全 文 ：氯嘧磺隆对土壤微生物群落结构的影响*
盛摇 宇1,2 摇 徐摇 军2 摇 刘新刚2 摇 董丰收2 摇 张昌朋2 摇 路彩红2 摇 郑永权2**
( 1 东北农业大学农学院, 哈尔滨 150030; 2 中国农业科学院植物保护研究所农业部农药化学与应用重点开放实验室, 北京
100193)
摘摇 要摇 采用磷脂脂肪酸(PLFA)法研究了黑龙江省苇河地区不同氯嘧磺隆施药历史下土壤
微生物群落结构的差异, 并测定了土壤中氯嘧磺隆的残留量. 结果表明:不同施药历史下氯
嘧磺隆在土壤中的残留量均很低;随着施用氯嘧磺隆年限的增加,土壤微生物的 PLFA总量减
少, 革兰氏阴性菌 /革兰氏阳性菌(GN / GP)和真菌 /细菌比降低,土壤微生物的压力指数增
加.主成分分析表明,氯嘧磺隆显著改变了大豆田土壤微生物群落结构.
关键词摇 氯嘧磺隆摇 土壤微生物群落结构摇 磷脂脂肪酸
文章编号摇 1001-9332(2010)11-2992-05摇 中图分类号摇 S154. 3摇 文献标识码摇 A
Effects of chlorimuron鄄ethyl on soil microbial community structure in soybean field. SHENG
Yu1,2, XU Jun2, LIU Xin鄄gang2, DONG Feng鄄shou2, ZHANG Chang鄄peng2, LU Cai鄄hong2,
ZHENG Yong鄄quan2 ( 1College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Haerbin 150030,
China; 2Ministry of Agriculture Key Laboratory of Pesticide Chemistry and Application, Institute of
Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China) . 鄄Chin. J.
Appl. Ecol. ,2010,21(11): 2992-2996.
Abstract: By using phospholipid fatty acids (PLFA) method, this paper studied the soil microbial
community structure in the soybean fields with different chlorimuron鄄ethyl application history in
Weihe district of Heilongjiang Province. In the meantime, the residual amount of chlorimuron鄄ethyl
in soil was determined. There was a very low residual of chlorimuron鄄ethyl in soil under the
conditions of different chlorimuron鄄ethyl application history. With the increasing year of chlorimu鄄
ron鄄ethyl application, the total concentration of soil microbial PLFA and the ratios of fungi / bacteria
and Gram negative / Gram positive bacteria decreased, and the microbial stress level increased.
Principal component analysis ( PCA) showed that long鄄term application of chlorimuron鄄ethyl into
soybean field changed the soil microbial community structure significantly.
Key words: chlorimuron鄄ethyl; soil microbial community structure; PLFA
*中国农业科学院植物保护研究所中央级公益性科研院所基本科研
业务费专项(2010YW12)资助.
**通讯作者. E鄄mail: yongquan_zheng@ yahoo. com. cn
2010鄄04鄄02 收稿,2010鄄08鄄31 接受.
摇 摇 氯嘧磺隆(也称豆磺隆,chlorimuron鄄ethyl)是 20
世纪 80 年代美国杜邦公司开发的一种磺酰脲类除
草剂,具有杀草谱广、超高活性、高选择性、可混性强
等特点[1] .自 20 世纪 90 年代大面积使用以来,一直
是大豆田化学除草的主要品种,在东北地区广泛使
用 郾 氯嘧磺隆在土壤中残效期长,属长残效除草
剂[2] .长残效除草剂连续多年使用可能在土壤中持
续积累,在连作或轮作农田中造成后茬敏感作物的
减产或绝产,影响农业种植结构的调整及土壤资源
的可持续利用[1] .
土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的部分,
在推动土壤物质转换、能量流动和生物地化循环中
起着重要作用,是土壤环境质量评价的一个主要指
标[3] .农药喷施以后,会大部分进入土壤,对土壤微
生物生物量及其活性产生影响,引起土壤微生物群
落结构的改变,进而影响土壤生物学功能;许多土壤
微生物指标如土壤微生物量、酶活性和微生物群落
结构与功能多样性的变化都能反映出土壤质量和健
康状况[4-6] .其中,土壤微生物群落结构和多样性能
较早地反映土壤环境质量的变化过程,并揭示微生
物的生态功能差异,被认为是评价土壤环境质量健
康与否的最敏感的生物学指标之一[7-10] .但是关于
长期施用氯嘧磺隆的农田土壤微生物群落结构和多
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 11 月摇 第 21 卷摇 第 11 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Nov. 2010,21(11): 2992-2996
样性的研究尚未见报道.
