全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达
张欢 王凤寰 田平芳 谭天伟 李文进
(北京化工大学生命科学与技术学院 北京市生物加工过程重点实验室,北京 100029 )
摘 要: 利用 PCR技术从少根根霉基因组中扩增出脂肪酶成熟肽基因 ra,l并从枯草芽孢杆菌基因组中扩增出 sacB基
因的启动子信号序列 ( SacB );通过搭桥 PCR将 SacB序列与 ral基因融合,并将该基因表达盒连接到枯草杆菌分泌表达载体
pGJ103中构建了脂肪酶基因的诱导表达载体 pG J103SacBral。将重组载体转化至枯草芽孢杆菌后, 少根根霉脂肪酶成熟肽
基因在 SacB启动子信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,产物分泌至胞外。
关键词: 少根根霉 脂肪酶成熟肽 枯草芽孢杆菌 SacB 诱导表达
Inducible Expression ofRhizopus arrhizus
L ipase Gene inBacillus subtilis
ZhangHuan W ang F enghuan T ian P ingfang Tan T ianwe i L iW enjin
(College of L ife Science and T echnology, B eijing University of Chem ical T echnology, Beijing K ey Laboratory of Bioprocess, Beijing 100029)
Abstrac:t In this research, lipasem ature peptide gene ra l and a prom o tersignal fragm ent ( SacB ) of gene sacB from genom ic DNA
o fRhizopus arrh izus and Bacillus subtili, w as cloned respectively, by PCR. To obta in effic ient expression of gene ral, strategy of pGJ103
fus ion expression w as em ployed be tw een SacB fragm ent and gene ral by over lapPCR. Thus, an induc ible recomb inant p lasm id pGJ103
SacBra l conta in ing the fus ion expression cassettew as constructed based on the secreted expression plasm id pGJ103 o fB. subtili. A fter
the competent ce lls o fB. sub tilis w ere transfo rm ed w ith the recomb inant p lasm id, upon regulation o f SacB fragm ent and inducem ent of
saccharose, gene ralw as ab le to be expressed and its production w as exam ined from the outside o f the cells.
Key words: Rhizopus arrhizus L ipase ma ture peptide Bacillus sub tilis SacB Inducib le expression
收稿日期: 20091012
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 20876011) ,国家 863!计划项目 ( 2006AA020203) ,国家 973!计划项目 ( 2007CB707804) , 北京市自然基金
项目 ( 2071002) ,北京市教育委员会共建项目,生物炼制教育部工程研究中心资助项目
作者简介:张欢,女,硕士研究生,研究方向:分子生物学; Em ai:l am yhuan1112@ 163 com
通讯作者:谭天伟,教授,博导; Em ai:l tw tan@ m ailbuct edu cn
