [34] .因此,推测 SE12 在降解芘
过程中积累中间代谢产物的可能性不大.
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作者简介摇 张巧巧,女,1985 年生,硕士研究生. 主要从事环
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责任编辑摇 肖摇 红
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