全 文 ：土 壤 (Soils), 2013, 45(3): 529–532


①基金项目：国家重大基础研究 973项目(2010CB126500-G)和国家自然科学基金面上项目(31170077)资助。
* 通讯作者(hmzheng@njau.edu.cn)
作者简介：杜寒春(1980—)，女，广西南宁人，硕士研究生，主要从事分子微生物学与生物固氮以及微生物分析检测研究。E-mail:
duhanchuncn@yahoo.com.cn


中慢生华癸根瘤菌 nodD-突变株的筛选
及其对紫云英的促生作用①
杜寒春1,2，高轶静1，郑会明1*，钟增涛1，朱 军1
(1南京农业大学生命科学学院，南京 210095；2 广西区分析测试研究中心，南宁 530022)
摘 要： 通过二亲接合的方式，将含有 sacB 基因和 nodD 基因部分片段的质粒与中慢生华癸根瘤菌
(Mesorhizobium huakuii)93(Mh93)菌株进行同源重组，在含 10% 蔗糖的 TY平板上成功地筛选到了 nodD基因突
变株 Mh93-27。利用温室盆栽试验研究了紫云英单作及紫云英-小麦间作体系 Mh93-27 对紫云英的促生作用，
结果表明，接种 Mh93-27后，紫云英的地上部生物量和全氮含量以及根部生长得到了不同程度的提高，但只有
在小麦孕穗期和收获期时，根瘤菌才表现出显著的促生作用。
关键词：中慢生华癸根瘤菌；sacB；nodD；紫云英；促生；氮素
中图分类号：Q939.96
豆科-禾本科间作体系是一种广泛的种植模式，
国内外学者对其进行了多方面的研究，目前已经研究
了由豆科作物蚕豆、花生、大豆以及豆科牧草苜蓿、
紫云英与小麦、玉米、水稻、禾本科牧草组成的十几
种复合体系。结果表明接种根瘤菌后，体系中的豆科、
禾本科植株的产量和氮素含量以及土壤氮素肥力均
有明显的提高[1-6]。对于豆科作物而言，根瘤菌的共
生固氮作用无疑是促进其氮素含量提高和生长的主
要原因。而对于禾本科作物而言，15N同位素示踪技
术表明这主要是因为体系中的豆科植物向禾本科作
物迁移氮素的结果[7-8]。
接种中慢生华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)
93(Mh93)的紫云英-小麦间作体系已被证明有利于促
进体系中小麦的生长[9]。有研究表明，根瘤菌对豆科
植物生长的促进作用除了固氮作用，还能在豆科植物
根圈定殖，根瘤菌作为根圈促生细菌(PGPR)的一种，
可以产生植物激素(如生长素、赤霉素、细胞分裂素
等)促进植物的生长发育，也可通过适当提高植物的
抗逆性从而间接促进植物的生长[10-12]。本文旨在研究
间作体系中根瘤菌的根圈促生作用对于豆科植物本
身的作用。
本研究通过基因框内敲除的方法对 Mh93 菌株
的结瘤调节基因 nodD进行失活，使其丧失结瘤固氮
能力。将含果聚糖蔗糖转移酶基因 sacB 基因[13]和
nodD基因片段的质粒，通过基因的同源重组，在 sacB
蔗糖平板中筛选 nodD基因缺失突变菌株。这种基因
框内敲除的方法不影响被敲除基因上下游基因的转
录与翻译，是最理想的筛选基因突变株方法之一。本
文即以该 nodD突变株作为主要供试材料，比较了紫
云英-小麦混作体系中紫云英地上部分及根部的生
长，探讨了根瘤菌的促生作用对紫云英生长的影响，
以期更准确地考察根瘤菌固定的氮素对紫云英的贡
献，为进一步研究根瘤菌固定的氮素转移后对小麦生
长的促进作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及生长条件 表 1 为本试验所
使用的菌株特性。根瘤菌在 TY 培养基中于 28℃ 培
养，大肠杆菌在 LB 培养基中于 37℃ 培养。
1.1.2 供试土壤和植物 供试土壤为采自江苏省
如皋市的高砂土，土壤的基本性状为：pH 8.1，有机
质含量 6.45 g/kg，全氮含量 0.12 g/kg，全磷含量 0.25
g/kg，速效氮含量 36.47 mg/kg，速效磷含量 6.29
mg/kg。供试紫云英和小麦品种分别为闽紫一号和杨
麦 158(半春性品种)。
DOI:10.13758/j.cnki.tr.2013.03.017
530 土 壤 第 45卷

