全 文 ：第 33 卷第 2 期 中南民族大学学报(自然科学版) Vol． 33 No． 2
2014 年 6 月 Journal of South-Central University for Nationalities(Nat． Sci． Edition) Jun． 2014
收稿日期 2013-11-11
作者简介 程国军(1976-)，男，副教授，研究方向:微生物学，Email:chengguojun@ mail． scuec． edu． cn
基金项目 国家自然科学基金资助项目(30800021)
铜胁迫下菌株 CL01 促进紫云英生长的研究
程国军，曾小波，周艳琳，田梦洋
(中南民族大学，生命科学学院，武汉 430074)
摘 要 从湖北某矿区植物根际土壤中筛选到了一株多种重金属抗性菌株 CL01．根据形态学特征和 16S rDNA序
列比较了结果，鉴定其为 Achromobacter xylosoxidans．当土壤所含铜浓度为 75 mg /kg时，接种菌株 CL01 可以促进紫
云英根延长，增加植株高度，提高紫云英的生物量．菌株 CL01 通过减少根际土壤可吸收的铜含量，减少了铜在紫云
英根部的聚集，说明该细菌提高了植物的抗铜能力．
关键词 植物生长促进菌种;重金属抗性;鉴定;生物量;铜胁迫．
中图分类号 S154． 3 文献标识码 A 文章编号 1672-4321(2014)02-0028-04
Growth-Promoting Effect of Strain CL01 on stragalus sinicus
under Copper Stress Condition
Cheng Guojun，Zeng Xiaobo，Zhou Yanlin，Tian Mengyang
(College of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)
Abstract A heavy metal resistant strain CL01 was isolated from the rhizosphere soil of a heavy-metal mine area in Hubei
Province． The strain was identified as Achromobacter xylosoxidans based on the morphological characteristics and an analysis
of the 16S rDNA sequence． With 75 mg /kg Cu2 + in the soil，inoculation with the CL01enhanced root growth could increase
plant height and the weight of biomass． It revealed that CL01 significantly decreased Cu accumulation in the roots． Thus by
reducing the amount of absorbable Cu in rhizosphere soils，copper resistance of plants was improved．
Keywords plant-growth-promoting strain;resistant to heavy metals;identification;biomass;copper stress
近年来，由于人口的快速增长和工业化进程的加
速，环境污染加剧，土壤遭到破坏，尤其是土壤重金属
污染．土壤重金属污染的污染物在土壤中很难移动，
滞留时间较长，难以被其他微生物降解，并可通过水、
植物媒介的传递而影响人类生命健康［1］．
为缓解土壤重金属污染问题，国内外专家曾采用
非毒性改良剂法、深耕法、排土法、客土法及化学冲洗
等方法，但受方法的局限性，均未能得到理想的治理
效果．近年来，生物学方法因成本低、能耗小、无二次
污染、处理效果好，具有广泛的应用前景［2］．
本文从湖北大冶市某矿区某植物根际土样中筛
选到 1 株重金属抗性菌 CL01，并根据其形态和 16S
rＲNA基因序列，对其进行了鉴定．在模拟铜污染土壤
中种植紫云英，发现其具有较好的促进紫云英抵抗铜
胁迫的作用，通过测定紫云英的生物量、植株不同部
位的含铜量和土壤中不同状态铜含量，进一步揭示了
该细菌促进植物抵抗铜胁迫的机理，为重金属污染土
壤的微生物修复提供了重要的理论基础．
1 材料与方法
