全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2010(1):168～ 171
鸳鸯茉莉不同外植体诱导愈伤组织研究初探
袁 　媛 , 连芳青
(江西农业大学园林与艺术学院 ,江西南昌 330045)
　　摘　要:以鸳鸯茉莉花瓣 、叶片 、茎段为外植体 ,MS为基本培养基 ,探索外植体取材季节和部
位对污染的影响;分析植物生长调节剂的种类 、浓度对不同外植体诱导愈伤组织的影响和最适组
合。结果表明:在3 、4月取材比 5 、6月好 ,12月取材效果较差;通过花瓣能成功诱导出健康的愈
伤组织 ,但诱导率较低(27.1%),平均出愈时间为 23 ～ 25 d ,3种外植体中以嫩叶诱导愈伤组织的
效果最好(87.1%),平均出愈时间最短 ,为 18 ～ 20 d;茎段愈伤组织诱导率其次(68.1%),平均出
愈时间为 21 ～ 23 d;2 ,4-D、6-BA对以花瓣为外植体诱导愈伤组织的影响达显著水平 ,花瓣诱导愈
伤组织的最适培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/ L+2 ,4-D 1.0 mg/ L ,2 ,4-D对叶片
诱导愈伤组织的影响达显著水平 ,叶片诱导愈伤组织的最适培养基为 MS+6-BA 2.0 mg/L+
NAA 1.0 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L ,2 ,4-D 、6-B对茎段诱导愈伤组织的影响达到极显著水平;MS
+6-BA 3.0 mg/ L+KT 3.0 mg/ L+NAA 1.0 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L 最适合茎段诱导愈伤组
织。
关键词:鸳鸯茉莉;外植体;生长调节剂;愈伤诱导率
中图分类号:S 685.16　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)01-0168-04
　　鸳鸯茉莉(Brun felsia lati folia Benth.)是茄科(So-
lanaceae)鸳鸯茉莉属常绿矮灌木 ,花多单生 ,有时数朵组
成聚伞花序。花冠高脚碟形 ,径约 3.8 cm ,花具芳香。
花期 4 ～ 10月。性喜温暖湿润气候 ,不耐寒。要求肥沃
疏松 、排水良好的微酸性土壤。喜肥 ,不耐涝 ,不耐强
光[ 1-3] 。
鸳鸯茉莉初开时为淡紫色 ,后变为淡雪青色 ,最后
变为白色 ,由于开花有先后 ,在同一植株上同时能看到
不同颜色的花 ,故又得名“双色茉莉” 。具有“一卉能熏
一室香 ,炎天犹觉玉肌凉”的诗意和极高的观赏价值 ,深
第一作者简介:袁媛(1988-)女 ,湖北人, 在读硕士 ,现主要从事园
林植物栽培与繁育研究工作。 Email:ho tleyy258@163.com。
通讯作者:连芳青(1953-),女 ,教授 ,硕士生导师,现从事园林花卉
栽培学教学与科研工作。 E-mail:lianfangqing@163.com。
收稿日期:2009-09-10
得人们的喜爱[ 3] 。鸳鸯茉莉不结实或结实很少 ,繁殖方
式多采用扦插 、高空压条 ,但繁殖系数较低 ,扦插生根较
难 ,生根率仅8.9%,且生根所需时间长 ,扦插苗生长势
差[ 4] 。远不能满足日益增长的市场需求 ,通过组织培养
技术可有效提高其繁殖系数。鸳鸯茉莉是木本植物 ,一
般用茎段作外植体组织培养分化再生植株 ,自1986年报
道过成功离体培养双色茉莉嫩叶后[ 5] ,以愈伤组织途径
再生植株的报道很少。探索建立愈伤无菌体系的最适
外植体类型及诱导培养基对以后探索愈伤增殖 、分化出
芽 、小苗生根最适培养激素组合进而通过后一种再生途
径成功获得完整植株奠定基础。此外 ,首次以花瓣为外
植体 ,探索产生愈伤组织到分化成完整植株的可行性。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料为江西农业大学花卉教学基地温室大棚
内生长多年的3盆鸳鸯茉莉。
Abstract:Four improved CTAB methods were used to extract genomic DNA from mature leaves of Celtiskoraiensis Nakai
and the extraction effect of the 4 methods was compared.The results showed that the 4 methods obtained no browning
and intact genomic DNA.The method 2(low concentration ethanol and high salt were used to remove polysaccharide)and
4(only low concentration ethanol was used to remove polysaccharide)had the better effect of removing polysaccharide but
with lower DNA concentration than the method 1 and 3.The ISSR amplification results showed that the genomic DNA
extracted by the 4 methods could be used for ISSR amplification but the DNA from the method 2 and 3 had the better
effect of ISSR amplification than the other three methods.