脂肪酶是医药、化工、食品和化妆品领域的重要
原料, 是生物技术及有机合成应用最广泛的一类
酶 [ 1, 2]。根霉属真菌是脂肪酶的重要生产菌。根霉
脂肪酶大多具有高度的 1, 3位专一性, 在油脂加工
和多种有机化合物的制备中,以其较好的立体选择
性等优点受到了关注 [ 35] , 多种根霉属脂肪酶的基
因都获得了克隆和表达 [ 68 ]。有研究者曾以大肠杆
菌和毕赤酵母为宿主菌表达少根根霉脂肪酶。在大
肠杆菌中,目的蛋白中形成包涵体, 无脂肪酶活性;
利用毕赤酵母表达目的蛋白分泌至胞外 [ 9] , 具有脂
肪酶活性,但是由于培养周期长,不利于提高酶活力
和热稳定性等后续研究工作。
少根根霉脂肪酶成熟肽有 269个氨基酸, 理论
分子量约 30 kD, 最适 pH85, 最适反应温度为
35∀ 。枯草杆菌 ( Bacillus sub tilis)是一种非致病性
的、能将外源蛋白分泌至胞外的表达系统,生长周期
短,有利于外源产物的纯化回收 [ 10]。本研究以枯草
杆菌为宿主表达少根根霉 (Rh izopus arrhizus )肪脂
酶成熟肽,避免了根霉菌丝体导致的脂肪酶产物分
离纯化障碍,缩短了培养周期。利用 B. subtilis sacB
基因的启动子信号序列 ( SacB序列 )调控 ral基因
的表达,首次实现了少根根霉脂肪酶在枯草杆菌中
诱导型分泌表达,并对其诱导表达条件进行了研究。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
1 材料与方法
11 菌种和质粒 (表 1)
表 1 菌种和质粒
质粒及菌种 基本描述 来源
E sch erichia coli DH 5 克隆宿主 本实验室保存
B. subtilis DL3P
表达宿主 ( his, nprR 2,
nprE18, aprA5, epr)
获赠于杨建国教授
R. arrh izus L03R1 脂肪酶成熟肽基因
ral来源菌 本实验室保存
质粒 pMD18T 克隆载体,具氨苄青霉素抗性 (Am pr )
TaKaRa宝生物工
程有限公司
质粒 pGJ103 表达载体,具氯霉素抗性 ( Ch lr )
获赠于南京农业大
学微生物学国家重
点实验室
12 酶、试剂和培养基
限制性内切酶、DNA聚合酶、RNA酶、dNTP、
DNA m arker、蛋白酶 K购于宝生物工程 (大连 )有限
公司。T4DNA连接酶、氨苄青霉素、氯霉素、XGal
和 IPTG购于 Promega公司。DNA片段凝胶回收和
质粒快速提取试剂盒购于北京博迈德科技发展有限
公司。引物合成和测序由三博志远有限公司完成。
其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂。
基础培养基为 LB+ 05M山梨醇;电转复苏培
养基为 LB+ 05M山梨醇 + 038M 甘露醇。摇瓶
发酵培养基: 全脂豆粉 4% , 葡萄糖 08%, 淀粉
03%, M gS04 7H 2O 01% , 酵母膏 01% , K2HP04
05%, ( NH4 ) 2 SO4 02%, FeC l3 001% 和 CaC l2
001% , pH 70。
13 方法
131 少根根霉基因组的提取及其脂肪酶成熟肽
基因 ral的扩增 采用氯化苄法 [ 11]提取少根根霉基
因组, 并以之为模板扩增脂肪酶成熟肽基因 ral。上
游引物 Pr1无酶切位点: 5#CAAGCGTTTGCGTCT
GATGGTGGTAAGGT3#,与枯草杆菌的 SacB序列有
重复部分,用于下一步搭桥 PCR; 下游引物 Pr2的 5#
端有N o t∃酶切位点: 5#GACGCTGCAGCATCTGAT
GGTAAGGTT3#。
132 枯草杆菌启动子信号序列 SacB的扩增
以 B. subtilis基因组为模板扩增基因调控序列 SacB。
上游引物 SP1的 5#端有 E coR ∃ 酶切位点: 5#
CGCGAATTCAGTTCTTTAGGCCCGTAGTC3#; 下 游
引物 SP2无酶切位点,用于下一步搭桥 PCR: 5#AC
CACCATCAGACGCAAACGCTTGAGTTG 3#。
133 SacBra l基因表达盒的构建 通过搭桥
PCR将 SacB序列与 ra l基因融合, 形成完整的基因
表达框。以纯化的 SacB序列和 ral基因为模板、SP1
和 Pr2为上下游引物进行 PCR反应。PCR产物与