表 1 供试菌株
Table 1 Strains used in study
菌株与质粒 特性 来源
华癸根瘤菌
Mh93
野生型 本实验室保存
Mh93Sm 链霉素自发突变株 本实验室保存
Mh93-27 nodD 基因框内敲除菌株，StrR 本实验室保存
大肠杆菌
SM10λpir pJZ1003接合宿主细胞, Str
s 本实验室保存
pJZ1003 含 traR、sacB 基因和 nodD 基因片段 本实验室保存
1.1.3 试剂和仪器 PCR 试剂为 TaKaRa 产品，
PCR 引物由上海博亚公司合成；生化与分子生物学
试剂购自南京生兴生物技术有限公司。庆大霉素
(Gen)450 µg/ml；链霉素(Str)100 µg/ml。
1.2 试验方法
1.2.1 nodD 基因的敲除 参照参考文献[13]描述
方法进行。
1.2.2 nodD-菌株的 PCR 检测 扩增的目的条带
为 500 bp的 nodD基因片段。所用引物序列分别为：
5ACTTGAGCAGGGCTGTGGC3和 5GTTGGAGCC
GTGCGGAGAA3。反应体系参照文献[14]描述方法
进行。将扩增产物直接进行 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳
确证。
1.2.3 结瘤实验 将获得的缺失菌株及其出发菌
株感染紫云英植物，观察结瘤情况。结瘤实验在试管
中进行，使用 Fahraeus无氮植物营养液[15]。
1.2.4 盆栽试验 试验在南京农业大学农业部作
物生长调控重点开放实验室的温室内进行。土壤处理
和小麦、紫云英种子的无菌发芽处理参照参考文献[9]
进行。将催芽后的紫云英种子分别置于 TY培养基和
细菌细胞浓度为 109/ml 的 Mh93 和 Mh93-27 菌悬液
中浸泡 2 h后播种。
试验设 6个处理，分别为：I组，紫云英单作，
6 株/钵，不接种根瘤菌；II 组，紫云英单作，6 株/
钵，接种 nodD-菌株 Mh93-27；III组，紫云英单作，
6株/钵，接种野生菌株 Mh93Sm；IV组，小麦-紫云
英间作，各 3株/钵，不接种根瘤菌；V组，小麦-紫
云英间作，各 3 株/钵，接种 nodD-菌株 Mh93-27；
VI 组，小麦-紫云英间作，各 3 株/钵，接种野生菌
株 Mh93Sm。每个处理设 3个重复。分别于小麦拔节、
孕穗和收获期采集植株样品分析测定。
1.3 分析方法
1.3.1 根体积 采用排水法测定。将收获的根系用
自来水冲洗干净后用吸水纸吸干，再置于量筒中测定
其体积。
1.3.2 植株全氮含量 植株分为地上部和地下部
分别收获后，样品经过 105℃杀青 0.5 h，60℃烘干后，
采用半微量凯氏定氮法进行测定[16]。
1.3.3 数据处理 采用 SPSS 软件进行统计分析
(方差分析和显著性检验)。
2 结果与分析
2.1 nodD基因缺失菌株的获得
2.1.1 nodD基因缺失菌株的PCR扩增确认 将经
过两次同源重组在蔗糖平板中失去Gen抗性的菌株提
取总 DNA 并进行 PCR 扩增检测(图 1)。结果发现，
菌株 Mh93-27 并未检测出 500 bp 的目的条带，表明
其 nodD 基因已经缺失。重复检测也得到同样的结果。



(1：Negative control；2：Mh93；3：Mh93Sm；4：Mh93-27；
M：Marker DL2000)
图 1 nodD基因片段的 PCR扩增检测
Fig. 1 PCR examination of nodD gene fragment

2.1.2 缺失菌株的共生结瘤能力验证 将 nodD
基因缺失突变株 Mh93-27 做结瘤实验，并用野生菌
株 Mh93 作为阳性对照。4 个星期后，可看到菌株
Mh93 正常结瘤，而突变株 Mh93-27 未结瘤，进一
步表明了其 nodD基因已缺失。
2.2 根瘤菌的促生作用
2.2.1 对紫云英地上部生物量及全氮含量的影响
如图 2所示，无论是单作或是与小麦间作，在小
麦孕穗期和收获期时，紫云英地上部的生物量及全氮
含量均明显比拔节期高(P<0.05)。接种 Mh93-27后，
紫云英的生物量及全氮含量均有提高，但不显著
(P>0.05)，表明根瘤菌的促生作用能促进紫云英的生
长，但效果不明显。接种野生菌株 Mh93后，紫云英
的地上部生物量和全氮含量均得到了显著的提高
第 3期 杜寒春等: 中慢生华癸根瘤菌 nodD-突变株的筛选及其对紫云英的促生作用 531



