全 文 ：　山 东 农 业 科 学　2010, 1:5 ～ 9 ShandongAgriculturalSciences
榅桲离体培养繁殖的研究
魏国芹 1, 2 ,戴洪义 1＊ ,孙玉刚 2 ,梁美霞1 ,安　淼 2
(1.青岛农业大学园林园艺学院 ,山东 青岛　266109;2.山东省果树研究所 ,山东 泰安　271000)
　　摘　要:利用榅桲茎尖进行继代培养 ,建立了榅桲的离体再生体系。结果表明 , 适合离体叶片愈伤组织诱
导的培养基为 1/2MS+KT0.5 mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L;适合愈伤组织分化
不定芽的培养基为 MS+TDZ3.0mg/L+NAA0.3 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L;适合叶片再生不定
芽的培养基为 MS+TDZ2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L;适合榅桲茎段生根的培养
基为 1/2MS+IAA0.3 mg/L+蔗糖 30.0g/L+琼脂 6.5g/L。
关键词:榅桲;愈伤诱导;植株再生;生根诱导
中图分类号:S661.94 +3　　文献标识号:A　　文章编号:1001-4942(2010)01-0005-05
ResearchonPropagationinVitroofQuince
WEIGuo-qin1, 2 , DAIHong-yi1＊ , SUNYu-gang2 , LIANGMei-xia1 , ANMiao2
(1.ColegeofHorticulture, QingdaoAgriculturalUniversity, Qingdao266109, China;
2.ShandongInstituteofPomology, Taian271000, China)
Abstract　Theregenerationsysteminvitroofquince(CydoniaoblongaMil.)wasestablished.There-
sultsindicatedthattheoptimalmediumforcaliinductionvialeaveswas1/2MS+KT0.5 mg/L+2 , 4-D1.
0mg/L+sucrose30.0 g/L+agar6.5g/L.Theoptimalmediumforthediferentiationofcaliwas1/2MS+
TDZ3.0mg/L+NAA0.3mg/L+sucrose30.0g/L+agar6.5g/L.Theoptimalmediumforplantregener-
ationvialeaveswasMS+TDZ2.0 mg/L+NAA0.1mg/L+sucrose30.0 g/L+agar6.5g/L.Theoptimal
mediumforrootinductionwas1 /2MS+IAA0.3mg/L+sucrose30 g/L+agar6.5 g/L.
Keywords　Quince;Calusinduction;Plantregeneration;Rootinduction
　　榅桲(CydoniaoblongaMil.)属蔷薇科 、榅桲
属(cydonia)果树 ,原产于伊朗 、土耳其[ 1] 。其果
实营养丰富 ,具有特殊芳香味 ,是食品工业的重要
原料 。榅桲在欧洲被用作西洋梨的矮化砧木 ,如
榅桲 A、榅桲 B和榅桲 C[ 2] 。榅桲还可用作药材
和观赏树木[ 3 ～ 4] 。
收稿日期:2009-11-02
基金项目:山东省良种产业化项目。
作者简介:魏国芹(1983-),女 ,在读硕士研究生 ,主要从事果树育种工作。 E-mail:guoqinw1983@126.com
＊通讯作者, E-mail:hydai@qau.edu.cn