Keywords:Celtis koraiensis Nakai;modified CTAB;genomic DNA;polysaccharide;browning
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1.2　培养条件
以MS为基本培养基 ,添加琼脂 0.6%,蔗糖3%,调
节pH5.8～ 6.2 ,暗培养 ,培养温度(25±2)℃。
1.3　试验设计与统计方法
1.3.1　不同时期无菌体系的建立　2008年 12月中旬
采健康叶片及茎段 ,自来水下冲洗 20 min ,在超净工作
台上分别用 75%酒精表面消毒 20 、30 s ,0.1%HgCl2浸
泡6 、10 min ,无菌水冲洗 4 ～ 5次。接入 3种启动培养
基:MS+6-BA 2.0 mg/ L+NAA 0.5 mg/ L ,MS+6-BA
3.0mg/ L +NAA 0.5 mg/L , MS+6-BA 4.0 mg/L +
NAA 0.5 mg/ L每种培养基接叶片30瓶 ,每瓶 1块;茎
段20瓶 ,每瓶 1个。2009年 3月上旬 、4月中旬采嫩叶 、
嫩茎 ,先在自来水下冲洗 20 min后于超净工作台上分别
用75%酒精表面消毒 15、20 s ,0.1%HgCl2浸泡 6 min ,
无菌水冲洗4 ～ 5次。接入同样3种培养基中 ,每种处理
接叶片 15瓶 ,每瓶 1块;茎段 15瓶 ,每瓶 1个。接入后
每隔 2 d统计外植体的污染瓶数 、死亡瓶数 、出愈瓶数。
1.3.2　正交试验设计与统计　采用 L16(45)正交设计研
究外植体类型对愈伤诱导影响 ,设计 4因子 4水平[ 6] ,4
因子分别为 2 ,4-D 、6-BA 、KT 、NAA ,各因子水平见表 1。
试验材料为 2009年 4月中旬采的花瓣 、嫩叶 、嫩茎。外
植体嫩叶每片 1.0 ～ 2.0 cm2 ,茎段每段 0.5 ～ 1.0 cm ,花
瓣每片0.5 ～ 1.0 cm2 ,每种处理均分别接入花瓣 、嫩叶 、
嫩茎各 12瓶 ,每瓶 1块。接种后每2 d记录1次外植体
的出愈块数 、污染块数、死亡块数。出愈外植体数增加
变快时每天统计 1次 ,以便计算平均出愈时间。通过3
种外植体的愈伤诱导率 ,出愈时间的比较找出诱导愈伤
的最适外植体。采用极差分析 、方差分析找出对各种外
植体诱导愈伤组织影响显著的因子和各外植体最适的
诱导激素种类及水平[ 7] 。
2　结果与分析
2.1　外植体采集时期对污染率的影响
12月采的叶片 、茎段的污染率均为76.66%,明显高
于 3 、4月采的嫩叶(20.00%、12.5%)、嫩茎(48.89%、
40.00%)的污染率。可能是 3 、4月正处在植物萌芽 、抽
梢 ,生长旺盛的时期 ,叶片刚由叶芽分化展开 ,芽鳞随春
梢伸长脱落 ,外植体表面带菌少 ,因此污染率低;12月外
植体表面在生长季节中已累积了尘埃 ,以至污染率
高[ 8] 。
　　表 1　　　L16(45)正交试验因子水平设计
水平 因子/mg·L-1
6-BA K T NAA 2 ,4-D
1 0 0 0 0
2 1.0 1.0 1.5 0.5
3 2.0 2.0 0.5 1.0
4 3.0 3.0 1.0 1.5
2.2　外植体类型对愈伤诱导率的影响
表 3统计了鸳鸯茉莉的花瓣 、嫩叶 、嫩茎的平均出
愈时间 、愈伤诱导率。3种外植体比较 ,愈伤诱导率 、平
均出愈时间大小排序均为:嫩叶>嫩茎>花瓣;污染率
排序则恰好相反 ,嫩叶<嫩茎<花瓣。
　　表 2 不同采取时期外植体叶、茎的污染率与死亡率
外植
体
外植体采集日期
2008年 12月 2009年3月 2009年4月
接入块数 污染块数 污染率/ % 死亡块数 死亡率 % 接入块数 污染块数 污染率/ % 死亡块数 死亡率/% 接入块数 污染块数 污染率/ % 死亡块数 死亡率/%
叶片 90 69 76.66 12 13.33 45 9 20.00 4 8.88 40 5 12.50 3 7.50
茎段 60 46 76.66 9 15.00 45 22 48.89 5 11.11 40 16 40.00 4 10.00
　　注:污染率=污染的块数/接种总块数×100%;死亡率=死亡的块数/接种总块数×100%。
　　表 3　　　不同外植体诱导愈伤组织结果
外植
体
接种
块数
存活
块数
出愈
块数
愈伤
诱导率/ %
平均出愈
时间/ d
污染
块数
污染率
