全 文 ：遗 传 学 报 , 1 3 ( 1 ) : l 一 1 0 , 1 9 8 6
A d o o 胡e t i加 is n ie 口
紫云英根瘤菌共生质粒的鉴定及
结瘤功能的诱动转移
宁林夫 龚汉英 周路明 刘爱平 岑英华
(中国科学院武汉病毒研究所 ,武汉 )
紫云英根瘤菌 s R 7 2 和 7 6 5 3 1 两菌株都有相同的两个质粒 , 其分子量分别为 2 0 M d 和
80 M d
。 它们各自的 H c N od 一 变株都消失了其中的 20 0 M d 质粒 ,但尚一致地保留着 80 M d 的
质粒 ,紫云英根瘤菌的结瘤功能显然与该 20 0 M d 质粒有极为密切的关系。 Llc l,1 组的质粒能
以 1。一月 /每个受体细胞的频率转人紫云英根瘤菌 , 而在紫云英根瘤菌之间的转移频率为 1丁心
一 1丁 , 。 紫云英根瘤菌的结瘤功能 , 可以通过 1P 组的质粒诱动 , 从野生型 N od 十 菌株转移到
H c N o( 1
一 受体菌株中 , 甚至转移到消除了 i1 质粒的土壤农杆菌中 , 能使紫云英结瘤 。 这
些有结瘤能力的 N 闭十 接合子 , 其抗药性标记完全与 N od 一 受体菌一样 , 但其质粒电泳图潜 ,
既不同于供体 ,也不同于受体 ,缺供体中对应的 20 o dM 大质粒带 ,比受体的却又多了一 40 附
的质粒带 。
农业经济中生物固氮的作用是不可忽视的 ,其中豆科植物与根瘤菌 (邢 i幼 ib “ 。 s P . )
的共生固氮体系最为重要。 根瘤菌属细菌最显著的特点是能侵染相应的豆科作物根系 ,
形成根瘤 。 在根瘤内 ,根瘤菌把分子氮转化成氨供宿主植物利用 ,而植物方面 , 则供应细
菌以光合作用产物 ,使固氮作用得以持续。
要扩大根瘤菌的结瘤宿主范围或提高它的固氮效率 ,鉴定 、分离那些控制根瘤菌结瘤
固氮功能的共生基因是很有必要的 。 过去许多根瘤菌遗传学者曾通过 R 因子接合转移的
途径 ,研究了多种染色体基因之间的共转移关系 ,据此编制了 3 个菌株的染色体基因环状
连锁图 ,但未能把有关共生的基因在图上标出 〔, “ ,` ’ 1。 可是却不断在染色体外遗传成份 中
蛾到了共生质粒〔4 , 5 , 8 , , ,1 2 - 生4 , 2。一 , 2 7: 。目前所知 ,大多数快生型根瘤菌普遍有 l一 3 个质粒〔, ` ,琦 l7, 礼执切 , 其中一个质粒与结
瘤固氮有极密切关系 , 称为 Sy m 质粒 。 有些 Sy m 质粒能自身转移 , 如豌豆根瘤菌的
PJ B , Jl 和 p R L I J I` , ` , ,三叶草根瘤菌的 p R` r s a 〔, , , 。 大多数是不能自身转移的 ,可通过 I n e p l
组的质粒诱动 ( m o bi li z a t so n ) 它转移 〔, 。 , , ` , , , · , , ,。 最近甚至把首信根瘤菌的大段共生基因整
合到质粒 R P 4 上 13[ 阎 , 或把 R P 4 质粒 中的 m ob 序列整合到首蓓根瘤菌的 S ym 质拉
中 L , ,使首信根瘤菌的结瘤固氮基因能转移到其他根瘤菌甚至土壤农杆菌 ( A g or ba c, ` “ 。
sP p
.