pMD18T载体连接, 重组质粒命名为 pMD18T
SacBra l。该质粒转化至 E. co li, 阳性转化子经菌落
PCR和酶切鉴定后测序,保证基因序列和读码框的
正确。
134 基因 ral的枯草杆菌诱导分泌型表达载体的
构建和转化 用限制性内切酶 E coR∃和 N ot∃分别
对 pMD18TSacBral和质粒 pGJ103消化、纯化, 通
过 T4DNA连接酶将 SacBra l和线性 pG J103连接后
转化至 E. co li鉴定和测序, 最终获得重组质粒
pG J103SacBra l。将该质粒转化至 B. sub tilis DL3P
诱导表达。
135 重组枯草杆菌菌生长曲线的测定和目的蛋
白的鉴定 重组菌过夜培养物以 5% ( v /v )的量接
种于 100 mL摇瓶发酵培养基 (含 10 g /mL氯霉
素 )中,每隔 2 h取样测 OD600。上述培养物诱导表
达后离心取上清, SDSPAGE鉴定。
136 外源蛋白的酶活鉴定与测定 橄榄油琼脂
平板直观地检测脂肪酶酶活; 橄榄油乳化液水解滴
定法 [ 1]测定酶活大小。
137 重组菌的诱导表达条件研究 通过 SDS
PAGE观察不同诱导剂量、时机和时间对外源蛋白
产量的影响。
2 结果与分析
21 基因 ra l和枯草 SacB序列的扩增
以 R. arrhizus L03R1基因组为模板扩增出约
800 bp的片段, 以枯草杆菌基因组为模板扩增出约
400 bp的片段, 二者分别与基因 ral、序列 SacB的预
期大小相符 (图 1)。
124
2010年第 1期 张欢等:少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达
12. S acB序列 PCR产物; 34.脂肪酶成熟肽
基因 ra lPCR产物; 5. 250bp DNA分子量标准
图 1 PCR扩增 ra l基因与 SacB序列
22 SacBral基因表达盒的构建和鉴定
搭桥 PCR ( overlapPCR )扩增出约 1 200 bp的
片段 (图 2)。菌落 PCR阳性转化子中提取的质粒
经 E coR∃和 N ot∃双酶切后, 与目的基因相符 (图
3)。测序结果表明, 该片段的碱基序列与目的基因
一致, 基因表达读码框也正确。
23 枯草诱导分泌型表达载体的构建 (图 4)
图 4 表达载体 pGJ103SacBral的构建
24 重组菌生长曲线的测定
如图 5所示, 重组菌培养 2 h后进入对数生长
期, 10 h后进入稳定期。
图 5 重组枯草杆菌生长曲线
25 目的蛋白的 SDSPAGE鉴定
将原始菌、含空质粒的重组菌和含重组质粒的
重组菌过夜培养物按 5% ( v /v )的量分别接种于 100
mL摇瓶发酵培养基 (含氯霉素 )中, 37∀ 200 r/m in
振荡培养 4 h后,加入终浓度 2%的蔗糖诱导, 12 h
后终止, 离心取上清液进行 SDSPAGE。与对照相
比, 含重组质粒的重组菌上清在 30 kD附近出现了
的蛋白条带,如图 6所示。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
1.低分子量蛋白 M arker; 2.原始菌培养物上清液
3.含有质粒 pGJ103的重组菌培养物上清液; 4.含
有质粒 pGJ103SacBral重组菌培养物上清液
图 6 蛋白电泳检测目的蛋白
26 酶活的鉴定与测定
含 pH80磷酸缓冲液、橄榄油乳化液和 0001%
罗丹明 B的琼脂平板上, 具有脂肪酶酶活的待测样
品 37∀ 温育 12 h后, 肉眼可见透明圈, 365 nm紫外
光下可见荧光圈。结果如图 7所示, 与对照相比,含
质粒 pG J103SacBra l的重组菌上清液有荧光圈产
生,该重组菌胞外产物具有脂肪酶酶活 (图 7)。据
此,在 SDSPAGE中约 30 kD的蛋白条带是脂肪酶
成熟肽。
1.原始菌培养物上清液; 2.含有质粒 pGJ103的
重组菌培养物上清液; 38.含有质粒 pGJ103
SacBral重组菌培养物上清液
图 7 橄榄油琼脂平板紫外
采用橄榄油乳化液水解滴定法测酶活。在
37∀ 、pH80下每分钟产生 1 mo l脂肪酸的所需脂
肪酶量,即为 1个脂肪酶国际单位 (U )。采用 005M
的 NaOH滴定, 在摇瓶中培养 4 h、蔗糖终浓度 2%、
37∀ 诱导 12 h的条件下,脂肪酶活力为985U /mL。
