全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 052590205
枯草芽孢杆菌 sacB 基因的功能验证及应用
吴　菁1 　刘秀敏1 ,2 　张　维1 　陈　明1 　林　敏1
(11 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081 ;21 河北交通职业技术学院 ,河北 石家庄　050091)
摘 　要 :本研究将枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis)基因组 DNA 中克隆的 114 kb sacB 基因片段连接到表达
载体 pET228a ( + ) ,构建了 sacB 基因表达载体 pSacB。通过测定蔗糖水解产生的葡萄糖具有的还原性 ,
确定 sacB 基因产物具有蔗糖果聚糖酶活性。该基因表达后 ,导致大肠杆菌 ( Escherichia coli) 细胞不能在
含 5 %蔗糖的培养基中生存。同时发现 sacB 基因也能赋予耐辐射菌株 Deinococcus sp . BR501 蔗糖敏感
性。利用条件致死 sacB 基因的这一特性 ,我们分析了 D . sp . BR501 的突变率 ,结果表明DNA 错配修复
缺失突变株 (ΔmutS1)的突变频率明显高于野生型。因此枯草芽孢杆菌 sacB 基因可作为验证 DNA 损伤
修复能力的一种筛选标记。
关键词 :枯草芽孢杆菌 ; sacB 基因 ;蔗糖果聚糖酶 ;突变率
FUNCTIONAL IDENTIFICATION OF Bacillus subtilis sacb GENE AND ITS APPLICATION
WU Jing 　LIU Xiu2min 　ZHANG Wei 　CHEN Ming 　LIN Min
(11 Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100081 ;
21 Hebei Jiaotong Vocational & Technical College , Shijiazhuang , Hebei 　050091)
Abstract :In this study , the 114 kb sacB gene from Bacillus subtilis genomic DNA was cloned into the expression vector pET2
28a ( + ) . The product of gene sacB had the levansucrase activity determined by glucose release from sucrose hydrolysis. The
expression of sacB gene in Escherichia coli could cause cell death when exposed to 5 % sucrose in medium. And sacB gene
also confered a sucrose2sensitive phenotype for the extremely radiation2resistant bacterium , Deinococcus sp . BR5011 Using the
conditional2lethal gene sacB to analyze the mutation rates of Deinococcus sp . BR501 , we found that the rate of the DNA
mismatch repair deficient strain (ΔmutS1) was obviously higher than that of wild type strain. Our result suggested that B .
subtilis sacB gene could be used as a negative2selection marker to identify and characterize the genes involved in DNA demage
repair.
Key words : Bacillus subtilis ; sacB gene ;levansucrase ; mutation rate
收稿日期 :2008202228 　接受日期 :2008205211
基金项目 :国家高技术研究发展计划项目 (2004AA214170)课题和国家自然科学基金项目 (206700050)
作者简介 :吴　菁 (19822) ,女 ,河北石家庄人 ,硕士 ,从事极端环境微生物遗传工程的研究。Tel :010268919861 ; E2mail :wujing21224 @gmail . com
