全 文 ：第 35 卷 第 2 期
2016 年 3 月
华 中 农 业 大 学 学 报
Journal of Huazhong Agricultural University
Vol． 35 No． 2
Mar． 2016，48 ～ 55
收稿日期:2015-03-08
基金项目:国家自然科学基金项目(31371549) ;国家“973”计划项目(2010CB126502) ;教育部博士点基金项目(20110146110012)
张晓媛，硕士研究生． 研究方向:根瘤菌共生固氮体系分子机制． E-mail:xiaoyuan0321smile@ 163． com
通信作者:李友国，博士，教授． 研究方向:生物固氮、农业环境微生物． E-mail:youguoli@ mail． hzau． edu． cn
紫云英根瘤中特异表达CCPs基因的
同源分析及表达定位
张晓媛 王建云 魏 丰 李振鹏 谢福莉 李友国
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070
摘要 将紫云英根瘤中特异表达的编码 CCPs (cysteine cluster protein)同源多肽的蛋白 AsF259 在大肠杆菌
表达菌株(DH10B)中进行体外诱导表达，分别检测其在洋葱表皮细胞与紫云英根瘤中的细胞定位，并利用免疫
荧光技术，检测紫云英中 AsF259 基因的时空表达特征。结果表明:AsF259 蛋白分布于洋葱表皮的细胞壁、细胞
膜、细胞质;基因表达和融合蛋白定位实验显示，AsF259 在根瘤中呈特异性表达，在类菌体分化前期大量表达，且
AsF259蛋白与类菌体共定位，表明 AsF259 基因属于 NCＲ家族，在类菌体分化、维持和共生固氮过程发挥重要作
用。
关键词 紫云英;根瘤菌;共生固氮;CCPs;AsF259;类菌体;NCＲ家族
中图分类号 S 154． 38 + 1 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2016)02-0048-08
早期研究表明，根瘤菌-豆科植物共生体系中多
糖类信号分子(主要有 Nod 因子和表面多糖)和植
物激素占有主导地位［1］，近期研究发现转脂蛋白［2］
和其他相关基因［3］在共生固氮过程中发挥重要功
能。而植物多肽作为另外一类主要的信号分子对于
根瘤的形成［4］、侵染以及类菌体的分化具有重要作
用［5］。主要的植物多肽有 Enod40、CLE、GＲP 及
NCＲ［6］。NCＲ(nodule-specific cysteine-rich)是 IＲLC
类植物中一种特殊的多肽，在类菌体的分化过程中
发挥关键作用，如调控类菌体细胞体积的增大［7］、
细胞膜通透性增加等［8］。Van de Velde 等［5］揭示不
定型根瘤中一种特异的富含半胱氨酸抗菌肽类物
质，可定向地进入根瘤菌细胞膜和细胞质，从而影响
类菌体分化发育。
笔者所在课题组前期比较了紫云英接种根与不
接种根在转录水平上的差异，通过抑制差减杂交技
术，建立了紫云英共生结瘤过程中的差异表达基因
文库。前期分离获得了编码 CCPs 同源多肽的 11 个
基因，包括 AsA257、AsC2411、AsⅡA255、AsⅡC2512、
AsF259、AsG2411、AsG257、AsD255、AsⅠC258、AsA244 和
AsD2410。经过生物信息学分析发现，它们编码的多
肽序列均较短(58 ～ 126 氨基酸) ，N-端包含 1 个保
守的信号肽，C-端部分则具有 2 个保守的半胱氨酸
簇:Cys-X4-Asp-Cys 和 Cys-X4-5-Cys (图 1)。这些结
构特点都与 CCPs 家族中的特殊成员 NCＲ 高度一
致。其中基因 AsF259 在紫云英根瘤中特异性表达，
多肽结构与苜蓿 NCＲ 基因十分相似。为确定其是
否属于 NCＲ基因，本研究进行了 CCPs 基因的同源
分析及表达定位。
1 材料与方法
1． 1 材 料
试验用主要菌株:华癸中慢生根瘤菌 7653Ｒ
(Mesorhizobium huakui 7653Ｒ)、根 癌 农 杆 菌
EHA105、发根农杆菌 K599、大肠杆菌 DH10B、植物
双元表达载体 PBI121;ＲNA 抽提试剂 Gateway BP-
clonase、Trizol reagent;用到的限制性核酸内切酶、
反转录酶均为 Fermentas公司产品;荧光定量试剂盒
为 SYBＲ Green real-time PCＲ Master Mix;抗生素氨
苄青霉素、卡那霉素、氯霉素等来自 Duchefa 公司产
品。
主要仪器:PCＲ仪为 Bio-Ｒad生产，Step one Ｒe-
DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2016.02.008
第 2 期 张晓媛 等:紫云英根瘤中特异表达 CCPs基因的同源分析及表达定位
al-time PCＲ system 购自 ABI。
1． 2 紫云英根瘤组织材料的提取及 ＲNA的抽提
第 1 天挑选粒大饱满的紫云英种子，首先用
95%乙醇浸泡 5 min 后，5% NaClO 反复冲洗表面消
毒 10 min，最后用无菌水洗涤 10 次左右并于培养箱
中浸泡 4 ～ 6 h，待种子吸胀，将洗好的种子均匀平铺
于素琼脂平板，28 ℃培养箱中倒置催芽 2 d。胚根
长至 1 cm左右时，从素琼脂平板中移出种子，接种
于灭菌培养箱中进行培养，约 1 周后接种华癸中慢
生根瘤菌 M． huakui 7653Ｒ 。
根据试验需要收集不同时间段的根、茎、叶、瘤，
用 Trizol试剂提取总 ＲNA，并加用 DNaseI 处理后置
于 － 80 ℃冻存备用。
1． 3 AsF259 大肠杆菌表达载体的构建
以接种 M． huakui 7653Ｒ 的根瘤组织提取物总
ＲNA作为模板，进行反转录得到 cDNA。以引物5-CG-
GACCGGTATGGTTGTAATTATG-3 和 5-CGCGGATC-
CTATTTTCTGACTTAG-3 PCＲ扩增基因AsF259 编码区
序列后，回收 DNA扩增产物成功连入载体 pMD18-
T，用 BamHⅠ和AgeⅠ双酶切插入载体 pBＲed ，构建
重组表达载体。
1． 4 紫云英各组织提取和实时荧光定量 PCＲ 流程
分别收取紫云英接种根瘤菌 18、28、34 d 后去
瘤的根、茎、叶、瘤及 9、12、15、18、21、28、34 d 的根
瘤，提取 ＲNA，进行反转录得到 cDNA，进行荧光定
量 PCＲ，比较基因表达量。
用普通 PCＲ 方法来检测引物(扩增应得到单
一、明亮的条带) ;用 DEPC稀释以调整各样品浓度，
并用实时荧光定量 PCＲ 方法检测;按照 SYBＲ
Green Ｒealtime PCＲ Master Mix (TOYOBO)说明书
配制 Ｒeal-time PCＲ反应体系。反应条件:95 ℃ 30
s;95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 个循环。Ｒeal-
time PCＲ 上游引物:5-GCTATTTATTTCCCTACTTC-
3，下游引物:5-CTCCCTCTATGCACTTTAT-3。
1． 5 洋葱表皮细胞亚细胞定位
在超净台中，解剖刀用乙醇灼烧灭菌后，迅速切
取表面积 1． 0 cm2左右的洋葱块，进行如下处理:
1)灭菌处理。置于 75%乙醇中消毒 1 min，MS
培养基中冲洗 1 次，2% NaClO 消毒 2 min，之后 MS
冲洗 3 ～ 4 次。
2)脱水处理。灭好菌的洋葱组织块放入
4 mol /L NaCl高渗溶液中脱水处理 20 min 后，用无
菌水冲洗 1 次，迅速置于侵染菌液中。
3)制片观察。用电转化法将 DsＲed 融合表达
载体和空载体分别转入根癌农杆菌 EHA105，在含
有卡那霉素和链霉素双抗的 LB 平板上进行阳性筛
选。2 d后于超净台挑取含有目的基因的农杆菌单
菌落至 50 mL LB液体培养基中，28 ℃ 200 r /min摇
瓶过夜;待菌落长成后，高速离心收集菌液，弃去上
清液，用 20 mL 的 1 /2 MS 液体培养基重新悬浮菌
体，加入 20 μL 的 100 mmol /L As 后，28 ℃ 200 r /
min摇床继续培养 3 ～ 4 h;取出摇瓶，加入 2 μL 的
Silwet L-77 表面活性剂，于超净台倒入培养皿中，然
后将待处理洋葱块置于培养皿中侵染 90 min 后取
出，置于无菌纸上吸干表面菌液，分离出下表皮，平
铺于不含抗性的 MS 固体平板上 28 ℃培养箱中暗
培养 24 ～ 36 h;将共培养 36 h 的洋葱组织取出，无
菌水冲洗 2 ～ 3 次，制作切片于激光共聚焦显微镜下
观察。
1． 6 发根农杆菌介导的紫云英转化实验
构建 DsＲed融合表达载体，利用电转化法转入
发根农杆菌 K599，通过含有卡那霉素和链霉素的双
抗 LB 平板筛选，挑选阳性克隆。活化含有目的基
因的农杆菌菌株 K599，用 LB － + Str + Kan的液体培
养基培养，28 ℃ 200 r /min 摇床震荡培养 24 h，以
1%的接种量接种到 50 mL LB －中扩大培养约6 h，
使最终 D600达到 0． 8 ～ 1． 0。种子培养 1 周后剪去下
胚轴以下部分，获得外植体，在目的菌液中浸泡 10
min后捞出，吸去多余菌液，将外植体均匀铺于素琼