/ %
嫩叶 180 163 142 87.10 18～ 20 17 9.40
嫩茎 180 138 94 68.10 21～ 23 42 23.30
花瓣 180 96 26 27.10 23～ 25 84 46.70
　　注:污染率=污染数/接种总数×100%;愈伤诱导率=未污染外植体启动数/未
污染外植总数×100%。
2.3　激素种类及浓度对不同外植体愈伤诱导直观分析
2.3.1　花瓣的愈伤组织诱导　鸳鸯茉莉的花瓣非常柔
嫩 ,花瓣在水下轻轻清洗后就出现不同程度的黄色。故
对其消毒时 ,只用75%酒精擦拭花瓣表面。接入培养基
后 ,大部分花瓣呈现黄褐色 ,污染率较高 ,死亡率也较
高。未污染的花瓣能成功诱导出愈伤组织 ,且呈现多种
颜色 ,有白色 、黄褐色 、透明色(图1)。其中 ,未出现黄色
的花瓣诱导愈伤组织率普便低于已经变黄的花瓣 ,且生
长情况也差些。在花瓣的愈伤组织诱导结果分析中得
出:R(2 ,4-D)>R(6-BA)>R(NAA)>R(KT), 2 , 4-D因子极差最
大 ,为35.790 ,是影响鸳鸯茉莉花瓣愈伤组织启动的关
键因素 ,其次是 6-BA(R=33.910)、NAA(R =25.960),
6KT(R=10.800)是影响较小的因子。
2.3.2　嫩叶的愈伤组织诱导　存活的未污染的嫩叶在
接入后均能不同程度的产生愈伤组织。嫩叶的最早出
愈时间为13 d ,最晚为 24 d ,愈伤组织在接种后第 18 ～
20天集中产生。将嫩叶愈伤组织生长状况分为 4个等
级(图1)。对正交试验(表 4)嫩叶诱导愈伤率的结果进
行激素不同水平之间极差的分析得出:R(2, 4-D)>R(NAA)>
R(6-BA)>R(KT),2 ,4-D因子的极差最大 ,为47.678 ,是影响
鸳鸯茉莉嫩叶愈伤组织启动的关键因素 ,其次是 NAA
(R=26.383)、6-BA(R=20.748),KT(R=14.188)是影响
较小的因子。
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2.3.3　茎段的愈伤组织诱导　所有存活的未污染的茎
段基部也均产生愈伤组织。最早出愈时间为19 d ,最晚
时间为 27 d ,在接种后21 ～ 23 d集中产生。部分种类培
养基上接入的茎段同时伴随腋芽 、顶芽的分化。如第 7 、
10 、12 、13 、14号培养基(图1)。将茎段基部愈伤组织生
长状况分为 3个等级(图 1)。在茎段愈伤组织的诱导
中 , R(2 , 4-D)>R(6-BA)>R(KT)>R(NAA), 2 ,4-D因子极差最
大 ,为 45.305 ,是影响鸳鸯茉莉茎段愈伤组织启动的关
键因素 ,其次是 6-BA(R=30.252)、KT(R=22.248),
NAA(R=8.357)是影响较小的因子。
2.3.4　不同外植体诱导愈伤组织的激素最优组合　对
不同外植体愈伤组织诱导率的极差分析可以得出:叶片
的最适诱导培养基为 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0
mg/ L+2 ,4-D 1.0 mg/ L ;茎段的最适诱导培养基为
　表 4 不同外植体愈伤组织诱导正交试验方案及结果
处理 水平/ mg·L-1 　愈伤诱导率/ %
6-BA KT NAA 2 , 4-D 嫩叶 嫩茎 花瓣
1 1 1 1 1 0.00 0.00 0.00
2 1 2 2 2 70.00 50.00 0.00
3 1 3 3 3 100.00 84.60 0.00
4 1 4 4 4 100.00 71.40 0.00
5 2 1 2 3 100.00 33.33 57.10
6 2 2 1 4 70.00 33.33 75.00
7 2 3 4 1 66.67 18.20 20.00
8 2 4 3 2 70.00 77.70 0.00
9 3 1 3 4 88.89 80.00 33.33
10 3 2 4 3 100.00 80.00 50.00
11 3 3 1 2 90.90 100.00 0.00
12 3 4 2 1 81.80 62.50 66.67
13 4 1 4 2 100.00 100.00 0.00
14 4 2 3 1 58.30 22.22 0.00
15 4 3 2 4 100.00 88.89 33.33
16 4 4 1 3 100.00 100.00 57.10