由于传统的培养方法只能观察到不到 5%的土
壤微生物群落, 这给土壤微生物数量、组成和生态
分布的测定带来了很多困难. 无需分离培养的新方
法被陆续引入土壤微生物分析中,如微平板法
(BIOLOG)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、磷脂脂
肪酸(PLFA)分析等近年来得到广泛应用,弥补了传
统培养中微生物多样性信息丢失的弊端,更真实可
靠地反映土壤微生物的组成情况. 其中,PLFA 方法
是根据不同类群微生物的指示性 PLFA 的不同,通
过提取和分离指示性 PLFA,定量测定可繁殖或有潜
在繁殖能力的不同类群微生物生物量和总生物量;
可用于表征在数量上占优势的土壤微生物,包括不
可培养微生物[11-13] .由于具有稳定的数量和快速的
周转速率,可以对环境因子的变化做出迅速的反应,
PLFAs已作为重要的环境指标,广泛用于表征污染
物胁迫下土壤微生物的群落结构变化[14-16] .
本文采用磷脂脂肪酸(PLFA)法研究了黑龙江
省苇河地区长期使用氯嘧磺隆对土壤微生物群落结
构的影响,旨在揭示长期使用氯嘧磺隆情况下土壤
微生物多样性的变化及群落结构的演变状况,为农
田土壤资源可持续利用和农药安全评价提供理论依
据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 样品采集
供试土壤采自黑龙江省苇河地区长期施用氯嘧
磺隆的大豆田,分别为连续施用氯嘧磺隆 1、2、3、5、
8 年和对照(两年内未使用任何农药和化肥)的土
壤.在调查地点选定 10 个大小均为 8 m伊8 m 样区,
样区间距大于 20 m,光照等微生境和土壤质地基本
相同.清除地面植物和凋落物,用土钻(直径 3 cm)
或者铁锹沿对角线取 0 ~ 15 cm 土层的土样,将 10
个点的土样混合为一个土样, 每个样区大约取土样
5 kg.土样带回实验室混匀,过 2 mm 筛,分为 3 份.
其一用于测定氯嘧磺隆残留量;其二立即冻干,低温
冰箱保存,用于 PLFA的测定;其三用于土样理化性
质的测定.供试土壤的 pH值为 4郾 64,有机质含量为
60郾 7g· kg-1,总氮量为 2郾 48 g· kg-1,速效磷为
14郾 23 mg·kg-1,速效钾为 249郾 56 mg·kg-1,阳离子
交换量为 106郾 38 cmol·kg-1 .
1郾 2摇 测定方法
1郾 2郾 1 土壤中氯嘧磺隆残留量的测定 摇 在叶贵标
等[17]方法基础上加以改进:准确称取土壤样品 10 g
于 50 ml 具塞离心管中,加入 8 ml 磷酸盐缓冲液
(pH 7郾 8, 0郾 2 mol· L-1)和 2 ml甲醇,涡旋 3 min,
4000 r· min-1离心 5 min,重复 3 次.合并上清液于
50 ml烧杯中,用 85%的磷酸缓冲液调节 pH至(2郾 5
依0郾 1). 上清液过 SPE鄄C18 小柱(Agela 公司). SPE
柱先用 5 ml 乙腈和 5 ml 提取液(用 85%磷酸调节
pH值至 2郾 5),上样,控制流速 1 ml· min-1,样品过
完后,抽真空 10 min,最后用 3 ml乙腈:pH 7郾 8 磷酸
盐缓冲液(9 颐 1, V / V )洗脱,收集洗脱液,N2 吹定
容至 1 ml进行测定.
采用超高效液相色谱鄄串联质谱 ( ACQUITY
UPLC鄄TQD,Waters 公司),三重四级杆检测器测定.
BEH C18色谱柱(Waters 公司,2郾 1 mm伊50 mm,1郾 7
滋m),采用二元梯度洗脱分离,梯度洗脱流动相参数
见表 1;进样体积 3 滋l.质谱条件为:电喷雾离子源,
正离子电离(ESI+);锥孔电压 30 V,碰撞能量 15 V;
采用 MRM多反应离子检测模式,定性离子对 414郾 8
>212郾 9、414郾 8>120郾 9、定量离子对 414郾 8>185郾 9.