) 中 。 对各种快生型根瘤菌 Sy m 质粒的检测 、 判定及其有关功能的遗传转移已 成
为近年根瘤菌遗传研究的一个重要方面 。
本文报告紫云英根瘤菌 S R 72 和 7 6 5 31 两菌株都含有两个质粒 ,通过热处理获得了
本文于 1 9 8 5 年 2 月 , 日收到。
2 遗 传 学 报 13 卷
不结瘤的变株 , 所有这些不结瘤的变株都消失了其中分子量为 20 0 M d 的大质粒 。 野生
型 菌株的结瘤特性可以通过接合转移的途径由 P I 组质粒诱动转移到这些 H c M od 一受
体 菌或清除了 iT 质粒的土壤农杆菌中 , 其结瘤功能得到了表达 。
材 料 与 方 法
(一 ) 菌种与培养条件
1
. 所用菌种 列于表 1。 根瘤菌 、 土壤农杆菌培养在 28 ℃ , 大肠杆菌 (云动 e厅动 ia
co li ) 培养在 3 7℃ o
衰 1 实脸用 . 株
T . b l e 1 5 : r a i n s u s e d i n t h e p r e s
e n t e x p e r i
一1、 e n t s
菌 株 s , r a i n s 遗传标记 G e n e t i c : n a r k e r 来 源 s o u r e e
紫云英根瘤菌 R为 二` o b i : : , 。” ,、 ` g ` , l i f
S R 7 2
7 6 5 3 1
8 4
8 5
8 6
10 3
10斗
l 4
2 7
18 4
18 5
15
1 8 6
土坡农杆菌 才 g , o b a o t ` r i a二
t “ 。 ` f a c i e , 5 A t 1 3 6
假单抱杆菌 p s o u d o o j o 。 ` ,:
` ,` , u ig o o r J P A O 9 5 0 1
大肠杆菌 E , c h e ir c入萝a c o l i
R R I
R R I ( p R p 呼)
R R I ( p R 6 8
.
4 5 )
野生型 w i l d : y p e
野生型 w i ld t y p e
野生型 w i l d t y p e
野生型 w i l d t y p e
野生型 w i l d t y p e
N od
一 S m R R if R d e r i v a r i v e s o f S R 7 2
N记一 S m R R if R d e r i v a r i v e s o f 7 6 5 3 1
s R 7 2 ( p R p l : : T
n 5 0 1 )
, K m R介 CR b R H g R
7 6 5 3 1( p R P I : : T
o 5 0 1 )
,
K m R T c R e b R H g R
8 4 ( p R P z : : T
n 5 0 1 )
,
K m R T e R e b R H g R
5 5 ( p R p l : : T
n s o l )
,
K m R T e CR b
R H g R
s R 7 2( p R p 4 )
,
K : n RT c R e b R
8 6 ( p R 6 8
.
4 5)
,
K , n RT c R e b R
T i 质粒消除株 s m Rc m R △ T i
浙江农科院何福恒
f r o m H e F u h e n g
f r o m H e F u h e n g
武汉 , 本文 t h i s p a p e r
同上 i b id .
同上 i b id .
同上 ib id .
同上 ib id .
同上 i b记 -
同上 ib云d -
同上 i b id .
同上 i b i d .
同上 i b id .
同上 i b i d .
f r o m P
.
H o o y ka a ,
a d 。 , l e “ , c h l . r矛f ( p R p l : : T n 5 0 1 ) f r o n 、 V
.
A
.
S t a n i s i e h
,
19 7 7
P r o le u 才人1 l a c y s t r 为s d R 人了d M
S m R K . n R T c R C b R
s 一1、 R K m R T c R e b R
B o l i v a r
,
1 9 77
D a t t a
,
B a u s ,
1 9 7 1
1 9 7 6
2
. 培养基组成 (每升含克数 ) Y M 基 :
0
.
9
,
M g S O
。 · 7 H盆0 0
.
2
,
C a C 12
·
ZH
ZO
代替 Y M
0
.
1 5
酵母粉 0 . 5 , 甘露醇 3 , K ZH p O , · ; H 孟O
N aC I 0
.
1。 用于根瘤菌 的 培 养 与 保存 。
M基 : 以 (N H 。 ) , 50 -
等。 T Y 基 ; 胰蛋白陈
菌的预培养。 P A 基 :
3 , 酵母粉
基中的酵母粉成份 , 用于淘汰营养缺陷型的 E . co il
2 , ca c1
2
·
2H
2 0 .09
, 用于接合试验前紫云英根瘤
4 , M g s O
。 · 7H : 0 0
.