通讯作者 :陈　明 (19622) ,男 ,广东兴宁人 ,博士 ,从事分子生物学研究。Tel :010268975038 ; E2mail :chenmingbio @hotmail . com　　枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis)是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种 ,广泛存在于自然界。没有致病性 ,对人畜无害 ,不污染环境 ,具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用[1 ] 。 枯草芽孢杆菌 sacB 基因编码分泌型蔗糖果聚糖酶 ,该酶能催化蔗糖水解和合成高分子量的果聚糖。蔗糖果聚糖酶在食品、制药、化妆品和纺织工业中都有很广泛的应用前景[2 ,3 ] 。鉴于 sacB 基因具有合成果聚
095　 核 农 学 报　2008 ,22 (5) :590～594Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
糖的能力 , 1996 年 Caimi 等将细菌编码蔗糖果聚糖酶
的 sacB 基因转入玉米 ,使转化后的玉米获得了合成果
聚糖的能力[4 ] 。sacB 基因在植物中表达 ,可以明显提
高果聚糖的积累 ,增强植物的耐寒和耐旱能力[5 ] 。但
高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用 ,可
造成细胞死亡。已发现在 5 %或 5 %以上的蔗糖存在
下 , sacB 基因在革兰氏阴性菌 (如 E. coli , Erwinia
chrysanthemi 和Legionella pneumophila) 中的表达导致这
些细菌死亡[6 ,7 ] 。而 sacB 基因也使革兰氏阳性菌
Corynebacteriu glutamicum 以 及 分 支 杆 菌 如
Brevibacterium , Rhodococcus 等属的细菌获得蔗糖敏感
的特性[8 ,9 ] 。基于这种特性 , sacB 基因在遗传上被作
为一种阴性筛选克隆的标记应用于生物学的研究
中[10～12 ] 。
本研究从枯草芽孢杆菌中克隆 114 kb sacB 基因
片段 ,连接到大肠杆菌表达载体 pET228a ( + ) ,构建
sacB 基因表达载体 pSacB ,测定表达蛋白的酶活 ;将携
带有 sacB 基因的质粒转化到大肠杆菌中 ,验证 sacB
基因对宿主细胞在 5 %蔗糖存在下的致死作用。并分
析 sacB 基因表达对耐辐射菌株奇异球菌 Deinococcus
sp . BR501 的蔗糖敏感性 ,对该菌株错配修复缺失菌株
的突变频率分析结果表明 , sacB 基因可作为验证 DNA
损伤修复能力的一种筛选标记。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　试剂 　Taq 酶和 dNTP 为 TaKaRa 公司产品 ,
PCR 引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司
完成 ; p GEM2T克隆载体、限制性内切酶、T4 连接酶购
自 Promega 公司 ; Wizard PCR Preps DNA Purification
System 购自 Promega 公司 ;化学试剂为分析纯。
11112 　菌株和培养基　菌株和质粒见表 1。
E. coli 菌株于 LB 培养基 (蛋白胨 10gΠL、酵母粉
5gΠL、NaCl 10gΠL、pH 710) 37 ℃培养 ;D. sp BR501 菌株
于 TGY培养基 (蛋白胨 10gΠL、葡萄糖 1gΠL、酵母粉
5gΠL、pH 710) 30 ℃培养。验证蔗糖致死作用及突变频
率分析时 ,培养基中加入 5 %的蔗糖。需要加入抗生
素时 ,抗生素的终浓度为 : 氨苄青霉素 (Ampicillin ,
Amp) 50μgΠml ;卡那霉素 ( Kanamycin , Km) 50μgΠml ;氯霉
素 (Chloromycetin , Cm) 3μgΠml ,潮霉素 (Hygromycin ,Hyg)
100mgΠL。
112 　方法
11211 　总 DNA 的提取及常规遗传操作方法　总 DNA
的提取参照 Wilson 等的方法[14 ] 。酶切、酶连、转化及
其他的基因操作技术参照文献[15 ]的方法进行。
表 1 　菌株和质粒
Table 1 　Strains and plasmids
菌株和质粒
plasmids and strains
表型和基因型
genotype or phenotype
来源
sources
菌株 Strains
E. coli DH5α
supE44ΔlacU169
(ψ80 lacZΔM15)
hsdR17 recA endA
Nxr
本实验室 This lab
E. coli BL21(DE3) Host strain 本实验室 This lab
Bacillus subtilis Wild type strain (WT) 本实验室 This lab
Deinococcus
sp . BR501 WT 本实验室 This lab
[13 ]
D . sp .