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DOI :10.14083/j.issn.1001-4942.2010.01.032
　　目前国外对榅桲的研究较多 ,对其组织培养
及离体再生方面的研究也较成熟[ 5 ～ 12] 。国内对
榅桲的研究较少 ,仅局限于对植物学和生态学特
性 、栽培管理 、茎尖组织培养[ 13 ～ 14]及榅桲果实中
一些成分的研究 [ 3, 4] ,有关榅桲愈伤组织诱导及
叶片再生培养的研究在国内尚未见详细报道 。
青岛农业大学于 1991年从英国引进榅桲 A
的种子 ,经播种获得少量植株 。为了加速繁殖 ,我
们对其进行了组织培养快繁研究 ,并建立了榅桲
的离体再生体系。
1　材料与方法
1.1　材料
2009年 4月份自田间取榅桲枝条 ,剥取芽内
约 0.5 mm大小的茎尖 ,用 75%酒精表面消毒 10
～ 15 s、0.1% HgCl2灭菌 4 min,经蒸馏水冲洗 5
～ 6次后 ,接种于 MS+6 -BA0.50 mg/L+NAA
0.05 mg/L+蔗糖 30.0g/L+琼脂 6.5 g/L培养基
中进行初代培养 , 30 d后将成活新梢茎段转接至
MS+6-BA0.30 mg/L+IAA0.03 mg/L+蔗糖
30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L培养基中继代增殖 , 40d
后苗高 4 ～ 5cm,以后每 30d继代一次。试验所用材
料均取自榅桲继代苗(图版 A)。
1.2　方法
1.2.1　叶片愈伤组织诱导　选取试管苗顶部 3
～ 4片新叶 ,用手术刀沿垂直于叶脉方向划伤叶
片 ,伤口间距约 2 mm,分别接种于愈伤组织诱导
培养基中 ,在恒温(26℃)暗环境下进行愈伤组织
诱导 。
1.2.2　愈伤组织不定芽分化　取生长较快的愈
伤组织 ,接种于添加不同植物生长调节剂组合的
MS培养基上 ,置于光照培养室中诱导分化不定芽。
1.2.3　叶片不定芽再生　选取试管苗顶部 3 ～ 4
片新叶 ,用手术刀沿垂直于叶脉方向切割 ,间距约
1 ～ 2 mm,并保持叶片的完整性 ,分别将叶片接种
于不定芽诱导培养基中 ,并进行不同时间的暗处
理 , 30d后观察不定芽分化情况。
1.2.4　不定根的诱导　取生长健壮 、高约 3 cm
的茎段接种于生根培养基中 , 40 d后统计生根情
况。
1.2.5　培养条件 　本试验所用基本培养基有
MS、3 /4MS、1/2MS,其中蔗糖浓度 30.0 g/L,琼脂
6.5 g/L, pH5.8,培养温度 26℃。光照培养时光
照周期为 16h/d,光照强度为 1 500 ～ 2 000 lx,暗
培养采用黑暗恒温(26℃)培养箱。
2　结果与分析
2.1　叶片愈伤组织的诱导
将叶片接种到愈伤组织诱导培养基中 ,结果
发现 C4 ～C7培养基中的叶片 7 d后开始在切口
处形成浅黄色愈伤组织 ,随着培养时间的延长切
口处的愈伤组织不断增大 , 35 d左右叶片完全愈
伤化 。其余培养基中的叶片在接种 10 d后开始
形成愈伤组织 ,生长速度较慢 。由表 1可见 , 8种
培养基均能高效诱导出愈伤组织 。叶片在添加
KT和 2 , 4 -D的培养基中出愈率均达 100%,以
在 C5培养基中形成的愈伤组织体积最大 ,说明
C5培养基最适合诱导榅桲愈伤组织 。对比 C2、C7
培养基可以看出 , 2 , 4-D诱导愈伤组织的效果优
于 IBA。不同的植物生长调节剂组合诱导的愈伤
形态不同:C1 ～ C3培养基诱导出白色 、坚硬 、致密
愈伤组织(图版 C),继代生长慢 ,有轻微褐变现
象;C4 ～ C7培养基诱导出浅黄色 、松散愈伤组织
(图版 B),继代增殖快 ,不褐变;C8培养基诱导出
黄色 、坚硬 、致密愈伤组织 ,继代生长较快 ,不褐变
(图版 D)。 3种形态的愈伤组织在原培养基上均
无不定芽发生 。
　　表 1　植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响
培养
基
植物生长调节剂浓度(mg/L)