脂平板上，22 ℃培养箱共培养 3 d。共培养后，将外
植体在无菌水中冲洗 1 次，插入含羧苄青霉素的无
菌 MS固体平板上，22 ℃培养箱培养 3 周后可见明
显毛根。
挑选长势较好的阳性苗种于灭菌花盆中，花盆
外包一层保鲜膜。紫云英饥饿培养 3 ～ 5 d 后，活化
培养接种根瘤菌 M． huakui 7653Ｒ，以后每隔 1 d 浇
以无氮营养液。
2 结果与分析
2． 1 紫云英候选 NCＲ基因的比较分析
选择与调控苜蓿根瘤菌类菌体分化有关的宿主
植物 NCＲ已知基因 18 个［5］，与获得的 11 个紫云英
CCPs基因进行同源比较，进行基于编码多肽氨基酸
序列的多重比对(图 1) ，构建系统发育树(图 2)。结
果显示:调控类菌体分化的 NCＲ AMPs可划分为4个
亚组(Subset A-D) ，11 个 CCPs 分别定位于其中的
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华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
Subset B、C、D 中，并且分别包含 AsD2410、AsA244、
AsG2411 3个典型代表。表明分离获得的 11 个 CCPs
就是根瘤中特异表达的 NCＲ家族新成员。
图 1 紫云英根瘤中 11 个 CCPs与已知 NCＲ 氨基酸序列［5］相似性比对
Fig． 1 The homology comparison of 11 CCPs and known NCＲ genes basing on their amino acid sequences
2． 2 AsF259 基因时空表达特征
1)AsF259 基因在紫云英不同组织中表达特征。
由图 3 可见，AsF259 仅仅在不同时期的根瘤中特异
表达，接受根瘤菌的诱导。在不接种根瘤菌诱导的
宿主植物的根、茎、叶中均不表达。
2)AsF259 基因在根瘤发育过程中的表达特征。
进一步检测该基因在根瘤发育不同时期的动态表达
特性(图 4) ，结果显示，紫云英 AsF259 基因在 12 d
时表达量达到最高，而该时期正是类菌体分化关键
时期。12 d 后，NCＲ 基因呈现不同水平的持续表
达，表明其在类菌体维持和固氮过程也发挥重要作
用。
05
第 2 期 张晓媛 等:紫云英根瘤中特异表达 CCPs基因的同源分析及表达定位
图 2 NCＲ遗传系统发育树
Fig． 2 The phylogenetic tree of the NCＲ proteins
Ｒ:根 Ｒoot;S:茎 Stem;L:叶 Leaf;N:瘤 Nodule;－ Ｒ:未接菌根 Ｒoot without inoculation with bacteria;－ S:未接菌茎 Stem without inocu-
lation with bacteria;－ L:未接菌叶 Leaf without noculation with bacteria．
图 3 AsF259 基因在接种根瘤菌后 18、28、34 d紫云英不同组织中的表达特征
Fig． 3 Expression of AsF259 mＲNA of different tissues in Astragalus sinicus L．
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华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
图 4 AsF259 基因在紫云英根瘤发育过程中的表达特征
Fig． 4 Expression of AsF259 mＲNA of
the nodules in Astragalus sinicus L．
2． 3 AsF259 基因融合表达载体的构建
采用笔者所在实验室已构建好的带有红色荧光
蛋白的 pBＲed 质粒作为表达载体，用 AgeⅠ和
BamHⅠ双酶切，扩增带有酶切位点的目的基因
AsF259，将目的基因构建到 pBＲed 质粒载体上，转
入大肠杆菌 DH10B，涂布于卡那霉素抗性 LB 平板
上，筛选阳性克隆，抽提质粒，电转化根癌农杆菌
EHA105，涂布卡那霉素抗性和链霉抗性 LB －平板。
2． 4 AsF259 蛋白的洋葱表皮细胞亚细胞定位
试验中，正对照取位于细胞膜上的二磷酸核苷
A:pBＲed质粒，14 006 bp;B:AsF259 基因全长(195 bp) ;C:菌落 PCＲ 验证 A:pBＲed plasmid，14 006 bp;B:AsF259(195 bp) ;
C:Bacteria colony-PCＲ．
图 5 AsF259 基因融合表达载体的构建