52 , 用于培养菌 体 作 质 粒 分 离 。
L 基 : 胰蛋 白陈
3
. 抗生素
胰蛋 白陈
酵母粉 3 , N a 1C 5 。 上述各培养基的固体化用琼脂 16 克 。
硫酸链霉素
素 ( K m ) , 根瘤菌使用浓度为
( S m )
, 快生根瘤菌使用浓度为 80 。 产 g / ml 。 硫酸卡那霉
1 5 0一 1 8 0 拼g / m l , 大肠杆菌使用 5 0 科g / m l 。 四环素 ( T e )
宁林夫等 :紫云英根瘤菌共生质粒的鉴定及结瘤功能的诱动转移
使用浓度为1 0 一 20 拼 g/m l 。 利 福 平 (R if ) , U e r m a 产品 , 使 用 浓 度 为 6 0一 5 0 尸g /m一。
H g e l
: 使用浓度为 8拌 g /m l。
(二 ) 抗生素抗性自然突变株的筛选
Y M 琼脂平皿含 Sm 5 0 0 或 l , 0 0 0 产 g / rn l , 或含 R i f 8 0 产 g / m l , 表面稍干供试。 每
皿加 > 10 , 细菌细胞 ,涂布均匀后置 28 ℃ 培养 。 挑取出现的单菌落 , 并经同样抗生素平皿
纯化一次后 ,保存于 Y M 斜面 。
(三 ) 热处理质粒消除法
紫云英根瘤菌 S R 7 2 和 7 6 5 31 的 Sm “ 单菌落经证明结瘤固氮正常后供试。 每个
Y M 琼脂平皿接一满环新长成的细菌 ,浓厚涂布一小区域后 , 再逐步稀释划线 。 每一种菌
接 4 皿 ,其中 2 皿置 28 ℃ 培养 , 2一 3 天长满整个平皿 ,说明接种量足够。 另 2 皿置 36 一
37 ℃ 培养 , 天 ,此期间每天观察是否有细菌生长 , 以全无生长者最为理想 , , 夭后 , 转置
28 ℃ 培养 , 以后长出的单菌落 ,挑取并保存于 Y M 斜面 ,供结瘤试验检查。
( 四 ) 质粒转移的细菌杂交法
根瘤菌 、 土壤农杆菌预培养在 T Y 斜面上 2一 3 天 ,用无菌蒸馏水作成菌悬液 。 大肠
杆菌 、假单抱杆菌 (尸二“ do 二 on o s P . ) 则用 L 液培养 , 3 7℃ 过夜 。
1
, 涂斑法 ( ps tch cr os s) Y M 平板置 37 ℃ 预干过夜 , 把供体和受体菌悬液各 0 . 1
间 混合 , 加到皿 内 , 用曲玻棒展开呈半圆形 。 余下一半面积留作对照区 , 在上下两小半
区中分别点上供体或受体菌悬液 , 适当展开 , 但务使 3 区互不粘连污染。 涂斑干 后 置
28 ℃ 培养 8一 16 小时 ,影印到选择性平皿上 , 观察接合后代的长出 。
2
. 滤膜法 ( ifl et r c or s ) 供体 、受体菌悬液各 3 ml 混合后 ,置过滤器内 , 借助减压
抽滤瓶把细菌细胞收集在孔径为 0 . 45 产 的硝酸纤维素滤膜上 。 将此载菌滤膜移人 YM 平
皿 , 28 ℃培养 1 6 小时后 ,重新作成菌悬液 (约 s m l) ,以此为 1 0 。 稀释度 , 顺作系列稀释 ,用
选择性平皿检查原液 、 1 0一 , 、 1 0一 , 各稀释液中接合子菌落出现数 。 又从 1 0一 ` 稀释液处取
样 ,计算供体 、 受体菌的数量 。 根据各平皿生长出的菌落数 ,推算有关标记的转移频率。
(五 ) 紫云英根瘤菌质粒 D N A 的分离及琼脂箱凝胶电泳鉴定
方法基本按 H i r s c h【川 的设计 , 用 p r o n a s e 、 s D S 、 p H 1 2 . 4 裂解菌体 , 再用 p H 7 . 0
的 1 M T r is 中和至 p H 8 . 0 , 然后用 l / 4 体积的 S M N a C I 沉淀蛋 白及 s D s 。 8 , o o o r p m
去蛋 白后 ,收集上清液后用 10 外 P E G 6 , 0 0 沉出 D N A 。 电泳分析用 0 . 7务 琼脂糖凝
胶 , 缓冲液系统为 T isr 一硼酸 p H .8 3 。 70 一 10 v 电泳 6一 7小时 , E B 染色 , 水漂 , 在紫
外分析仪下观察与照相。
结 果
(一 ) 共生质粒的消除
紫云英根瘤菌 s R 72 和 7 6 5 31 两菌株培养在 36 ℃ 时全无生长迹象 , `培养 , 天后转到
2 8℃培养 ,再过 5一夕天就稀落地长出一些单菌落 (图 1 ) 。 先后两批试脸中挑取近 90 号单
