全 文 ：·临床研究·
槐耳颗粒在乳腺癌综合治疗中的作用
及其机制
张玉宝　张国强　王劲松　张岂凡
(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院外科　150040)
收稿日期:2004-05-10
作者简介:张玉宝 ,男 ,医学博士 ,教授 ,副主任医师,从事肿瘤外科专业。
【摘要】　目的　探讨金克-槐耳颗粒在乳腺癌综合治疗中的作用及其机制 , 并对其临床疗效进
行观察。方法　采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定药物的细胞毒性 、耐药倍数和逆转倍数;应用荧光
分光光度计测定细胞内ADM药物浓度;荧光定量 PCR仪测定药物对细胞内MDR-1 mRNA表达水平的
影响。结果　(1)0.01 mg ml剂量的槐耳颗粒能显著降低化疗药物 ADM 对人乳腺癌耐药细胞株 MCF-
7 A的 IC50(3.95 μg ml),与逆转前耐药细胞株 MCF-7 A 的 IC50(17.67 μg ml)相比 , 差异有显著性(P<
0.05), 其逆转倍数为 4.5 倍 , 耐药倍数为 21.7 倍。(2)0.01 mg ml槐耳颗粒能显著增加耐药细胞内
ADM浓度 , 实验组与对照组相比 , 差异有显著性(P <0.01)。(3)人乳腺癌敏感细胞株 MCF-7 S 无
MDR-1 mRNA 表达 ,低毒剂量和非细胞毒性剂量的槐耳颗粒使MCF-7 A细胞的耐药基因 MDR-1 表达
水平下调 ,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。(4)临床观察发现 ,槐耳颗粒在乳腺癌综合治疗
中对化疗有增敏作用。结论　金克-槐耳颗粒具有逆转 MCF-7 A细胞耐药性的作用 ,逆转机制是使耐
药基因 MDR-1表达水平下调。槐耳颗粒在乳腺癌综合治疗中具有双效性 , 一是抗肿瘤活性 , 二可作
为耐药逆转剂。
【关键词】　槐耳颗粒;　乳腺肿瘤 治疗
【中图分类号】R737.9;R730.53　【文献标识码】A　【文章编号】1005-8664(2004)06-0512-04
Function and clinical application of Huaier plaster in comprehensive therapy of breast cancer
ZHANG Yu-bao , ZHANG Guo-qiang , WANG J in-song , et al
(Department of Surgery , the Tumor Hospital of Harbin Medical University ,Harbin 150040 , China)
【Abstract】　Objective　To explore the function of the Jinke-huaierkeli plaster in the comprehensive therapy
of breast cancer and the mechanism.Methods　MTT method was used to detect the cytotoxicity of the drug , drug-
resistant multiple and reversing multiple.Fluorescent spectrophotometer was used to measure the concentration of
ADM in cells and fluorescent quantitative PCR method was used to detect the effect of the drug on the expressing
level of MDR-1 mRNA in cells.Results　(1)0.01 mg ml Huaierkeli plaster can significantly reduce the IC50
(3.95 μg ml)of ADM to the drug-resistant cell strain(MCF-7 A)of breast cancer , with significant difference as
compared with the IC50(17.67μg ml)to the drug-resistant cell strain MCF-7 A without reversing(P <0.05).Its
reversing multiple was 4.5 times and drug-resistant multiple was 21.7 times.(2)0.01mg ml Huaierkeli plaster
could significantly increase the concentration of ADM in drug-resistant cells , with significant difference(P <0.01).
(3)MDR-1 mRNA was not expressed in the sensitive cell strain MCF-7 S of human breast cancer.The Huaierkeli
plaster at dosages of low toxicity or without toxicity lowered the expressing level of MDR-1 in MCR-7 S with signifi-
cant difference as compared with the control(P<0.01).Conclusions　This research indicate that Jinke-huaierkeli
plaster can increase the sensitivity of breast cancer cells to chemotherapy drug.Its mechanism is that it can lower
the expressing level of the drug-resistant gene MDR-1 and reverse the drug-risistance.At the same time the research
preliminarily indicates that Jinke plaster has two effects , one is the anti-tumor activity and the other is reverse the
drug-resistance.