BR501ΔmutS1
As WT , but HphR and
ΔmutS1
质粒 Plasmid
pET228a ( + ) Expression vector ,
Kmr
本实验室 This lab
pSacB
As pET228a ( + ) , but
carrying the sacB of
B . subtilis
本研究 This study
p GEM2T Cloning vector , Ap r Promega
pTSacB
As p GEM2T , but
carrying the sacB of
B . subtilis
本研究 This study
pRAD1
Shuttle plamid , Cmr
and Ap r
本研究 This study
pRSacB
As pRAD1 , but
carrying the sacB of
B . subtilis
Prof . Lidstorm 惠赠
A gift from Prof . Lidstorm
11212 　sacB 基因的 PCR 扩增 　以枯草芽孢杆菌总
DNA 为模板 ,以 Primer F(CATATGAAAAAGGAGACATG2
AAC) 和 Primer R ( GTCGACCAATAGGATATCGGC) (下
划线分别为 Nde I 和 Sal I 酶切位点) 为引物 ,进行
PCR反应。PCR 反应条件 : 94 ℃ 1min ; 94 ℃ 1s ,52 ℃
1s ,72 ℃1min ,30 个循环 ;72 ℃5min。
11213 　载体的构建和 sacB 基因在大肠杆菌中的表达
　上述 PCR 产物经 Promega DNA 纯化试剂盒纯化后 ,
连接到 p GEM2T 载体上 ,产生的质粒 (pTSacB) 经电击
转化感受态细胞后 ,在 Amp 抗性 LB 平板上筛选阳性
重组子。含有完整 sacB 基因的重组子由上海生工生
物工程技术服务有限公司进行 DNA 序列测定。
用 Nde I 和 Sal I 分别双酶切 pTsacB 与 pET228a
( + ) ,酶切产物经 T4 连接酶连接 ,转化到 E. coli 感受
态细胞中 ,在含 Km 的 LB 平板上筛选阳性转化子
(pSacB) ,后置于含 Km 的 LB 培养基中 37 ℃培养至
195　5 期 枯草芽孢杆菌 sacB 基因的功能验证及应用
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
OD600值为 016。加入异丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl2β2
D2thiogalactopyranoside , IPTG) 至终浓度为 1 mmolΠL ,
sacB 基因经 ITPG诱导表达后 ,分别在 0、2、3、4、5 和 6
h 取样。
11214 　SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳 　分别离心上述
IPTG诱导的细胞培养物 ,取上清液作为胞外酶酶液。
收集的菌体用 50mmolΠL 醋酸缓冲液 (pH 510) 洗涤 3
次 ,重悬于同样的缓冲液中 ,经超声波 (40W , 10min) 破
碎细胞 ,4 ℃,10000g 离心 10min 后 ,取上清液作为胞内
酶酶液。用 SDS2PAGE[16 ]法分析融合蛋白的表达量。
11215 　SacB 酶活性的测定[11 ,17 ] 　取 1ml 不同稀释倍
数 (1、5 和 10) 的上述酶液 ,加入 1ml 的 1molΠL 的蔗糖
液 ,30 ℃温浴 30min ,再加入 0125ml 1molΠL NaOH ,摇匀 ,
终止反应。用 DNS 法测定反应液中还原糖浓度 (以葡
萄糖作标准曲线) 。一个酶活单位定义 (U) 为每分钟
水解蔗糖为 1μmol 还原糖 (葡萄糖)所需的酶。
11216 　sacB 基因蔗糖致死功能的验证 　将携带有
sacB 基因表达质粒的阳性克隆菌株培养至对数生长
期 ,用灭菌牙签分别接种在含 5 %蔗糖的 TGY平板上 ,
同时用 BL21 [含 pET228a ( + ) ] 和 D. sp BR501 [ 含
pRAD1 ]作对照菌。另外在含 5 %蔗糖的 LB 液体培养
基 (含 Km 50μgΠml)上 ,观察蔗糖对细胞生长的影响。
11217 　sacB 基因在耐辐射奇异球菌中的表达 　用
Nde I和 Sal I 消化 pTsacB 和 pRAD1 ,酶切产物经 T4
连接 酶 连 接 , 产 生 的 质 粒 pRSacB 电 击 转 化 到
Deinococcus sp . BR501 细胞中 ,用 Cm(3μgΠml)抗性平板
筛选转化子。提取 pRSacB ,进行酶切验证。
11218 　突变频率分析 　将构建的 Deinococcus sp .