菌落。 逐号接种紫云英幼苗 (在试管内 ) , 观察根瘤的形成 。 结果有 1 / 3 的热处理后长出
的单菌落丧失了结瘤能力 。 持续观察 3 个月 , 野生型亲株一般 10 天左右显现根瘤 , 但
那些不结瘤者在 3 个 月的观察期内全无根瘤发生的迹象。 从中选出几个代表性 的 菌 株 ,
耳 道 传 一 字 很 招 卷
多次重复试验 , 确实没有结瘤能力 , 而且其结瘤性状完全不能自然回复 ,这是根据多年来
10 批结瘤试验观察的结果 , 每批用 > 1。, 的细菌数接种 20 株紫云英幼苗 , 细菌在幼苗的
根际还增殖一段时间 ,只要有一个回复突变恢复感染性的细菌出现 ,就会在观察过程中引
发根瘤 。 所以我们称这类不结瘤的菌株为 H C N od 一 变株 。 根据质粒分离琼脂糖凝胶电
泳图谱 (图 2 )可知 , 亲株 s R 72 和 7 6 5 31 都含有相同的质粒带 , 与快生大豆根瘤菌 P R C
20 5 的质粒带比较 ,其中大者分子量约为 2 0 M d , 小者分子量约为 80 M d 。 而那些 H c
N od 一 菌株 , 都只有 1 条分子量为 80 M d 的质粒带 。 即所有 H C N od 一 变株都丧失了分
子量较大的那个质拉 , 说明这两菌株的结瘤功能与该 2 0 M d 质粒有密切的关系。
图 1 s R 7 2 平皿法热处理结果
右边平皿 28 ℃ 培养 3 天 ,左边平皿在 36 ℃ 经过 , 天后 , 移人 28 ℃ 培养 6 夭 , 长成单菌落 。
F i g
.
1 T h e h e a t e u r r i o g r e s u l t b y t h e p l a t e m
e t h od ( S R 7 2 )
T h e r i a h t p la t e w a s in c u b a tde
a t 2 8℃ fo r 3 d a y s , t h o l e f t p l a t e w a s f i r s t
in e u b a r e d a t 3 6℃ f o r 5 d a y s t h e n s h i f t e d ot 2 8℃ 肠 r 6 d a y s .
经热处理作质粒消除试验的出发菌株是具 Sm “ 标记的 ,所选各 H C N od 一 变株仍具
Sm 取 标志 ,菌落形态与亲株一致 , 为典型的圆而光滑隆起的半透明粘液状菌落 , 生长特性
与生长要求亦基本一致 。 从质拉电泳图谱上也看到亲株与 H C N od 一 变株之间仍有一个
80 M d 的质粒作为亲株与变株之间有遗传连续性的标记 (参阅图 ZA 、 B 、 C 各照片 ) 。 因
而我们认为这些 H C N od 一 变株是 N od 十 野生型的 20 0 M d 质粒缺失后代 ,不是污染的
杂菌 。
(二 ) 结右功能的诱动转移
上述质粒消除试验说明 , 紫云英根瘤菌 S R 72 和 7 6 5 31 含有一个相当于其他快生型
根瘤菌的 S ym 质粒 [’, . ,9 城 .14 17, 叭句 。 它的存在与否和菌株的结瘤性状密切相关 。 继而我们
试图用 P l 组质粒诱动转移的途径 ,把结瘤功能送回 H C N od 一 变株 。
1
. 受体菌的准备 首先使受体菌具 2 种抗药标记 , 以利于接合转移中淘 汰 供 体 。
取 2 号 H C N od 一 变株 ,通过含利福平 1 0 0 雌 /ml 的 Y M 平皿 , 筛取 iR f R 的 自然突 变
体 。 纯化后定名为 1 0 3 、 1 0 4。 其表型为 N o d一 s m R R if R 。
2
. 供体菌的准备 I n e p l 组的质粒如 R p 4 、 R p l : : T n 5 0 1 、 R . 6 8 . 4 5 等除具有广
泛寄主之外 , 还有一定的诱动染色体基因或质粒转移的能力【3 , ` ,两甄执纸 8lz 。 我们用较简便
的涂斑接合法 , 先后把质拉 RPI : : T n5 01 从假单抱杆菌 P A O 9 5 01 转移到对抗生素敏感
1 期 宁林夫等: 紫云英根瘤菌共生质粒的鉴定及结瘤功能的诱动转移 ,
2 00 M d 一
8 0入l d 一
4 0、 l d 一
匕
图 2 紫云英根瘤菌 N o d+ 、南 d 一 菌株的质拉电泳图谱
A : 1
.