27 重组菌的诱导表达条件研究
271 诱导目的基因表达的最佳诱导剂量 培养
条件见 25。培养 5 h后,分别加入终浓度为 05%、
1%、2%和 4%的蔗糖,诱导 24 h后终止,离心取上清
液进行 SDSPAGE。如图 8所示, 2%的蔗糖为最佳诱
导剂量。箭头所指示的条带为目的蛋白条带。
1.低分子量蛋白 M ark er; 25.分别为
05%、1%、2%和 4%蔗糖诱导样品
图 8 诱导剂量对目的蛋白表达量的影响
272 诱导目的基因表达的最佳诱导时机 分别
于培养 2、4、6、8、10 h后加入终浓度 2%的蔗糖, 诱
导 24 h后终止。离心取上清液进行 SDSPAGE。如
图 9所示,随着培养时间的增长,上清液总蛋白量增
加, 但目的蛋白表达量先增加后减少。结果表明,在
培养 6 h和 8 h后诱导较好。
15.分别为培养 2、4、6、8、10 h诱导样品
图 9 诱导时机对目的蛋白表达量的影响
273 诱导目的基因表达的最佳时间 培养 6 h
后加入终浓度 2%的蔗糖, 分别在诱导后第 10、14、
18、22、26、30 h取样, 离心取上清进行 SDSPAGE。
结果如图 10所示, 诱导 26 h后目的蛋白表达量相
对较高。
274 最优条件诱导表达后酶活测定 摇瓶发酵
诱导表达脂肪酶, 在最佳诱导表达条件 (重组菌培
养 6 h后加入终浓度 2%的蔗糖诱导 26 h)下测定脂
肪酶酶活力为 1436 U /mL; 在初始诱导表达条件
(重组菌培养 4 h后加入终浓度 2%的蔗糖诱导 12 h)
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2010年第 1期 张欢等:少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达
下测定脂肪酶酶活力为 985 U /mL。结果表明,在
最佳条件下诱导表达目的基因,脂肪酶活力比初始
条件下提高了约 45%。
16.分别为诱导 10、14、18、22、26、30 h样品
图 10 诱导时间对目的蛋白表达量的影响
3 讨论
利用搭桥 PCR构建了具有启动子、信号序列和
目的基因的完整表达框, 并用枯草表达载体 pGJ103
构建了诱导分泌型载体 pGJ103SacBra,l最终实现
了少根根霉脂肪酶成熟肽基因 ral在 B. subtilis中的
诱导分泌表达。结果表明, 脂肪酶成熟肽分泌至胞
外并具有脂肪酶活性。诱导表达外源基因时, 诱导
条件的不同会导致目的蛋白产量的差异, 进而会影
响酶活力。本研究探索了不同诱导剂量、不同诱导
时机和不同诱导时间对蛋白表达量的影响。研究结
果表明:重组菌培养 6 h后加入终浓度为 2%的蔗糖
诱导 26 h,获得的目的蛋白量高于其它条件;在该条
件下诱导表达基因 ra,l酶活为 1436U /mL, 比在初
始条件 (重组菌培养 4 h后加入终浓度为 2%的蔗
糖诱导 12 h)下, 脂肪酶活力提高了约 45%。
基因 ral在大肠杆菌、毕赤酵母中获得过表达。
目的蛋白在大肠杆菌中形成了包涵体,无活性;在毕
赤酵母中表达分泌至胞外且具有酶活, 但由于酵母
的生长周期比较长, 对于提高酶活和热稳定性等后
续研究造成了不便。选择枯草表达系统可以将外源
蛋白分泌至胞外,且由于 B. subtilis本身的生长周期
较短, 有利于后续研究。枯草杆菌表达体系有组成
型和诱导型之分,在选择 B. sub tilis作宿主表达初期,
选择了组成型表达体系。研究结果表明:在组成型表
达体系中,大量氨基酸被用于合成与宿主细胞生长无
关的蛋白质,影响了宿主菌自身的代谢过程; 而细胞
代谢的失衡,又会反过来抑制外源基因产物的合成,
外源蛋白的表达处于受抑制状态。诱导表达体系则
不存在这样的问题,本研究借助 B. subtilis中 sacB基
因的启动子信号序列,首次实现了少根根霉脂肪酶
成熟肽在 B. subtilis中的诱导分泌表达 。
B. subtilis中有许多种启动子信号序列, 比较常
见的有 SacB、amyE、degQ、aprE等。在本研究的基
础上可以尝试不同启动子 信号序列诱导表达目的
基因,检测、比较目的蛋白产量。在获得相对较高的
蛋白产量和酶活性的基础上,再针对提高酶活、提高
热稳定性等研究展开工作。
参 考 文 献
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