BA KT IBA 2, 4-D
外植
体数
愈伤组织
诱导率(%)
愈伤形
成量
C1 1.0 - 0.5 - 40 52.5d 多
C2 0.5 - 1.0 - 40 87.5ab 多
C3 0.5 - 0.5 - 40 85.0bc 多
C
4 - 1.0 - 0.5 40 100a 较多
C5 - 0.5 - 1.0 40 100a 最多
C6 - 0.5 - 0.5 40 100a 较多
C7 0.5 - - 1.0 40 100a 较多
C8 - 0.5 1.0 - 40 77.5cd 较多
　　注:表内同列不同小写字母表示邓肯新复极差法检验差异显
著(P<0.05),下表同。基本培养基为 1 /2MS。
2.2　愈伤组织分化不定芽
接种 12d后开始有不定芽生成 , 40 d后不定
芽长成 1.0 ～ 1.5 cm长的新梢(图版 F),当不定
芽高约 1.5 cm时要及时转移到继代培养基中 ,否
则会出现玻璃化现象 。表 2表明 ,适合榅桲愈伤
6 山 东 农 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　2010年　
A.榅桲组培苗;B.浅黄色疏松愈伤组织;C.白色颗粒状愈伤组织;D.黄色块状坚硬愈伤组织;E.愈伤分化成苗;F.叶片再生成苗;
G.叶片在培养基 E13中形成乳白色根;H.榅桲试管苗生根;I.榅桲移栽苗
榅桲离体培养繁殖图版
　　表 2　　　　不同植物生长调节剂对愈伤分化
　　　　不定芽的影响
培养基 细胞分裂素(mg/L)
NAA
(mg/L)
愈伤组织
块数
产生芽点
愈伤数
产生不定
芽愈伤数
分化率
(%)
D1 6-BA1.0 0.1 30 0 0 0 b
D2 6-BA2.0 0.2 30 16 0 0 b
D3 6-BA3.0 0.3 30 19 1 3.33ab
D
4 6-BA4.0 0.4 30 12 2 6.67ab
D5 ZT1.0 0.1 30 21 0 0 b
D6 ZT2.0 0.2 30 20 0 0 b
D7 ZT3.0 0.3 30 30 0 0 b
D8 ZT4.0 0.4 30 19 2 6.67ab
D9 TDZ1.0 0.1 30 22 3 10.0ab
D10 TDZ2.0 0.2 30 30 4 13.33 a
D11 TDZ3.0 0.3 30 30 5 16.67 a
D12 TDZ4.0 0.4 30 30 3 10.0a
　　注:基本培养基为 MS。
组织分化不定芽的培养基为 MS+TDZ3.0mg/L
+NAA0.3 mg/L。不同细胞分裂素对诱导愈伤
组织分化不定芽的效果从大到小依次为:TDZ、6
-BA、ZT。由 D9、D10 、D11 、D12可知 , 当 TDZ与
NAA的浓度配比为 10时 ,愈伤组织分化不定芽
的频率随着两者浓度的提高先增大后减小 。另
外 ,多数愈伤组织在诱导不定芽过程中能产生绿
色小芽点 ,但不定芽再生频率低。
2.3　叶片不定芽分化
2.3.1　暗培养时间对叶片不定芽分化的影响　
由表 3可以看出 ,暗培养时间对榅桲叶片不定芽
的分化有显著影响 。随着暗培养时间的延长 ,榅
桲叶片不定芽再生率呈现先上升后下降的趋势 。
无暗培养处理时 ,不定芽再生率为 0;暗培养时间
　　表 3　　　不同暗培养时间对榅桲离体叶片
　　　再生不定芽的影响
暗培养
时间 (d)
接种数
(个)
开始分化
时间(d)
再生率
(%)
再生叶片平
均再生芽数
0 32 - 0c 0d
10 32 10 12.50b 3.03b
20 32 8 28.13a 3.81a
30 32 9 21.88ab 2.94b
40 32 9 18.75ab 1.91c
7　第 1期　　　　　　　　魏国芹等:榅桲离体培养繁殖的研究
为 20 d时 ,不定芽再生率和再生芽数均达到最高
值 ,分别为 28.13%和 3.81个;随着暗培养时间
的进一步延长 ,叶片不定芽再生率和再生芽数开
始下降。不同的暗处理下 ,叶片开始分化的时间
相差不大 。