s R 7 2 N o
〔
I+ ; 2
、
3
、
4 为 s R 7 2 的 H c N o d 一 衍生株 。
B : 1
. 携质粒 R P I: : T n 5 0 1 的 s R 7 2 ; 2 . s R 7 2 ; 3 j 、 5、 6、 7 为 s R7 2 的 H c N od 一 衍生株 .
C : 1
. 为 N o d+ 菌株 7 6 5 3 1 ; 2、 3、 4 、 5 为 76 5 3 1的 x于 e N〔 , : 1一 衍生株 。
注 : A 中的 2 、 3 、 斗 与 B 的 3、 4、 5 是相同的菌株 , 但从 “ 中 可看出那移动较快的质拉带似 含有两
个分子量十分 相近的质拉 。
F ig
.
2 E l e e t r o !
,
l
、 (一r e Li c e h a r a c o e r i z a , i o n o f l, l a s m i d s i n R
.
a ,t r啥 a l i萝 S R 7 2, 7 6 5 3 1 . N o d 备
a n d N o d
一 s飞r a i n s
A : L a n
e
l
, S r r a in s R 7 2; L a n e s Z , 3
, 峪, t工l e H e N o d 一 d e r i u v a t i v e s o f s R 7 2 .
B : L a n e l
, s t r a in 1 4 ; L a
一i e
Z
, s R 7 2; L a n
e s 3
,
4
,
5
,
6 , 7 , t h e H C N o d
一
d o r i v a t i
v e s o f s R 7 2
.
o : L a n e l
, s 一r a i n 7 6 5 3 1 ; L a n e Z , 3 , 4 , 5 , t il e H C _ N o d 一 d e r i v a t i v e s o f s t r a i n 7 6 5 3 1 .
的野生型紫云英根瘤菌 S R 7 2 、 7 6 5 3 1 、 84 、 85 等菌株中。 接合子菌落长出后随机挑取数
个 ,经多次在 M + K m 1 8 0 群g八ln 的平皿上纯化后 ,证明没有混杂 P A O 9 5 01 后 , 各项抗
药标记也检查过证明表达后 ,再用 E . co il R IR 菌株为受体 , 以含 lP 组质粒的紫云英根
瘤菌为供体 , 作涂斑杂交法检查 , 证明紫云英根瘤菌所含的 P 组质粒能够转移到 E . 0 1
R
I 中。 再经结瘤试验 , 明确此菌株的结瘤固氮性能正常 。 其代表性菌株就是表 1 中的
6遗 传 学 报1 3卷
1 4
、
7 2
、
1 4 8
、
5 1 8
。 它们具有如下表型:N o d+ F i x+ K m R TR eH gRs ms。 用同样的过程还把质
粒 R P斗、 R. 8 6.5 4 转人其他紫云英根瘤菌中。 各质粒转移频率列于表 2 o
农 21 。 。 Pl组质较的转移级率
T ab l e2 h T et rn as f er fr equ n e ei es o fI n ep l gru o n nls am i ds
供 体
Do no r
携带质粒名称
Pl as l ni(1 r r a ei
e
d受体 R e ei pi n et
转移频率
Trn as fr efr equ n e ey
l )er rc ei Pi e。 七 e el l
结瘤功能诱动转移
M o l
〕
i i l z at
二 j o o z f
o n du l a之 i o n fu n eri o n
十
十+
A P5 O 91 0
A PO 95 1 0
PAO 95 01
PAO 95 01
R R I( pR p翎 )
1 任
l4
l4
1 4 8
15 8
5 1
1 8 6
7 2
R PI: : Tn5 1 0
R PI: : Tn5 1 0
R I
J
I: : Tn5 1 0
R I, l : : r n 50 1
R I〕 4
R l
〕
I : : T n 5 0 1
R l , 1 : : T n 50 1
R I J I : :
’
f n 50 1
R l , l : :
’
f n 5 0 1
R I , 1: : T n 50 1
R l〕 4
R
.