BR501 转化子于 TGY培养液 30 ℃培养 24h 后 ,收集细
胞用磷酸缓冲液 (10mmolΠL , pH 710)洗涤 2 次 ,并重悬
于磷酸缓冲液中 ,经 10mmolΠL 磷酸缓冲液一系列倍比
稀释 (101 ～106 ) 后 ,取 100μl 稀释液分别涂布于含有
3μgΠml Cm 的 TGY固体培养基 (TGY + Cm)上 ,和含有
3μgΠml 的 Cm、5 %蔗糖的 TGY培养基 ( TGY + Cm +
5 % 蔗糖)上 ,每个处理 3 次重复。30 ℃培养 4 - 5d 后
计算单菌落数。自发突变频率按下列公式计算 :
突变频率 = aΠb
　　其中 , a :TGY + Cm + 5 %蔗糖平板上的菌落数 ;
b :TGY+ Cm 平板上的菌落数。
2 　结果与分析
211 　sacB 基因的克隆及序列测定
从枯草芽孢杆菌基因组 DNA 扩增的基因片段 ,经
琼脂糖凝胶电泳 ,显示出一条大约 1400bp 的条带 ,与
预测的 sacB 基因片段大小相符。将该片段克隆到
p GEM2T 载体后 , 序列测定结果显示该片段全长
1509bp ,包含一个完整的由 1423 bp 组成的 ORF ,与已
公布的枯草芽孢杆菌基因组 DNA 序列基本一致 ,推测
其编码一个由 473 个氨基酸组成的蛋白质。
212 　重组表达载体的 pSacB构建及 sacB 基因的表达
含有 sacB 基因表达载体 pSacB 的菌株经 IPTG诱
导后 ,提取菌体总蛋白。SDS 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的
结果如图 1 所示 ,在 1mmolΠL IPTG诱导 2 - 4h 时 ,提取
的样品均出现一条约 51 kDa 的蛋白条带 ,且蛋白含量
随诱导时间的增长而增加。未经 IPTG诱导的菌株 ,在
相应位置没有明显的目的蛋白条带。
图 1 　sacB 基因诱导表达蛋白的 SDS2PAGE分析
Fig. 1 　SDS2PAGE of the expression of sacB
gene induced by IPTG
1 :蛋白标准分子量标记 ;2 ,3 ,4 ,5 :分别为细胞经 IPTG诱导处理 0、2、
3 和 4h 时提取的蛋白
1 :protein marker ; 2 ,3 ,4 ,5 : the extracted proteins from the cells treated with
IPTG at 0h ,2h ,3h and 4h , respetively
213 　SacB酶活性的测定
sacB 基 因 编 码 分 泌 型 蔗 糖 果 聚 糖 酶
(levansucrase) ,该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖 ,
并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖。根据 SacB 分
解蔗糖产生葡萄糖 ,而葡萄糖又具有还原能力的特点 ,
测定酶活性[15 ] 。结果显示 , SacB 基因在大肠杆菌中表
达有酶活性。而且 ,有诱导物存在时 ,此酶活性高于没
有诱导物时酶活性 (图 2 ,图 3) 。
214 　sacB 基因蔗糖致死功能的验证
如图 4A 所示 ,在含有 5 %蔗糖和 Km 50μgΠml 的
LB 液体培养基中 ,大肠杆菌 DH5α不具有 Km 抗性 ,故
不能在含有 Km 的培养基上生长 ;尽管 pSacB 携带 Km
抗性基因 ,但含 pSacB 质粒的 BL21 菌株不能在含 5 %
蔗糖的LB 培养基中生长 ;含 pET228a ( + )空载体 (携带
295 核　农　学　报 22 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图 2 　胞外蔗糖果聚糖酶的酶活性
Fig. 2 　The activities of extracellular levansucrase
图 3 　胞内蔗糖果聚糖酶的酶活性
Fig. 3 　The activities of intracellular levansucrase
图 4 　5 %蔗糖存在下 sacB 基因对菌株生长的影响
Fig. 4 　Effect of sacB gene on growth of the strains
in presence of 5 % sucrose
A :含 5 %蔗糖的液体培养基 ;B :含 5 %蔗糖的固体培养基
A :Lique medium supplemented with 5 % sucrose ;
B :Solid medium supplemented with 5 % sucrose
Km抗性基因)的 BL21 菌株能正常生长。同样由图 4B
可见 ,在含 5 %蔗糖的 TGY平板上 ,携带 sacB 基因的
菌株 D. sp . BR501 (pRSacB)和BL21 (pSacB)不能生长 ,
未能形成菌落 ; 而含空载体的菌株 D. sp BR501
(pRAD1) 和 BL21 (pET228a ( + ) ) 能正常生长。上述结
果表明在 5 %蔗糖存在下 , sacB 基因在 E. coli BL21 和
D. sp . BR501 中表达导致细胞死亡 ,即 sacB 基因赋予