2.3.2　不同接种方式对叶片不定芽分化的影响
　将叶片按正放 、反放两种不同的接种方式接种
到 MS+TDZ2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖
30.0 g/L+琼脂 6.5 g/L培养基中 ,暗培养 20 d
后 ,置于光照培养室中进行培养。表 4表明 ,正放
时获得的叶片再生率和平均再生芽数较高 ,两种
接种方式下的叶片再生率差异显著 ,单叶片平均
再生芽数差异不显著。
　　表 4　　　叶片接种方式对榅桲离体叶片
　　　再生不定芽的影响
接种方式 调查叶片数(个) 再生率(%) 再生芽数(个)
正放 65 28.29a 3.06a
反放 65 13.75b 2.98a
2.3.3　植物生长调节剂对叶片不定芽分化的影
响　将叶片暗培养 20 d后置于光下培养 , 10 d后
即有不定芽发生 。 6-BA诱导的不定芽多为单
芽 , TDZ诱导的不定芽多为簇生芽 。表 5表明 ,各
种处理对榅桲叶片不定芽诱导的频率均较低 ,且
单叶片平均再生芽数均小于 4.0。当 6 -BA与
　　表 5　 植物生长调节剂对榅桲叶片再生的影响
培养基 细胞分裂素(mg/L)
NAA
(mg/L)
再生率
(%)
平均再生
芽数(个)　　　叶片切口状态
E1 6-BA1.0 0.1 0 c 0 少量绿色愈伤组织 、坚硬致密
E2 6-BA2.0 0.2 4.76c 2.0 绿色愈伤组织 、坚硬致密 ,再生芽细弱不经愈伤 ,为单芽
E3 6-BA3.0 0.3 5.13c 2.5 绿色愈伤组织 、致密坚硬 ,再生芽为单芽
E4 6-BA3.0 0.01 7.5bc 1.33 绿色愈伤组织 、致密坚硬 ,有白色颗粒状芽点 ,再生芽不经愈伤
E5 6-BA4.0 0.4 4.65c 1.0 绿色愈伤组织 、坚硬致密 ,再生芽有玻璃化现象
E6 6-BA6.0 0.6 0 c 0 绿色愈伤组织且玻璃化
E7 6-BA8.0 0.8 0 c 0 绿色愈伤组织且玻璃化
E
8 6 -BA10.0 1.0 0 c 0 绿色愈伤组织且玻璃化
E9 TDZ1.0 0.1 16.32ab 2.13 再生苗经愈伤 ,簇生 ,生长健壮
E10 TDZ2.0 0.1 24.00 a 3.31 再生苗经愈伤 ,簇生 ,生长健壮
E11 TDZ2.0 0.2 20.00 a 2.9 再生苗经愈伤 ,簇生 ,生长健壮
E12 TDZ3.0 0.3 22.22 a 2.22 再生苗经愈伤 ,簇生 ,生长健壮
E13 ZT3.0 0.3 0 c 0 无愈伤组织形成 ,有少量根发生
　　注:基本培养基为 MS。
NAA的浓度配比为 10∶1时 ,随着两者浓度的提
高叶片再生率呈先增大后减小趋势 ,当 6-BA浓
度大于 6.0 mg/L时 ,再生率为 0,高浓度的 6 -
BA和 ZT诱导出的再生芽均有玻璃化现象。由
E3、E12、E13知 , TDZ诱导叶片再生的效果显著优
于 6-BA和 ZT。使用 ZT的培养基 E13诱导出少
量不定根(图版 E)。培养基 E10诱导的不定芽最
多 ,长势最好(图版 G)。另外 ,本试验对不定芽
在叶片上的再生位置进行了统计 , 结果显示
9.68%的不定芽再生于叶尖部 , 29.03%的不定芽
再生于叶中部 , 61.29%的不定芽再生于叶柄部 。
2.4　生根诱导
茎段接种 20 d后开始有乳白色根发生 , 40 d
后根长 4 ～ 5 cm(图版 H),茎段在 1 /2MS培养基
中生根较早 。由表 6可见 , 培养基为 1/2MS时 ,
单独使用 NAA,生根率随着 NAA浓度的增加而
增加;单独使用 IAA,生根率随着 IAA浓度的增加
而降低。对比 F2、F4、F5知 , NAA的浓度固定为
0.6 mg/L时 ,茎段在 1/2MS中的生根率显著大于
在 3/4MS和 MS培养基中的生根率;对比 F7、F9 、
F10知 , IAA的浓度固定为 0.6 mg/L时 ,茎段在
1/2MS中的生根率也大于在 3 /4MS和 MS培养基