1郾 2郾 2 土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA)的测定 摇 采
用改进的 Frostegard等[18]的方法: 1)提取.称 5 g冻
干土样加入 4 ml柠檬酸缓冲液,5 ml氯仿,10 ml甲
醇 (柠檬酸缓冲液 颐 氯仿 颐 甲醇 = 0郾 8 颐 1 颐 2),
25 益避光振荡 2 h,2500 r·min-1离心 10 min,重复
操作,取上清液.再加入 7 ml 柠檬酸缓冲液和 8 ml
氯仿,震荡 1 min.静置,待分层后吸走上层(约 2 / 3)
保留的底层氯仿相,在氮气流下吹干. 2)分离. 用
500 mg硅胶柱,用 6 ml氯仿、6 ml丙酮、6 ml甲醇和
3 ml的氯仿预处理硅胶柱,3 ml 氯仿溶解样品后注
入硅胶柱内,然后依次加入 6 ml 氯仿、6 ml 丙酮、3
ml甲醇,收集甲醇相在氮气流下吹干. 3)甲脂化.向
吹干样品中加入 1 ml 甲醇 颐 甲苯(1 颐 1)和 1 ml
0郾 2 mol·L-1 KOH甲醇溶液,漩涡 1 min,35 益水浴
15 min后冷却到室温,依次加入 2 ml 去离子水,0郾 3
ml 1 mol·L-1 HAc,2 ml 正己烷,漩涡混合 30 s,然
后 3000 r·min-1离心 10 min,重复提取 1 次,合并 2
次提取的正己烷相,氮气吹干,-20益冷冻保存,待
表 1摇 梯度洗脱参数
Tab. 1摇 Parameters for procedure of gradient elution
时间
Time
(min)
流速
Flow rate
(ml·min -1)
流动相 Mobile phase
甲 醇
Methanol (% )
0郾 02%甲酸水 0郾 02%
FA water (% )
0 0郾 3 10 90
3郾 0 0郾 3 90 10
3郾 1 0郾 3 90 10
5郾 0 0郾 3 10 90
399211 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 盛摇 宇等: 氯嘧磺隆对土壤微生物群落结构的影响摇 摇 摇 摇 摇
测.以 19 个碳的直链甲基酯(C19:0)作为内标物进
行定量.
总的 PLFA量表示微生物群落的生物量,14 种
PLFA(14:0、 i15:0、 a15:0、15:0、 i16:0、16:1棕7c、
2OH16:0、i17:0、cy17:0、17:0、18:0、22:1n9、22:0
和 23:0)量表示细菌生物量,其中 16:1棕7c、2OH16:
0 和 cy17:0 的量表示革兰氏阴性 ( gram鄄negative
bacteria,GN)细菌生物量, i15:0、 a15:0、 i16:0 和
i17:0 的量表示革兰氏阳性( gram鄄positive bacteria,
GP)细菌生物量,18:1棕9c、18:1棕9t、18:2棕6,9 和
18:3棕6 表示真菌生物量. cy17:0 / 16:1棕7c 表示微
生物的压力指数(stress level) [19] . Shannon 指数(H)
表示微生物群落丰富度,公式如下:
H =- 移pi lnpi
其中,pi 表示第 i种 PLFA与总 PLFA含量的比值.
1郾 3摇 数据分析
不同处理之间土壤微生物生物量的差异分析采
用单因素 Duncan 方差分析. 主成分分析( principal
component analysis,PCA)用于分析微生物群落结构.
统计软件采用 SPSS 17郾 0.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 氯嘧磺隆在土壤中的残留及其对土壤微生物
PLFA总量的影响
对不同施药历史的土壤样品进行测定表明,氯
嘧磺隆的残留量均低于 0郾 01 mg·kg-1 .
氯嘧磺隆在土壤中的残留量很少,本试验中采
样时间距最近施药期 11 个月,残留量小于 0郾 01 mg
·kg-1,说明其基本降解.
氯嘧磺隆对土壤微生物的磷脂脂肪酸(PLFA)
含量的影响如图 1.从中可以看出,长期施用氯嘧磺
隆的土壤与对照土壤的微生物 PLFA总量之间存在
图 1摇 氯嘧磺隆对 PLFA总量的影响
Fig. 1摇 Effect of chlorimuron鄄ethyl on total PLFA.
不同字母表示数据间差异显著水平(P<0郾 05) Different letter meant
significant difference at 0郾 05 level. 下同 The same below.
显著差异.连续施用氯嘧磺隆 1、2、3、5 和 8 年的土
壤中,总微生物量分别比对照土壤低 38郾 5% 、
47郾 1% 、49郾 3% 、51郾 5%和 57郾 3% . 说明长期施用氯
嘧磺隆会降低土壤微生物 PLFA 总量,且降低程度
随着施用年限的增加而增加.
2郾 2摇 氯嘧磺隆对土壤微生物群落结构的影响
2郾 2郾 1 革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌比值(GN / GP)
摇 由图 2 可以看出,不同施用年限的氯嘧磺隆分别
显著降低了土壤微生物中革兰氏阴性菌与革兰氏阳
性菌的比值.其中,连续施用氯嘧磺隆 5 年的土壤微
生物革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的比值仅达到对
照土壤的 49郾 1% .表明长期施用氯嘧磺隆可降低土
壤微生物中革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的比值,
且施用时间越长影响越大.