【Key words】　Huaier plaster;　Breast neoplasms therapy
·512· 中国肿瘤临床与康复 2004年 12月第 11卷第 6期　Chin J Clin Oncol Rehabi l , December 2004, Vol 11 ,No.6
DOI :10.13455/j.cnki.cjcor.2004.06.011
　　乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一 ,其发病
率有逐渐增加的趋势 ,是引起妇女死亡的重要肿瘤
之一。综合治疗是乳腺癌治疗的重要手段 ,多药耐
药现象(MDR)是乳腺癌临床化疗失败的主要原因 ,
克服MDR是目前肿瘤防治研究的热点。目前已发
现的许多逆转多药耐药的药物 ,由于疗效不够理想 ,
毒副作用大 ,在临床上很难推广应用。金克-槐耳颗
粒为国家中药一类新药 ,具有化疗药的功效 ,良好的
促凋亡效果和免疫增强调节作用 ,能促进肺癌耐药
细胞株耐药性发生逆转 ,无毒副作用。为验证槐耳
颗粒在无毒剂量时能否增强乳腺癌多药耐药细胞株
MCF-7 A对阿霉素的敏感性及其逆转机制 ,我们对
40例乳腺癌患者进行了临床观察 ,以期能找到逆转
MDR效果好并且无毒副作用的逆转药物 ,发挥槐耳
颗粒在肿瘤综合治疗中的作用 ,进一步增强乳腺癌
的化疗效果 ,使患者早日康复 ,提高生存率。
材料与方法
1.设备及主要试剂:金克-槐耳颗粒由江苏启东
盖天力制药有限公司提供 ,MTT 为 Sigma 产品 ,ADM
为意大利 Farmitalia 公司产品 ,二甲基亚砜(DMSO)
分析纯为天津市大茂化学仪器供应站提供 ,MDR1
荧光定量 RT-PCR诊断试剂盒为中山大学达安基因
股份有限公司提供 , RPMI-1640为美国Gibco BRL 公
司产品 ,胎牛血清购自中国医学科学院血液研究所 。
塑料培养瓶和培养板均为美国 Costar 公司产品 ,酶
标仪为 BioRAD公司产品 450型 ,荧光分光光度计
RF-510型为日本岛津产品 ,荧光定量 PCR仪为美国
ABI公司产品 。
2.细胞株及细胞培养:人乳腺癌细胞株MCF-7
S及相应的耐阿霉素细胞株MCF-7 A均由中国医学
科学院天津血液研究所提供 。在 37℃、体积分数为
5%的 CO2 饱和湿度培养箱中 ,分别培养于含 10%
血清 、100 U ml 青霉素 、100 μg ml 链霉素的 RPMI-
1640培养液中 ,3 d传代一次 。MCF-7 A细胞除上述
培养条件外 ,需加入 1.0μg ml的 ADM ,以维持细胞
的耐药性 。
3.细胞毒性实验:用胰酶消化细胞后 ,调整敏感
株和已经停加 ADM 两周的耐药株细胞浓度为 2×
10
5 ml ,每孔 100 μl接种于 96孔板中。实验设计 3
组 ,每组均设 3个平行孔 ,实验组为槐耳颗粒组和
ADM组 ,对照组为未加药的空白对照 ,实验组两组
均分别从第1孔到第 12孔倍比稀释 ,每孔所加的药
物最终为100μl。将96孔板置于37℃5%CO2 孵箱
中 ,培养 48 h 后 ,每孔加入MTT 液 20 μl ,继续培养
4 h后 ,去掉上清液 ,每孔加入二甲基亚枫(DMSO)
100μl ,用振荡器震荡 5 min ,室温放置数分钟 ,待紫
色颗粒完全溶解后 ,用全自动酶标仪测定每孔的
A490nm值 ,取三个平行孔的平均值 ,按公式计算细胞
抑制率(IR):IR=〔1-实验组 A 均值 对照组 A 均
值〕×100%,并求出 IC50值(半数细胞抑制剂量)及