1． 1 材料
752型紫外可见光光度计(上海光谱仪器有限公
司)，AA1700原子吸收分光光度计(浙江福立分析仪
器有限公司)，DNA凝胶回收试剂盒(博大泰克)，2 ×
Power Taq PCＲ MasterMix(北京百泰科生物技术有限
公司)，pMD18-T Vector (宝生物工程大连有限公
司)，测定分析所用试剂均为分析纯，由国药集团化学
试剂有限公司生产．
氯化铜(CuCl2·H2O)配成所需浓度，一次性拌
入供试土壤．供试土壤取自中南民族大学生物实验
园，经自然风干后碾碎过2 mm筛，与洗净风干的砂等
质量混合．混合土壤含有机质 13． 6 g /kg，速效氮 58
mg /kg，速效磷 19． 7 mg /kg，速效钾 205 mg /kg，
pH 6． 65，有效铜 0． 43 mg /kg，全铜 4． 22 mg /kg．将供
试土壤 121 ℃灭菌 1 h，连续灭菌 2次，备用．
紫云英(Astragalus sinicus)，本实验室保存．细菌
在 LB培养基中过夜培养后离心收集菌体，用无菌水
洗涤 3次后制成菌悬液，悬液菌浓度约为1 ×109 cfu /
ml，4 ℃保存备用．
1． 2 重金属抗性细菌的筛选和抗性水平
取湖北大冶市某矿区植物根圈的土样 1 g 加入
含有 99 mL无菌蒸馏水并带有玻璃珠的三角瓶中，放
置于 37 ℃摇床(200 r /min)振荡 30 min．静置后取样
涂布含铜和铬的 Luria － Bertani 平板中，置于 37℃生
化培养箱中培养 48 h，待其长出菌后，挑取菌落进行
纯化培养，LB斜面 4℃保存．
分别倒置含不同浓度梯度的重金属 LB 平板，接
种后于 37℃生化培养箱中培养 48 h 后，观察菌体生
长情况，检测细菌对不同重金属的抗性水平．本实验
所用的重金属盐分别为:K2CrO4，ZnSO4·7H2O，
CdCl2· 2． 5H2O，CuSO4 · 5H2O，NiSO4，MnCl2 ·
4H2O和 Pb(C2H3O2)·3H2O
［3］．
1． 3 16S rDNA的 PCＲ扩增和序列测定
取对数期的菌液，离心后收集菌体，抽提细菌基
因组的总 DNA． 以基因组 DNA 为模板扩增 16S
rDNA．扩增引物选用细菌的通用 PCＲ引物，正向引物
(5 AAGGAGGTGATCCAGCC 3)，反 向 引 物 (5
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3)． PCＲ 程序为:94 ℃
预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 1 min，72 ℃
延伸 2 min． 循环 30 次，72 ℃延伸 10 min［4］． 16S
rDNA PCＲ扩增产物先用琼脂糖凝胶回收，再克隆到
pMD18-T载体，经过抽提质粒、酶切和 PCＲ 验证后，
由北京三博远志公司测序．
1． 4 16S rDNA的系统发育分析
通过 Blast程序，将测定的序列与 GeneBank数据
库中己有的 16S rDNA 序列同源性比较分析，采用
Bioedit和 MAGE 4． 0 软件以邻位相连(Neighbor-
Joining)法构建进化树．选取同源性高的菌株中各个
不同属的一些代表菌株用于系统发育树的构建［5］．
1． 5 盆栽实验设计
将泥土装入塑料盆中，选颗粒饱满大小均匀的紫
云英种子，用 95%乙醇预处理 5min，再用 2%次氯酸
钠灭菌 30 min，无菌水洗涤 8 ～ 10 次．种子在无菌水
中充分吸涨后，均匀铺于琼脂平板，22 ℃倒置催芽 2
d，催芽后的种子载入盆中．
实验设 4个处理:无菌无铜、有菌无铜、无菌有铜
和有菌有铜，每个处理 5 个重复．有铜组按 75 mg /kg
土壤一次性加入 CuCl2 溶液(铜溶液提前 20 d 加入，
塑料盆下放一个托盘，将盆底流出的液体重新倒入花
盆，以防铜流失)．有菌组则在栽种 3 d后于根系按每
棵植株 1mL加入菌悬液．培养过程在智能人工气候
培养箱中进行，设置白昼:20 ℃，18 h，湿度为 70 %，
光照强度 3 级;16 ℃，6 h，湿度为70 %，光照强度 0
级． 2 d浇 1次营养液．培养 35 d后，分根和地上 2 部
分收集植株，并收集根际土壤．
1． 6 植物生物量和铜含量的测定
分别测量紫云英根和地上部分长度，称量鲜重．
将各部分经 150 ℃烘干 2 h，75 ℃下 24 h，称量干重．
对紫云英根和地上部分进行消解，获得上清液用分光