2郾 2郾 2 真菌 /细菌比摇 图 3 表明,土壤中真菌和细菌
的比值会受到氯嘧磺隆的影响. 除连续施药 5 年的
土壤外,其他施用年限的土壤中真菌与细菌比均有
不同程度降低.即长期施用氯嘧磺隆会影响土壤真
菌和细菌比例,降低了土壤生态系统的稳定性.
2郾 2郾 3 土壤微生物压力指数摇 由图 4 可知,不同施药
年限的土壤微生物压力指数均显著高于对照土壤.说
明施用氯嘧磺隆使土壤微生态环境受到了外源压力
胁迫,使微生物群落结构的压力指数显著升高.
图 2摇 氯嘧磺隆对革兰氏阴性菌 /革兰氏阳性菌的影响
Fig. 2摇 Effect of chlorimuron鄄ethyl on GN / GP.
图 3摇 氯嘧磺隆对真菌 /细菌比的影响
Fig. 3摇 Effect of chlorimuron鄄ethyl on fungi / bacteria.
4992 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
图 4摇 氯嘧磺隆对压力指数的影响
Fig. 4摇 Effect of chlorimuron鄄ethyl on stress level.
2郾 3摇 土壤微生物群落 PLFA的主成分分析
PLFA的主成分分析(PCA)结果表明(图 5),不
同施药年限处理与对照存在显著差异. 主成分 1
(PC1)和主成分 2 ( PC2 )共解释了样品总变异的
79% .不同施药年限主要集中在主成分 1(PC1)的正
方向.第 1 主成分正方向中,12:0、i16:0、2鄄OH16:0、
18:3n6、20:2、20:0 和 24:0 等的权重系数较大,主
要代表细菌和真菌. 连续施药 5 和 8 年处理主要集
中在主成分 2(PC2)的正方向. 第 2 主成分正方向
中,14:0、17:0 和 cy17:0 等的权重系数较大,主要
代表细菌.连续施药 1、2 和 3 年的土壤相距较近,说
明这 3 种土壤的微生物群落结构相近. 对照在主成
分 2 的零点附近,说明对照与主成分 2 的相关性不
大.综合分析,不同施药年限与对照土壤之间群落结
构有显著差异,长期施用氯嘧磺隆改变了土壤微生
物的群落结构.
图 5摇 土壤微生物群落 PLFA的主成分分析
Fig. 5 摇 Principle components analysis of PLFA from soil
microbial communities.
3摇 讨摇 摇 论
本研究通过调查不同施药历史的大豆田土壤,
发现氯嘧磺隆在不同施药历史土壤中的残留量均很
小,但长期施用氯嘧磺隆显著降低了土壤微生物
PLFA总量、GN / GP 比和真菌 /细菌比,同时使土壤
微生物的压力指数增大.
土壤微生物 PLFA总量的改变可以体现土壤中
微生物的生物总量的改变[20-21] . 于树等[20]通过对
PLFAs总量的测定研究了长期不同施肥处理情况下
玉米地土壤微生物总量的变化.本研究表明,长期施
用氯嘧磺隆显著降低了土壤微生物 PLFA 总量,即
土壤微生物总量减少.姚斌等[22]也发现施用甲磺隆
显著降低了土壤微生物的生物量. 氯嘧磺隆与甲磺
隆同属磺酰脲类除草剂,对土壤微生物的影响类似.
革兰氏阴性菌(GN)由于能够利用新的碳源而
发生显著改变[23],而革兰氏阳性菌(GP)有较厚的
细胞壁并且能够形成孢子,其种群较耐压从而不易
发生变化[24] .当环境发生变化时,GN / GP 可以反映
微生物群落结构的变化. 本研究中氯嘧磺隆显著降
低了 GN / GP,这可能是因为施用氯嘧磺隆减少了
GN的数量[25] .
真菌 /细菌比可反映真菌和细菌相对含量的变
化[18]和两个种群的相对丰富程度[26] . 此外,真菌 /
细菌比值越高表明农田土壤生态系统越稳定[27] .本
研究中长期施用氯嘧磺隆显著降低了真菌 /细菌比,
表明长期施用氯嘧磺隆使土壤生态系统稳定性降
低.而连续施药 5 年的大豆田土壤的真菌 /细菌比与
对照土壤差异不显著,可能是因为在田间土壤样品
采集、磷脂脂肪酸提取和分析过程中的误差所致.
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作者简介摇 盛摇 宇,女,1985 年生,硕士研究生.主要从事农
药残留与环境毒理研究. E鄄mail: shengyu326@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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