　　注:愈伤诱导率=未污染外植体启动数/未污染外植总数×100%。
MS+6-BA 3.0 mg/L+KT 3.0 mg/L+NAA 1.0mg/L+
2 ,4-D 1.0 mg/L;花瓣的最适诱导培养基为 MS+6-BA 1.
0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L。
2.4　不同外植体愈伤组织诱导率的方差分析
对 3种外植体愈伤组织诱导率的结果进行方差分
析 ,确定各激素对各外植体诱导愈伤影响的差异显著
性。各激素及误差项的离差平方和算出后 ,将 F 值小于
1的变异项的平方和和自由度与误差项的平方和和自由
度合并 ,作为试验的调整误差项[ 9] 。合并后方差分析结
果如表 5所示。2 ,4-D对以叶片为外植体诱导愈伤组织
有显著影响;2 ,4-D ,6-BA对以茎段为外植体诱导愈伤组
织有极显著影响 , KT 有显著影响;2 ,4-D ,6-BA对以花
瓣为外植体诱导愈伤组织有显著影响。
　　表 5 不同外植体愈伤组织诱导正交试验的
调整方差分析
变异来源 离差平方和 SS
自由度
df
均方
Ms
F
值
显著性
F0.05 F0.01
嫩叶 6-BA 1 054.001 3 351.3337 1.493 4.760 9.780
NAA 1 578.757 3 526.2523 2.236 4.760 9.780
2 ,4-D 4 850.172 3 1 616.724 6.870＊ 4.760 9.780
调整误差 1 411.94 6 235.3233
总变异 8 894.87 15
嫩茎 6-BA 3 069.865 3 1 023.288 13.301＊＊ 4.760 9.780
KT 1 525.465 3 508.4883 6.610＊ 4.760 9.780
2 ,4-D 4 714.238 3 1 517.413 20.426＊＊ 4.760 9.780
调整误差 461.59 6 76.9317
总变异 9 771.158 15
花瓣 6-BA 3 058.480 3 1 019.493 6.041＊ 4.760 9.780
NAA 1 526.308 3 508.7693 3.015 4.760 9.780
2 ,4-D 3 158.402 3 1 052.801 6.239＊ 4.760 9.780
调整误差 1 012.52 6 168.7533
总变异 8 755.71 15
　　注:＊表示此因子对愈伤组织诱导有显著影响;＊＊表示此因子对愈伤组织诱导
有极显著影响。
图 1　花瓣、嫩叶 、茎段诱导
　　注:第 1排为花瓣诱导愈伤组织的结果。从左往右依次为等级 1、2 、3 、4。第 2排为嫩叶诱导愈伤组织的结果。从左往右依次为等级 1 、2、3 、4。第 3
排为茎段诱导愈伤组织时产生的侧芽及顶芽的分化情况。
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3　结论与讨论
3、4月采取的材料污染率明显低于 12月采取的材
料 ,表明 3、4月份采取生能力强的幼嫩器官比成熟器官
更合适。嫩叶诱导愈伤组织的污染率 、死亡率最低 ,平均
出愈时间短 ,是建立愈伤组织无菌体系的理想材料;嫩茎
的愈伤诱导率其次 ,污染率 、死亡率高于嫩叶 ,但诱导愈
伤的过程中较易伴随芽的分化发生 ,说明嫩茎※芽分化
※根分化※完整植株是鸳鸯茉莉以茎段为外植体再生植
株的较好途径;花瓣诱导愈伤组织污染率 、死亡率高 ,可
能跟消毒剂种类 、搭配及消毒时间有关 ,能产生愈伤组织
的花瓣外植体均黄褐色 ,未变色的反而不产生愈伤组织 ,
这其中可能的细胞生理方面的机理还有侍研究;此外产
生了愈伤组织但后来污染的花瓣致使整瓶培养基均呈黄
色 ,这是否类似褐化的机理还不清楚;花瓣外植体能成功
诱导出鲜活的愈伤组织 ,这为探索通过花器官组织培养
再生完整植株的新途径的可能性奠定了一定基础。
　　L16(45)正交设计中各激素的水平是在预试验结果分
析的基础上设定的。横向比较:3种植体中嫩叶诱导愈
伤组织效果最好。纵向比较:直观分析和方差分析可得
出各激素因子对外植体诱导愈伤组织的影响显著性 ,筛
选各外植体最适的愈伤组织诱导激素组合。为愈伤组织
大量增殖作准备。
外植体※愈伤组织※分化出芽/生根※完整植株和
茎段※芽分化※根分化※完整植株 ,为建立快繁体系的
2种途径 ,试验探索的仅是不同外植体对愈伤组织诱导
上的影响 ,是否能高效快繁还要近一步试验。