光度计测定铜含量［6］. 提取根际土壤中可交换态和
碳酸盐结合态的铜，并用分光光度计测定铜含量［7］．
1． 7 统计方法
实验数据均采用 SPSS统计软件分析相关数据的
差异显著性．
2 结果与讨论
2． 1 抗重金属微生物的筛选和分离
从分离培养基平板中挑取单菌落，经过筛选获得
一株能在含 CuCl2 和 K2CrO4 均为 1 mM的培养基上
生长良好的菌株 CL01．在营养琼脂平板上培养2 d后
可见其菌落边缘整齐，表面湿润，半透明，呈浅黄色．
CL01菌株革兰氏染色呈阴性，菌体杆状，无芽孢．
2． 2 Y3菌株对多种重金属离子的抗性
本实验测定了 CuSO4·5H2O，K2CrO4，CdCl2·
2． 5H2O，ZnSO4·7H2O，NiSO4，MnCl2·4H2O 和 Pb
(C2H3O2)·3H2O等 7种重金属对 CL01 菌株的最低
抑菌浓度(见表 1)．结果表明:菌株 CL01 对不同重金
属离子的抗性各不相同，对镉的抗性较弱，仅在含
Cd2 +浓度 1 mmol /L 的培养基上生长，而对 Mn2 +和
Pb2 +的抗性很强，其抗性浓度均达到了 5 mmol /L．另
外，菌株对 Cr6 +、Zn2 +、Cu2 +、Ni2 +等重金属离子的抗
性浓度也均达到了2 mmol /L．对7种重金属的抗性试
验分析表明，菌株 CL01 具有普遍较高的重金属抗性
能力．
92第 2 期 程国军，等:铜胁迫下菌株 CL01 促进紫云英生长的研究
表 1 菌株 CL01对多种重金属离子的抗性
Tab． 1 Ｒesistance to multiple heavy metals in CL01
菌株
重金属离子浓度 /mM
Cr6 + Cd2 + Zn2 + Ni2 + Cu2 + Mn2 + Pb2 +
CL01 2 1 2 2 2 5 5
2． 3 16S rＲNA基因的克隆与序列分析
以菌株 CL01的 DNA为模板进行 PCＲ，获得一条
约 1． 5 kb的特异性片度，经回收、转化后，挑选阳性
克隆进行测序． 利用 Blast 程序，将测序所得的 16S
rDNA部分序列和 GenBank 已登录的 16S rDNA序列
进行核苷酸序列同源性比较，结果表明:菌株与
Bordetella、Alcaligenes、Achromobacter 等属中多个种的
16S rDNA 序列具有高度同源性，与 Achromobacter
denitrificans BMB-N6、 Achromobacter xylosoxidans
CONC18、B． bronchiseptica Bb4、B． hinzii AU12584、
Alcaligenes denitrificans等菌的同源性均超过了 99% ．
2． 4 16S rDNA的系统发育分析
将 CL01 菌株的 16S rDNA 部分序列提交
GenBank进行 Blast，下载同源性最高的 12 株不同属
的细菌 16S rDNA，采用 BioEdit 软件进行序列比对后
采用 MEGA4． 1软件进行系统发育分析(见图 1)．由
图 1 可 见，CL01 菌 株 与 Achromobacter 菌 属 的
Achromobacter xylosoxidans 细菌亲缘关系最近，而与
Alcaligenes 和 Achromobacter 属在进化上的距离相对
较远．依据前面形态学和染色观察结果，可判定所分
离的 重 金 属 抗 性 菌 株 可 能 为 Achromobacter
xylosoxidans． 在系统发育地位上则属于 Bacteria，
Proteobacteria， Betaproteobacteria， Burkholderiales，
Alcaligenaceae，Achromobacter xylosoxidans．
图 1 CL01菌株的 16S rDNA序列的系统发育树
Fig． 1 Phylogenetical tree derived from the 16S rDNA
sequence of strain CL01
2． 5 铜胁迫下紫云英生长的测定
铜是植物生长必需的微量元素，但过量的铜会给
植物的生长带来毒害［8］．在无菌有铜环境下生长的紫
云英与对照组(无菌无铜组和有菌无铜组)相比，表
现出明显的外部形态上的诸如叶片出现斑纹、植株失
绿和根系萎缩等明显的重金属中毒症状．可见该浓度
下的 Cu对紫云英的生长有抑制作用，这和此前有关
铜离子对紫云英作用的报道相一致［9］．而有菌有铜处
理下植株的生长水平显著提高，其植株地上部分高度