了这两种菌株蔗糖敏感性。
215 　突变频率分析
D . sp BR501 (pRSacB) 在 TGY 和含 5 %蔗糖的
TGY培养基上的生存能力和突变频率的测定结果见表
2。当 sacB 基因在细胞中表达时 ,野生型或错配修复
缺失菌株 (Δ mutS1) 在含 5 %蔗糖的 TGY培养基上形
成的菌落数远远小于在 TGY培养基上形成的菌落数 ,
进一步证明了 B . subtilus sacB 基因也能提供革兰氏阳
性菌 Deinococcus SP. BRS01 的蔗糖敏感表型。
表 2 　野生型与Δ mutS1 的自发突变率
Table 2 　Rates of spontaneous mutation
of wild type andΔ mutS1
菌株 strains
平板计数 colony2forming units (CFUΠml)
Cm + TGY 5 %S + Cm + TGY
突变率
mutation rate
D. sp BR501
(pRSacB) 9143 ±1109 ×106 2193 ±0159 ×101 3110 ×10 - 6
Δ mutS1
(pRSacB) 1105 ±0136 ×107 2167 ±0193 ×102 2154 ×10 - 5
注 :Cm 为氯霉素 3μgΠml ; TGY为 TGY培养基 ;5 %S为 5 % 蔗糖。
Notes :Cm , chloromycetin 3μgΠml ; TGY, TGY medium ;5 %S ,5 % surcose
由 mutS 基因编码的错配修复蛋白是细胞 DNA 错
配修复的关键酶 ,在极端耐辐射奇异球菌中 , mutS1 为
错配修复基因。表 2 所示错配修复缺失菌株 (Δ
mutS1)的突变频率比野生型的高一个数量级 ,这就表
明 sacB 基因失活概率的增加 ,使得在含有蔗糖的平板
上 ,错配修复缺失菌株 (Δ mutS1)所形成的蔗糖抗性菌
落数增加。即错配修复基因的缺失减弱自发突变的修
复能力 ,从而使基因的突变频率增高。
3 　讨论
枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis) 的 sacB 基因编码
的蛋白为分泌型的蔗糖果聚糖酶 ,此酶能催化蔗糖水
解产生葡萄糖和果聚糖。尽管枯草芽孢杆菌 sacB 基
因导致许多革兰氏阴性菌 ( 如 E. coli , Erwinia
chrysanthemi [6 ] ,Legionella pneumophila[7 ] ) 和革兰氏阳性
菌(如 Corynebacteriu glutamicum [9 ] ) 死亡的原理尚不清
楚 ,但将 sacB 基因赋予细胞的蔗糖敏感特性作为一种
阴性筛选克隆的标记 ,在生物研究中特别是在基因克
隆等遗传操作中有着广泛的应用[10～12 ] 。
DNA 错配修复途径在维护生物基因组稳定性上
起到重要的作用 ,能有效防止和避免自发突变和诱发
395　5 期 枯草芽孢杆菌 sacB 基因的功能验证及应用
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
突变造成的损伤[18～20 ] 。错配修复途径的缺失将导致
细胞的自发突变频率提高。耐辐射奇异球菌 DNA 错
配修复途径的关键酶由 mutS1 基因编码[21 ] 。本研究
借用 sacB 基因作为一种选择性标记 ,测定耐辐射奇异
球菌 DNA 错配修复缺失突变株 (Δ mutS1) 和野生型菌
株的突变频率 ,结果显示突变株Δ mutS1 的突变频率
比野生型菌株的高一个数量级。因此 , sacB 基因赋予
细胞蔗糖敏感的特性可以用来分析和鉴定 DNA 修复
相关基因。当细胞内一个参与修复或与修复相关的基
因缺失后 ,将会减弱自发突变或 DNA 损伤后引起突变
的修复能力。利用 sacB 基因作为报告基因探测这些
突变的发生 ,当 sacB 基因因突变失活后 ,细胞能存活
于含蔗糖的培养基上 ;相反 ,修复系统完整的细胞能更
有效修复发生在 sacB 基因的突变 ,具有活性的 sacB
基因使得细胞在含蔗糖的培养基上不能生长。因此 ,
通过测定 sacB 基因的突变频率 ,可分析和鉴定 DNA
损伤修复相关基因在维护细胞基因组稳定性上的作
用。
参考文献 :
[ 1 ] 　李　晶 ,孙宇峰 ,张淑梅. 枯草芽孢杆菌水剂防治黄瓜枯萎病田
间防效研究. 生物技术 , 2004 , 14 :77～78
[ 2 ] 　Yamamoto Y, Takahashi Y, Kawano M , Iizuka M , Matsumoto T , Saeki
S , Yamaguchi H. In vitro digestibility and fermentability of levan and its
hypocholesterolemic effects in rats. J Nutr Biochem , 1999 , 10 :13～18
[ 3 ] 　Kazap I , Leibovici J , Wolman M. Blood levels of high2molecular levan
in mice as a function of the route and duration of administration.