关于以花瓣外植体诱导愈伤组织的报道较少 ,仅有
些关于花蕾组织培养的报道[ 10] 。探索花瓣的合适消毒
试剂及消毒时间以降低污染率、死亡率 ,从而近一步分化
成完整植株是值得研究的;此外 ,研究基本培养基类型和
激素与花瓣上胚状体发生概率的关系也值得尝试。
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A Preliminary Study on the Callus of Brunfelsia latifolia Induced by Different Explants
YUAN Yuan , LIAN Fang-qing
(Art and Garden faculty of Jiangxi Agricultural University , Nanchang , Jiangxi 330045)
Abstract:The petal , leaf and stem segment of Brunfelsia lati folia as different explants were cultivated on MS basic me-
dium added hormones of different types and concentrations.Studied the effects of different explants for inducing callus;
Though orthogonal design combined with range analysis and variance analysis , studied the optimal type and concentration
of hormones for each explant to induce callus.The result indicated that:Explants collected in march and april were bet-
ter than explants collected in december;petal as explant could successfully induce normal callus but induction rate was
only 27.1%and average induction time was 23 ～ 25 d;Among three kinds of explant , young leaf s callus induction rate
was the highest(87.1%)and average induction time was the shortest(19 ～ 21 d);the induction rate of stem segment was
68.1%, average induction time was 21 ～ 23 d;2 ,4-D ,6-BA had a significant influence on petal explants callus induction
and the optimal induction medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/ L+2 ,4-D 1.0 mg/L ,2 ,4-D had a signifi-
cant influence on leaf explants callus induction and the optimal induction medium for leaf was MS+6-BA 2.0 mg/L+
NAA 1.0 mg/ L+2 ,4-D 1.0mg/L ,2 ,4-D ,6-BA had a very significant influence on stem explants and the optimal induc-
tion medium was MS+6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/ L.
Keywords:Brun felsia lati folia;explant;plant hormones;callus induction rate
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