耐药倍数(耐药细胞 IC50/敏感细胞 IC50)。选择细胞
抑制率<15%的药物浓度为该药的低毒剂量 ,选择
细胞抑制率<5%的药物浓度为该药的无毒剂量 。
4.MTT法测定耐药细胞对ADM的敏感性:实验
方法同前 ,只是细胞均为耐药细胞。实验设计分为
3组:(1)倍比稀释 ADM 组;(2)无毒剂量槐耳颗
粒+倍比稀释 ADM 组;(3)未加药的空白对照组。
计算每组的 IC50值 ,求出逆转倍数(未加逆转剂组的
IC50 加逆转剂组的 IC50)。
5.荧光分光光度计测定细胞内 ADM 药物浓度:
细胞处理同前 ,取对数生长期耐药细胞 2×105 ml。
实验组加无毒剂量槐耳颗粒 5.0 ml+不同浓度的
ADM(100 ,50 , 10 μg ml);对照组只加 ADM(100 , 50 ,
10μg ml)。含 10%胎牛血清的1640培养液 5 ml ,混
匀置孵箱中培养 ,将ADM及槐耳颗粒按要求加入培
养 3 h 。收集细胞 ,离心用 PBS 洗 3 次 ,重新悬浮于
0.3 mol L HCl 的 50%乙醇消化液中消化过夜
(4℃),离心沉淀。据 ADM 本身发荧光的特点 ,取上
清液于荧光分光光度计上测定荧光强度(激发波长
Exλ=470 nm ,发射波长 Emλ=585 nm , 狭缝宽 10
nm)。每个样品做3 个平行管 ,同时做 ADM浓度-
荧光强度标准曲线 。
6.荧光定量 PCR法测定 MDR1 基因表达水平:
细胞培养同前 ,实验分四组:(1)敏感细胞 MCF-7 S
组;(2)耐药细胞MCF-7 A 组(3)耐药细胞 MCF-7 A
加槐耳颗粒 1.0 mg ml 组(4)耐药细胞 MCF-7 A 加
槐耳颗粒0.01 mg ml组。继续培养 10 h 后 ,用 PBS
洗 3次 , -80℃冻存 ,按荧光定量 RT-PCR试剂盒说
明的条件操作 ,测定各组MDR-1基因表达水平。
7.统计学分析:全部资料用 SPSS10.0软件进行
统计分析 ,计量资料用 x ±s表示 ,各组及组间比较
用 t 或χ2 检验 。
结　　果
1.槐耳颗粒对 MCF-7 S 和 MCF-7 A 生长的影
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响:根据酶标仪输出结果 , 槐耳颗粒在 1.0 mg ml
时 ,对MCF-7 S和MCF-7 A均无明显的抑制作用 ,细
胞存活率 >85%, 为低毒剂量 。槐耳颗粒在
0.01 mg ml时 , 细胞存活率 >95%。我们 采用
0.01 mg ml槐耳颗粒作为非细胞毒性剂量。槐耳颗
粒对敏感细胞MCF-7 S 和耐药细胞 MCF-7 A的 IC50
分别是9.78μg ml和 10.38 μg ml , 差异无显著性
(P>0.05),说明 MCF-7 A 细胞对槐耳颗粒不具有
耐药性。
2.0.01 mg ml 的槐耳颗粒对 MCF-7 A 细胞
MDR的逆转作用:MCF-7 A 对 ADM 显示耐药性 ,其
IC50为 17.669 μg ml;而 MCF-7 S 对 ADM 敏感 , 其
IC50为 0.8155 μg ml。耐药细胞 MCF-7 A 较敏感
MCF-7 S细胞对 ADM 耐药倍数为 21.7倍(17.669
0.8155)。经 0.01 mg ml的槐耳颗粒与ADM联合作
用后 ,耐药细胞 MCF-7 A 对各组 ADM 的敏感性增
强 ,其 IC50明显下降 ,为 3.95μg ml ,逆转倍数为 4.5
倍(17.669 3.95)。