为 39． 33 mm，根长为 57． 67 mm，植株鲜重为
0． 2278 g，达到了无菌无铜处理下植株的生长水平，
二者均显著高于无菌有铜处理下植株地上部分高度
13． 83 mm，根长 12． 33 mm，植株鲜重 0． 0386 g(见图
2)，说明 CL01能促进紫云英抵抗 Cu 的胁迫作用，提
高了紫云英的生长能力．
图 2 不同处理下对紫云英的生物量的差异
Fig． 2 The difference of biomass of Astragalus sinicus
under various processing
2． 6 铜含量的测定
与无铜对照组相比，加铜条件生长的紫云英根部
铜吸取量显著增加，表明铜胁迫会促使加大植株对铜
的摄入量(见表 2)．然而，有菌有铜处理植株根部的
铜摄取量为0． 6 mg /kg ，远低于无菌有铜对照处理摄
取量 1． 74 mg /kg，表明 CL01 的存在显著缓解了植株
对铜离子的吸收．相比之下，紫云英地上部分所含铜
浓度的变化不明显．说明重金属被紫云英吸收以后，
03 中南民族大学学报(自然科学版) 第 33 卷
大部分停留在根部，少量向地上部分迁移．此结果与
已有研究报道一致［10］．
紫云英根际土壤不同形态铜，结果表明:尽管
CL01菌株对有铜处理根际土壤水溶态铜含量影响较
小，有菌有铜处理根际土壤可交换态含量为
2． 62 mg /kg，显著低于无菌有铜处理可交换态含量
4． 11 mg /kg(见表 2);而有菌有铜处理根际土壤铁锰
氧化物结合态含量为 17． 96 mg /kg，高于无菌有铜处
理可交换态含量 11． 51 mg /kg．根据植物根对土壤中
重金属吸收的难易程度，可将土壤中重金属大致分为
可吸收态、交换态和难吸收态 3 种状态．研究表明，土
壤溶液中的金属如游离离子易为植物根所吸收，结合
态等难以被植物所吸收，而交换态介于两者之间，主
要包括被粘土和腐殖质吸附的重金属［11］．铁锰氧化
物结合态重金属是以矿物的外囊物和细粉散颗粒存
在，活性的铁锰氧化物比表面积大，吸附或共沉淀阴
离子而成［12］．本研究表明:土壤中较高浓度的铜会对
植物的生长产生毒害作用，而 CL01 菌株通过形成较
高含量的铁锰氧化物结合态铜，有效降低了土壤中水
溶态和可交换态铜含量，减少了植物对铜的吸取量，
并降低了铜对植物的毒害作用．
表 2 不同处理对紫云英植株含铜量和根际土壤铜浓度的影响
Tab． 2 The impacts of copper content of Astragalus sinicus and rhizosphere soils under various treatments
处理
植株不同部位铜浓度 /(mg·kg －1)
根部 地上部分
根际土壤不同形态铜浓度 /(mg·kg －1)
水溶态 可交换态 铁锰氧化物结合态
CK 0． 06 ±0． 028 0． 018 ±0． 004 0． 97 ±0． 115 0． 43 ±0． 300 1． 58 ±0． 15
CL01 0． 06 ±0． 033 0． 012 ±0． 001 0． 97 ±0． 058 0． 52 ±0． 012 1． 48 ±0． 18
Cu(75) 1． 74 ±0． 402* 0． 016 ±0． 001 1． 04 ±0． 055 4． 11 ±1． 520* 11． 51 ±1． 51*
CL01 + Cu(75) 0． 60 ±0． 226 0． 015 ±0． 014 1． 07 ±0． 055 2． 62 ±0． 614 17． 96 ±1． 72
根部、可交换态、铁锰氧化物结合态同列，与有菌有铜相比:* p ＜ 0． 05
3 结论
(1)本实验筛选到的菌株 CL01 具有抗多种重金
属能力，经 16S rDNA 序列比对，判断该菌属于
Achromobacter．
(2)在模拟铜污染土壤中种植紫云英，发现其具
有较好的促进紫云英抵抗铜胁迫的作用．在含铜环境
下，加菌处理植株地上部分高度、根长、植株鲜重，达
到了无菌无铜处理下植株的生长水平，二者均显著高
于无菌有铜处理下植株．表明 CL01 能促进紫云英抵
抗 Cu的胁迫作用，提高紫云英的生长能力．
(3)测定了根际土壤中水溶态、可交换态、铁锰
氧化物结合态的铜浓度，结果表明 CL01 菌株通过形
成较高含量的铁锰氧化物结合态铜，有效降低了土壤
中水溶态和可交换态铜含量，减少了植物对铜的吸取
量，降低了铜对植物的毒害作用．
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