6 5
. 斗5
R l〕 l : :
’
f n 50 1
7 2
了6 5 3 1
8斗
8 5
7 2
10 3
1 0 4
R R I
1 0 3
10 3
10 3
A t 1 36
A r 1 36
~ 1 0
一 4
, 10
一`
~ l
r二一 4
, 10
一 4
闷 10一
1 0
一 4一 10一 ,
10
一刁一 10一 ,
10
一 3一 10 一`
10
一 `一 l e一 ’
1 0
一 月一 10 一 ,
10
一 4一 1 0一 ,
10
一 ,
! 0
一 ,
3
. 结瘤功能的诱动转移 采用滤膜接合法 ,以含 Sm 80 0群 g / ilT 十 K m 1 8 o拜 g /ml 的
Y M 培养基来选取接合子 。 一般在 10 。 稀释度 0 . l ml 点样的平皿上出现 40 0一 2 , 0 0 个
菌落。 用影印法经上述含药平皿选择 1 次 , 再经 2 次 R迁 60 雌 /mI 的药物选择后 , 长出
图 3 质粒 D付 A 电泳图谱
1
.
s R 7 2 ; 2
.
P R C 2 0 5 (它含 3 个质粒 : a . 6 0M o l ; b . 9 6M d . ; e . 2 0 0M d . ) ; 3 . s R 7 2 ( p R p l : :
’
r n 50 1) ; 咚. 10斗 号菌株 ; 5· s R 7 2 ( p R p l : : T n 5 0 1 ) 火 1 0 4 的根瘤分离物 , N od + 接 合子 ; 6· 7 · 8
是 1 8 4只 } 03 的根瘤分 离物 N od 十 接合子 ; .9 是 8书 N od + 野生型菌株 。
F i只 . 3 A g a r o s e g e l e l e e t r o p h o r e s i s o f p l a s m i d D N A i s o l a t e d f r o m :
1
.
s R7 2; 2
.
R
.
z t, 户o o t `二` , n l , RC 2 0 5 ( e o n t a i n s 3 p l a s ,。 id b a n d s : a . 6 0M d ; b . 9 6M d ; e . 2 0 0
M d
.
) ; 3
.
S t r a in l 4 = s R 7 2 (一、 Rp l : : 1
’
n 5 0 1 )
; 4
.
H C N o d
一
10 4 ; 5
·
a N o d + r r a n s c o 川 u g a n t f r 。 , n
1 4只 10月; 6 、 7 、 5 . t h e N o o l+ 。r a n s c o n iu g a n t s f r o m 18 4火 1 0 3 ; 9 . w i ld t y p e N o d + s t r a i o s 斗.
宁林夫等 : 紫云英根瘤菌共生质粒的 鉴定及结瘤功能的诱动转移
图 4 紫云英植物的结瘤情况
^
.
N o d+ Fi
: 十 供休菌株所结的根瘤 ; B. H c N o d一 受休菌株不结 根瘤 ; C . 用 1 8 4又 1 03接合子
接种后结瘤情况 ; D . 用 工86 火 At l3 6 接合子接种后结瘤情况 , 根瘤细小 : F . 用 2 7火 tA 1 36 接合
子接种 , 根瘤小 , 长不大 。
F i g
. 斗 N o d u l a r i o n o f z了r ,` 存 g ` zl u ` p l a n t s in o c u l a t e d w i t h :
A
.
D e n o r : t r a i n N o d + F i x + ; B
.
R e c ip i e n t s r r a in 10 3 ; C
.
18斗又 1 0 3 t r a : 、 s e o n i u g a n t s s h o w n
n o r m a l o o d u l e s ; D
.
18 6 x A t l 36 r r a n s e o n i u g a n r s 51, o w n s : n a l l p s e u d o n o d u l o s舍 E . 27 只 A r 1 3 6
t r a n s e o n i u g a n t s s h o w n s m a l l p s e u d o n o
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.