Arzneimittelforschung , 1980 , 30 :459～462
[ 4 ] 　Caimi P G, McCole L M , Klein T M , Kerr P S. Fructan accumulation
and sucrose metablism in transgenic maize endosperm expressing a
bacillus any loliquefaciens sacB gene. Plant Physiol , 1996 , 110 :355
[ 5 ] 　Caimi P G, McCole L M , Klein T M , Hershey H P. Cytosolic
expression of the Bacillus amyloliquefaciens SacB protein inhibits tissue
development in transgenic tobacco and potato. New Phytologist , 1997 ,
136 :19～28
[ 6 ] 　Gay P , Le Coq D , Steinmetz M , Berkelman T , Kado C I. Positive
selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in
gram2negative bacteria. J Bacteriol , 1985 , 164 :918～921
[ 7 ] 　Cianciotto N P , Long R , Eisenstein B I , Engleberg N C. Site2soecific
mutagenesis in Legionella pneumophila by allelic exchange using
counterselectable ColEl vectors. FEMS Microbiol .Lett , 1988 , 56 :203～
208
[ 8 ] 　Pelicci V , Reyrat J M , Gicquel B. Expression of Bacillus subtilis sacB
gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. J Bacteriol , 1996 ,
178 :197～1199
[ 9 ] 　J¾ger W , Sch¾fer A , Kalinowski J , Pühler A. Isolation of insertion
elements from Gram2positive Brevibacterium , Corynebacterium and
Rhodococcus strains using the Bacillus subtilis sacB gene as a positive
selection marker. Fems Microbiol Lett , 1995 , 126 :1～6
[10 ] 　Quenee L , Lamotte D. Combined sacB2based negative selection and cre2
lox antibiotic marker recycling for efficient gene deletion in Pseudomonas
aeruginosa. Bio Techniques , 2005 , 38 :63～67
[11 ] 　Irani V R , Lee S H , Eckstein T M , Inamine J M , Belisle J T , Maslow
J N. Utilization of a ts2sacB selection system for the generation of a
Mycobacterium avium serovar28 specific glycopeptidolipid allelic exchange
mutant . Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials ,2004 , 3 :18
[12 ] 　Mizoguchi H , Tanaka2Masuda K, Mori H. A simple method for multiple
modification of the Escherichia coli K212 chromosome. Biosci Biotechnol
Biochem , 2007 , 71 (12) :2905 - 2911
[13 ] 　陈　明 , 刘秀敏 , 张　维 ,林 　敏. 一株极端耐辐射奇异球菌的
分离和初步鉴定. 核农学报 , 2006 , 21 (1) :44～47
[14 ] 　Wilson K, Preparation of genomic DNA from bacteria. In :ausubul FM ,
Bent R. et al . Current protocols in molecular biology. New York , NY:
J Wiley & Sons , 1987 ,2 :10～12
[15 ] 　Fujita M , Nomura K, Hong K, Ito Y, Asada A , and Nishimuro S.
Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme
(nattokinase) in the vegetable cheese natto , a popular soybean fermented
food in Japan. Biochemal and Biophysical Research Communications ,
1993 ,97 :1340～1347
[16 ] 　Sumi H , Hamada H , Tsushima H , Mihara H , and Muraki H. A novel
fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto ; a typical
and popular soybean food in the Japanese diet . Experientia ,1987 ,43 :
1110～1111
[17 ] 　Lepesant J A , Kunst F , Lepesant2KejzlarováJ , and Dedonder R.
Chromosomal location of mutations affecting sucrose metabolism in
Bacillus subtilis Marburg. Mol Gen Genet , 1972 , 118 :135～160
[18 ] 　Modrich P , Lahue R. Mismatch repair in replication fidelity , genetic
recombination , and cancer biology. Annu Rev. Biochem , 1996 ,65 :101
～133
[19 ] 　Kolodner R D , Marsischky G T. Eukaryotic DNA mismatch repair ;
Curr. Opin. Genet . Dev. 1999 , 9 :89～96
[20 ] 　Schofield M J , Hsieh P. DNA mismatch repair : molecular mechanisms
and biologicsl function. Annu Rev Microbiol , 2003 ,57 :579～608
[21 ] 　Mennecier S , Coste G, Servant P , Bailone A , Sommer S. Mismatch
repair ensures fidelity of replication and recombination in the
radioresistant organism Deinococcus radiodurans. Mol Genet Genomics ,
2004 , 272 , 460～469
495 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2008 ,22 (5) :590～594
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net