3.荧光分光光度计测定细胞内 ADM 药物浓度
的结果:实验组和对照组的荧光强度测定后 ,分别在
ADM浓度-荧光强度标准曲线上确定相应的细胞内
化疗药物 ADM 浓度 ,具体结果见表 1。由表 1可以
看出 ,实验组与对照组 MCF-7 A 细胞内药物浓度随
着ADM实验浓度的增加而增加 ,但是 ,实验组细胞
内ADM浓度增加高于对照组 ,差异有显著性(P <
0.05),说明槐耳颗粒 0.01 mg ml对MCF-7 A细胞内
ADM浓度有积累作用。
表 1　0.01 mg ml槐耳颗粒对MCF-7 A细胞
内 ADM 浓度的影响
ADM浓度(μg ml) MCF-7 A细胞内 ADM 浓度(μg ml)实验组 对照组
10 0.2879±0.001＊ 0.2539±0.001
50 0.6799±0.001＊ 0.5606±0.001
100 1.7260±0.001＊ 1.5151±0.001
　　＊与对照组比较 , P<0.05
4.荧光定量 PCR仪测定 MCF-7 A 细胞 MDR-1
mRNA表达水平的变化:采用荧光定量 PCR法测定
MCF-7 S 细胞无 MDR-1 mRNA 表达 , MCF-7 A 有
MDR-1 mRNA表达 ,并且呈高值 ,可作为对照组。不
同浓度槐耳颗粒组与对照组相比 ,MDR-1 mRNA 表
达水平下调 ,差异有显著性(P<0.01 ,表 2)。
表 2　槐耳颗粒对MCF-7 A细胞 MDR-1 mRNA
表达水平的影响
组别 细胞内MDR-1cDNA 拷贝数
MCF-7 S 0
MCF-7 A 　　　　 600500± 4123.11
MCF-7 A+1.0 518750± 4573.47＊
MCF-7 A+0.01 367750± 500.0＊
　　＊与对照组比较 , P<0.01;MCF-7 A+1.0为耐药细胞 MCF-7 A
加槐耳颗粒 1.0 mg ml组;MCF-7 A+0.01为耐药细胞MCF-7 A加槐
耳颗粒 0.01 mg ml组
CA153为糖链抗原 ,是监测乳腺癌的肿瘤标记物
及复发的重要指标 ,其正常值为 0 ～ 30 U ml。本组
临床观察病例化疗前后 CA 153测得结果均在正常范
围内 ,化疗前实验组与对照组差异无显著性 ,化疗后
实验组 30例CA153测得结果平均值 3.2 U ml ,对照组
10例 CA153测得结果平均值 9.4 U ml ,两组比较差异
有显著性。初步说明槐耳颗粒在乳腺癌综合治疗中
对化疗有增敏作用 ,有较好的临床疗效。
讨　　论
综合治疗在恶性肿瘤治疗中发挥着重要的作
用 。在临床化疗过程中产生多药耐药性(MDR),是
化疗失败的主要原因 。因而应用 MDR逆转剂是克
服肿瘤细胞耐药 ,提高化疗效果的一种重要手段。
化疗药物耐药在乳腺癌中普遍存在[ 1] ,其多药耐药
基因MDR-1表达水平与肿瘤大小 、病理组织学分化
程度及 ER情况均有密切关系。引起耐药的机制很
多 ,目前研究最多的是多药耐药基因(MDR-1)及其
编码的细胞膜 P-糖蛋白(P-gp)。所以 ,寻找有效的
具有临床应用价值的逆转剂 ,是提高肿瘤化疗效果
的关键 。
自Tsumo 等首次报道维拉帕米(VRP)能逆转
P388 VCR细胞对长春新碱(VCR)的耐药性以来 ,
MDR逆转剂研究发展非常迅速 。第一代逆转剂如
环孢素A 、维拉帕米 ,其逆转 MDR的活性较低 ,并且
有较严重的毒副作用;第二代逆转剂与第一代结构
类似 ,且具有较高的选择性和较低毒性 ,如右旋维拉
帕米 、环孢素 A 衍生物等;第三代逆转剂则是专门
为逆转MDR而设计开发的化合物 ,具有较强而且稳