的菌落用无菌水洗脱 ,每皿收得 3 ml 悬液 , 系列稀释成 1。 。 、 l 。一 ` 、 1 0一 2三级 ,分别接种长
在琼脂斜面上的紫云英幼苗 ,每管 1 间 , 置温室中观察 6一 8 周 。 一般用 1 0 。 、 1 0一 , 稀释
度接种的每支试管 (内植 2 株幼苗 )可出现 l一 5个根瘤 , 待根瘤长到 1 m m 左右时 , 收获
根瘤作其内含物的分离 , 并判明该根瘤是由哪一型根瘤菌侵染形成的。 几批实验共回收
52 个根瘤 , 其中 38 个根瘤的内容物能在 Y M和 YM 十 iR f 6 0 邢 / lm 的平皿上都长出数量
相当的菌落。 据此我们鉴定出一批具有如下表型的接合子 : N o d 十 S m限 if “ K m R T c RH g “ ,
其中一些能稳定地使紫云英结瘤 。已重复多次 ,此类 N od + 接合子的抗药性标记不同于供
体 ,其质粒电泳图谱也不与供体完全一样 (图 3 )。 它们比受体菌多了 1 个 40 M d 的 P I
组质粒 , 但没有供体菌那个 20 0 M d 质粒 。 从这些性状看来 , 这咋 N od 十 接合子是 H C
N o d
一 受体菌的获得了结瘤功能的后代 。 图 4 说明通过接合转移 , 紫云英根瘤菌的结瘤
基因 ,可以在 P l 组质粒的转移过程 中被诱动而转移到不结瘤的 H C N od 一 1 0 3 、 1 0 4 菌
株中 ,重新获得结瘤功能 , 甚至还能转移到消除 了 iT 质粒的土壤农杆菌中 ,使它能在紫云
遗 传 学 报 1 3卷
英幼苗根系上结出不固氮的畸型小根瘤 (图 4 D、E )。 从这些畸型小根瘤中仍可分离到
土壤农杆菌的接合子 ,它们从菌落形态 、 生长特征 、抗药标记方面与供体显著不同 ,从质粒
电泳图谱上也可看出这些畸形小根瘤分离物是土壤农杆菌的后代 (图 5 ) 。
图 , 农杆菌质粒 D N A 电泳图
1
、
2
、
3
、
4
、
5 为从 1 8 6 x A t l 3 6 的小根瘤分离物 N do + 接合子的质拉图 ,所显质粒带为 R . 6 8 . 月5。
原携 有 2乃 M d 的隐蔽质校不够清楚 ; .6 为 t^ 13 6 , 原携有 2 75 M d 大质粒不够清楚 。
F i g
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5 A g a r o s e g e l o l e c t r o p h o r e s i s o f P l a s m i d D N A i s o l a t ed f r o , n 心产。去。 c z o r iu , z。 。可。 c -
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L a n e s l , 2 , 3 , 4 , 5 , t h e N od
+ L r a n s c o u i u g a n t s f r o m c r o s s 18 6火 A t 1 3 6 p s e u d o : : o d u l e s s a m p l e s
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n o t c l亡 a r
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讨 论
平皿法热处理消除 s y m 质粒获取 H C N o d 一 的根瘤菌变株 ,方法简便 ,效果好 ,而且
可随时监测有无杂菌污染。 紫云英根瘤菌 S R 72 和 夕6 5 31 两菌株都有相同的两个质粒 ,
其中较大的那一个 20 0 M d 的是与结瘤功能有密切联系的 s ym 质粒。 因为热处理选出
的所有 H C N od 一 变株不论 S R 72 的或者 7 6 5 31 起源的都缺少了这个质粒。 可以认为
决定这两菌株结瘤功能的关键遗传成份位于此质粒上 , 这是与 目前报道的许多快生根瘤
菌的 S y m 质粒相类似的。 通过热处理获取不结瘤变株 , 比较结瘤的亲株与不结瘤变株的
质粒图谱 ,可认识此类 s ym 质粒的存在 。 至于此 S y m 质粒能否自身转移 ,如何设计使其
转移出去 ,观察其表达及鉴定其完整存在 ,跟踪其转移后的命运等等 , 这又是更深一层的
工作 。 因为紫云英根瘤菌不能在培养条件下表达固氮活性 , 这些 H C N od 一变株的固氮基
因成份是否也消除了 ,我们尚无直接证据 ,只有以后用 ’ ZP 标记的 爪了基因探针来判定 。
nI
o P I 组质粒可以转移人紫云英根瘤菌 , 也能在紫云英根瘤 菌之间转移 。 其转移频
率与已报道的该类质粒在各种根瘤菌转移的频率相近 ( 1 0 -一 1 0” ) 。 紫云英根瘤菌的结
瘤功能可以通过 Icn PI 组质粒媒介下的接合转移途径 , 转移到 H C N od 一 的变株 ,使其
重新获得结瘤能力。 说明这类 lP 组质粒诱动宿主基因转移的特性是带普遍性的 , 在遗
传研究上 , 它们是有用的工具 。
获得结瘤能力的 H C N od 一 变株的后代 (也就是杂交转移后的 N od 十 接合子 ) 的存