(I：紫云英单作不接种；II：紫云英单作接种 Mh93-27；III：紫云英单作接种 Mh93； IV：小麦紫云英间作不接种；
V：小麦紫云英间作接种 Mh93-27；VI：小麦紫云英混作接种 Mh93)
图 2 小麦各生长期紫云英地上部生物量(a)及全氮含量(b)变化
Fig. 2 Changes of above ground biomass (a) and total nitrogen of astragalus (b) in different growth stages of wheat



图 3 小麦各生长期紫云英根部生物量(a)及全氮含量(b)变化
Fig. 3 Changes of biomass of root (a) and total nitrogen of astragalus (b) in different growth stages of wheat

(P<0.05)，其中全氮含量的增加更为突出，这表明根
瘤菌的共生结瘤固氮作用仍然是促进紫云英生长的
关键因素。
2.2.2 对紫云英根体积、根部生物量及全氮含量的影
响 如图 3、图 4所示，无论在间作体系还是单作体
系中，接种野生菌株Mh93后，紫云英的根体积、根部
生物量及全氮含量均明显提高。而接种突变菌株
Mh93-27后，根瘤菌对紫云英的促生作用效果在两种体
系中不同。在单作体系中，紫云英的根部生长状况与不
接种的相比无明显改善(P>0.05)。在间作体系中，紫云
英生长到小麦孕穗期和收获期时，根部的生物量和全氮



图 4 小麦各生长期紫云英根体积的变化
Fig. 4 Changes of root volumes of astragalus in different growth
stages of wheat
含量与不接种的相比则有显著的提高(P<0.05)。
3 讨论
由于根瘤菌能够与豆科作物共生结瘤固氮为作
物生长提供氮素，其固定的氮素转移给禾本科作物后
也能明显地促进作物的生长[2-4]，研究者往往更关注
根瘤菌的固氮作用，而忽视了根瘤菌对作物生长的其
他促进作用，因而在多数情况下并未能真实地反映根
瘤菌固定的氮素及氮素转移作用对作物生长的贡献
作用。本研究中，Mh93-27菌株被敲除了 nodD基因，
失去了在紫云英上的结瘤固氮能力，但在紫云英-小
麦间作体系中，也能促进紫云英生长，表现为在小麦
孕穗期和收获期时对紫云英根部的生物量和全氮含
量均有显著的提高效果，说明除了固氮作用外，根瘤
菌的促生作用也能促进植物的生长发育。但这种促生
作用在地上部分生物量和全氮含量及紫云英单作体
系并不显著，这说明小麦在孕穗期之后其根系可能会
产生更多的根毛，表皮细胞或根冠的脱落物或者合成
了更多的氨基酸、植物碱或各种维生素[17]，大大地
改善了根际微生物的营养和能量，刺激了 nodD基因
突变株的生长，促生作用得到充分地发挥，从而表现
出显著性地促进了紫云英植株生长，这种现象在小麦
根部同样可以观察到[9]。在整个检测过程中可以观察
到在间作体系中紫云英的生物量和全氮含量水平均
532 土 壤 第 45卷

明显低于单作体系，根瘤菌对紫云英的促生作用效果
也较单作下更不明显，这可能是因为禾本科作物竞争
了部分土壤中的养分而影响了紫云英的生长。
尽管在小麦的整个生长期中，根瘤菌的促生作用
没有生物固氮作用的效果明显，但对此的深入研究不
仅可以更真实地反映根瘤菌固定的氮素及氮素转移
作用对作物生长的贡献，还可以明确根瘤菌对植物的
促生作用是多种作用机制共同作用的结果，这将有助
于进一步充分发挥根瘤菌在农业生产中的作用。
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Obtaining of nodD-strain of Mesorhizobium huakuii and Its Effect of
Growth-promoting on Astragalus
DU Han-chun 1,2, GAO Yi-jing2, ZHENG Hui-ming1*, ZHONG Zeng-tao2，ZHU Jun 1
(1 College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2 Guangxi Research Center of Analysis and Testing, Nanning 530022, China)

Abstract: A nodD-strain of Mesorhizobium huakuii, Mh93-27 was obtained and the effect of PGPR on astragalus was
studied in a single cropping of astragalus and the mixed cropping of astragalus-wheat. Homologous recombination between the
plasmid with sacB gene and nodD gene segment and symbiotic plasmid of Mh93 through parental mating could take place. nodD
gene could be deleted or cured on TY plate with 10% sucrose, thus the nodD-strain could be obtained. The pot-growing
experiment showed that the biomass and nitrogen content of astragalus increased after being inoculated with the nodD-strain of
Mh93,but the rhizobium showed obvious effect on astragalus only during the heading and harvest stages of wheat.
Key words: Mesorhizobium huakuii, sacB, nodD, Astragalus, Growth-promoting, Nitrogen