定的逆转 MDR活性 。从中草药中寻求有效成分 ,来
逆转MDR是目前研究的热点[ 2] 。槐耳是生长在中
国槐上的药用真菌 ,槐耳颗粒是从槐耳菌质中提取
的多种有效成分 ,其主要活性成分是多糖蛋白(PS-
T)。目前已有其成品(金克-槐耳颗粒 ,国家一类新
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药)用于临床 ,对肝癌 、肺癌 、胃癌 、乳腺癌均有独特
疗效 。本研究证实 , 槐耳颗粒在无细胞毒性剂量
0.01 mg ml时能增强 ADM 对 MCF-7 A 细胞的毒性
作用 ,其逆转倍数为 4.5倍 ,与对照组相比 ,明显增
加了细胞内 ADM 浓度 ,显著提高了耐药细胞 MCF-
7 A对 ADM 的化疗敏感性 。
MCF-7 A细胞是多药耐药基因 mdr 扩增 ,过度
表达 P-gp蛋白的耐药性细胞 ,抗癌药物被 P-pg蛋白
排出细胞外 ,使细胞内抗癌药物浓度下降是其产生
MDR的主要原因。测定细胞内ADM 的药物浓度情
况能反映出药物对 P-gp蛋白功能的影响状况 。实
验表明 ,小剂量槐耳颗粒与 ADM 合用 4 h后 ,明显
增加了MCF-7 A细胞内药物浓度 ,说明槐耳颗粒能
抑制 P-pg蛋白的功能 ,而减少药物的外排。本研究
通过荧光定量 PCR法进一步证明 ,小剂量槐耳颗粒
能使耐药细胞MDR-1 mRNA水平表达下调 ,进一步
说明抑制 P-gp 的功能及其表达进而提高细胞内药
物浓度是槐耳颗粒逆转MDR的主要机制 。李文瑜
等[ 3]将白血病多药耐药细胞系 K562 A02细胞与苦参
碱联合应用时 , 发现苦参碱可下调 K562 A02细胞
MDR-1 mRNA表达 ,与对照组比较差异有显著性(P
<0.01),这与本研究结果一致。潘启超等[ 4] 对十几
种中草药单体做了体外实验 ,发现粉防己碱(TTD)
和蝙蝠葛碱(DRC)能明显增加阿霉素对 MCF-7 A细
胞的毒性 ,并能增加 ADM 在 MCF-7 A 细胞内的积
累 ,而对敏感的 MCF-7 S 细胞没有影响 , 且毒性较
低 ,说明中药有效活性成分在克服 MDR方面将发挥
很大作用。
综上所述 ,在乳腺癌综合治疗中 ,金克-槐耳颗
粒具有双效性 ,不仅是一种抗肿瘤药物 ,而且是一种
耐药逆转剂 。因此 ,在联合化疗中 ,槐耳颗粒本身可
发挥抗肿瘤作用 ,同时又可以作为逆转剂 ,提高化疗
药物对肿瘤细胞的毒性作用 ,能有效提高化疗效果 ,
对患者早日康复有推动作用 ,可以在临床广泛应用。
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报, 1995 , 40:1901-1904.
(上接第 511 页)生育年龄 ,卵巢功能旺盛 ,如合并妊
娠 、哺乳 ,体内雌酮 、雌二醇 、雌三醇和肾上腺皮质激
素均有明显升高 ,血液中T 细胞水平下降 ,致使免疫
功能下降 ,易促进乳腺癌恶化 ,肿瘤发展较快 ,发生
转移较早 ,预后较差[ 13] 。亦有报道妊娠哺乳期乳腺
癌的预后并不差[ 14] 。
单因素分析结果显示 ,病理分期 、肿瘤大小和淋
巴结转移情况对预后均有影响 。而多因素分析结果
显示 ,肿瘤大小和淋巴结转移情况对预后无意义 ,可
能是因为病理分期是由肿瘤大小和淋巴结情况推断
而来 ,三者之间存在共线性问题 ,从而掩盖了实际上
对预后也有意义的两个指标:肿瘤大小和淋巴结转
移情况。
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