在 ,使我们认识到结瘤功能是转移了 ,但从这些 N od 十 接合子的质粒图谱上未见 2 0 M d
质粒带的存在 。 这与 L or ik e w i cz 19 81 年 s1t] 报道通过接合转移途径 , 带 R . 68 . 45 的首
信根瘤菌能使 H C N od 一 三叶草根瘤菌重新获得与三叶草结瘤的能力 , 但在其质粒电泳
1期 宁林夫等 :紫云英根瘤菌共生质粒的鉴定及结瘤功能的诱动转移
图谱上只见新增加了 R .8 6. 4 5质粒带 , 供体的大质粒并未出现在 N od 十 接合子中的事实
十分类似 , 作者认为只把结瘤基因转移过去 , 整个的 Sy m 质粒并未转移。 H isr hc 1 9 8魂
年阴 报道了克隆在质粒 p B R 32 2 上的 8 . 7 kb 首信根瘤菌结瘤基因能在土壤农杆菌中
表达的事实 ,这说明根瘤菌的结瘤基因可以离开 S y nt 质粒 , 到新的复制单元中仍能表达
其功能 。 所以关于紫云英根瘤菌结瘤基因在诱动转移过程中的行 踪 及 其 在 N od 十 接合
子中的定位 ,是值得进一步研究的 。
许多快生根瘤菌的 S ym 质粒 ,通过接合转移的途径 , 能转移到土壤农杆菌中 ,并得到
表达 。 即土壤农杆菌的接合子能分别地 (根据供体的宿主特异性 )引起三叶草 、 豌豆 、 首
着 、 虹豆幼苗根系形成不固氮的小根瘤〔 , ;.l ,l3 ,l7 ,zJ 。 甚至克隆出来的首信根瘤菌 ” do 基因
片段 , 当转移到土壤农杆菌中后 ,也赋予该土壤农杆 菌诱发首蓓根系结出 不 固 氮 的 小 根
瘤〔10 刃阳。 我们也观察到紫云英根瘤菌的结瘤功能 , 通过 Icn P I 组质拉的媒介 , 能转移
到土壤农杆菌中 ,使紫云英幼苗根系形成不固氮的细小根瘤 (图 4 D 、 E ) 。
生产根瘤菌接种剂的菌株过去是以从自然界中选择为主 , 今后显然可以通过质粒转
移 、 基因重组的途径更有效地培育优良菌株 , 以增大根瘤菌在农业上的贡献。
参 考 文 献
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[ 2 3 ]
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R“ e n b e gr , C . e t 习 . : 1 982 . J· Bac z e r io l . , 1 50 : 40 2e 40 6 .
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0 1遗 传 学 报 ” 卷
I de n tf i ie a t i on of a Sy mP l as mif dr omR h i z o` iu沉 as t ra a gl i i
a n dT ra ns f e r of th e D e te r mina n ts f r o N o dul a t i onA bil iy t
Nin g Linf uG n ogHa l iy in gZ h u oLu i m z, 9 L i u A IP i n g C e n Y i n g l z : 、 a
(平“ 八a邝 I刀对it “ re o / V分时。刀 , A c 口刁绷动 J动 ica , W扮子1` ” )
A b s t r a e t
Z硫 o b讯饥 as t r a a a l艺苏 s t r a i n S R 7 2 。、n d s t r a i n 7 6 5 3 1 bo t l一 e a r r y 、 im i l , 、 r tw o P l a s m id s
w i t h t h e m o l e e u l a r w e i沙 t 2 0 0 M d a n d 80 M d d e t e e t e d b y a g a r o s e g e l e le e t r叩h o r e s i s . In
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一 n o d u l a t i n g (H C N o d
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) m u t a n t s 介 o m ht 昭 e s t拍 i n s , t h e 2 0 0 M d P l a s m id w朋
m啼 i n g b u t ht e 8 0 M d P l a sm id w a 、 m a i n t a i n e d u n i f o r m l y . T h i s 2 0 0 M d p las m i d i台
s u g g e s et d t o b e t h e S y m P l a sm id
e a r叮 i n g t h e g e n es f or n od u lat i n g P lan st o f A . 5 1” 众 ,` 5 .
C铭 S 。
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