中的生根率 。由此可见 , 1/2MS比 3 /4MS和 MS
培养基更适合诱导生根 ,过量的无机盐不利于生
根。虽然 1.2mg/L的 NAA也能高效地诱导出不
定根 ,但是 NAA诱导的根部产生大量愈伤组织 ,
不利于小苗移栽成活 ,可见 IAA比 NAA更适合
榅桲诱导生根 。由表 6可知 ,适合榅桲生根的最
佳培养基是 1/2MS+IAA0.3 mg/L。
　　表 6　　　　培养基及植物生长调节剂对
　　　诱导生根的影响
处理 培养基 NAA(mg/L)
IAA
(mg/L)
接种
株数
生根
株数
生根率
(%)
平均生根
数(条)
F1 1/2MS 0.3 - 45 3 6.67 d 4.23
F2 1/2MS 0.6 - 45 26 57.78 a 6.08
F3 1/2MS 1.2 - 45 28 62.22 a 6.50
F4 3/4MS 0.6 - 45 12 26.67bc 7.83
F5 MS 0.6 - 45 14 31.11bc 2.57
F6 1/2MS - 0.3 45 29 64.44 a 4.50
F7 1/2MS - 0.6 45 21 46.67ab 1.86
F8 1/2MS - 1.2 45 13 28.89bc 3.30
F
9 3/4MS - 0.6 45 14 31.11bc 2.11
F10 MS - 0.6 45 6 13.33cd 1.67
8 山 东 农 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　2010年　
2.5　生根苗的移栽
选取生长健壮 ,高 4 ～ 5 cm,带根较多的幼苗
进行移栽 ,移栽前先炼苗 3 ～ 4d,然后将根部的培
养基用无菌水冲洗干净 ,移栽到已灭菌的蛭石基
质中 ,遮荫 ,防风 ,相对湿度保持在 80%左右 ,移
栽成活率可达 80%以上(图版 I)。
3　讨论与结论
3.1　榅桲组织培养过程中不发生褐变 ,但容易出
现玻璃化现象 ,导致增殖系数明显降低 ,这是榅桲
组织培养中迫切需要解决的问题。本试验培养基
中 6-BA浓度越高试管苗玻璃化现象越严重 。
在同一培养基中 ,随着继代次数的增加试管苗玻
璃化程度也增大 ,这可能是由于 6-BA在组培苗
体内积累效应的影响 ,可见榅桲的玻璃化现象与
6-BA的浓度有密切的关系 。此外培养室的温度
太高 [ 15] 、光照太强 、光照时间过长也容易导致玻
璃化现象的发生 。据报道 , 培养基中氮素形
态[ 16] 、琼脂用量 、蔗糖浓度 、pH值 、活性炭添加与
否也对玻璃化现象有重要影响[ 17, 18] 。
3.2　本试验获得的榅桲叶片再生率比较低 ,仅为
24%。RamonDolcet-Sanjuan等 (2006)[ 5] 获得
的榅桲叶片再生率达 78%, BartonS.Baker等
(1993)[ 7]获得的榅桲叶片再生率达 85%,可见本
试验结果与国外还存在较大差距 ,需要进一步探
索影响榅桲叶片再生的因素 ,寻找适合榅桲叶片
再生的条件 ,提高其再生率 。另外取材环境的差
异也会对叶片再生效果产生一定的影响 。
3.3　本试验共采用 3种方式对榅桲进行离体扩
大繁殖:(1)茎段继代繁殖直接获取大量丛生新
梢 ,然后诱导不定根得到大量完整植株;(2)先由
叶片诱导愈伤组织 ,再由愈伤组织诱导不定芽获
得丛生新梢 ,最后诱导不定根获得完整植株;(3)
直接将叶片接种到诱导不定芽的培养基上 ,获得
丛生新梢 ,然后诱导不定根获得完整植株。第 1
种方法简单易行 ,短时间内可获得大量整齐一致
的植株 ,不易发生变异 ,繁殖速度较快。第 2种方
法植株繁殖速度较慢 ,由于植株再生过程中经过
了愈伤阶段 ,再生植株无性系变异较大 ,嵌合体比
例高 [ 19] ;第 3种方法建立的植株再生系统是遗传
转化中最常用的受体体系 ,是遗传转化的基础 ,在
转基因技术方面有重要意义 [ 18] 。
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