Fig． 5 The construction of expression vector
磷酸酯酶 PPD蛋白，负对照取带有红色荧光蛋白的
PBI121 空载体。结果显示:AsF259 蛋白分布于洋葱
细胞的细胞壁、细胞膜与细胞质中(图 6)。
2． 5 AsF259 蛋白在紫云英根瘤中的定位
选用 AgeⅠ和 BamHⅠ双酶切载体并回收。将
目的基因 AsF259 构建到带有 DsＲed的载体 pBＲ257
上，通过酶切验证阳性转化子正确，将整合质粒电转
化到农杆菌 K599。
利用植物毛根转化的方法，发根农杆菌侵染紫
云英幼苗愈伤组织，MS 培养基上共培养 3 d 后，无
菌水冲洗紫云英幼苗，进行脱菌。待长出新的毛根
后，移栽沙钵。4 ～ 5 d 后接种带有绿色荧光蛋白的
根瘤菌，收集 30 d 的根瘤进行切片制作，激光共聚
焦显微镜下观察。结果显示:AsF259 蛋白与类菌体
共定位(图 7)。
3 讨 论
NCＲ 基因只存在于 IＲLC (inverted repeat-lac-
king clade)类豆科植物中，形成不定型根瘤［10］，如
苜蓿(Medicago)［8］、豌豆(Pisum)［11］、紫云英(As-
tragalus)［12］。在苜蓿中，NCＲ 基因分子质量小且通
常编码 2 个外显子，即编码一段保守的信号肽与一
段成熟多肽［13］。笔者所在实验室获得的编码 CCPs
同源多肽的 11 个基因编码的多肽序列均较短(58 ～
126 氨基酸) ，N-端包含 1 个保守的信号肽，C-端部
分则具有 2 个保守的半胱氨酸簇:Cys-X4-Asp-Cys
和 Cys-X4-5-Cys。这与苜蓿
［8］NCＲ基因的结构相似。
同时，本研究显示 AsF259 基因组织表达特征表现为
在根瘤中特异性表达，而在根、茎、叶中不表达或表
达量极低;通过构建系统发育树，11 个紫云英 NCＲ
基因分属于 3 个 NCＲ subset，其中 AsF259 等 9 个基
因归类于 subset D。
苜蓿 NCＲ基因在类菌体分化的前期和后期被
激活［11］，并且 NCＲ 多肽为后续的类菌体分化所必
需［14］。紫云英 AsF259 基因均在 12 d时表达量迅速
达到最高，而该时期正是类菌体分化关键时期，这
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第 2 期 张晓媛 等:紫云英根瘤中特异表达 CCPs基因的同源分析及表达定位
A:对照 pBＲed，分布于整个洋葱细胞内;B:对照 PPD，定位于洋葱细胞膜;C:AsF259 蛋白表达定位，质壁分离前;D:AsF259 蛋白表
达定位，质壁分离后，分布于洋葱细胞的细胞壁、细胞膜与细胞质中。A:Control，location of pBＲed in the whole cell;B:Control，location of
PPD in the cell membrance;C:Location of AsF259 (before plasmolysis)in the cell membrance and cell wall;D:Location of AsF259 (plasmo-
lysed)in the cytoplasm，cell membrance and cell wall．
图 6 AsF259 蛋白在洋葱表皮细胞内定位
Fig． 6 The localization of AsF259 in the onion
A:pBＲed蛋白分布于整个根瘤细胞内;B:AsF259 蛋白在根瘤细胞内与类菌体共定位。A:Location of pBＲed in whole nodule cell;B:
Co-localized of AsF259 with bacteroid．
图 7 AsF259 蛋白在根瘤细胞内定位
Fig． 7 The localization of AsF259 proteins in the nodules
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华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
个基因的高水平表达反映了 AsF259 在这一时期的
关键作用。12 d后，NCＲ基因呈现不同水平的持续
表达，暗示其在类菌体维持和固氮过程也发挥重要
作用。
苜蓿 NCＲ247 基因只在根瘤中表达［15］，并且
NCＲ247 与 GUS 报告基团的融合表达显示，NCＲ247
在根瘤切片中位于Ⅱ区以及Ⅱ-Ⅲ区的中间带，Ⅱ区
的共生体停止分裂，细胞开始延长，而在Ⅱ-Ⅲ的中
间带，共生体迅速生长［16］。AsF259 在根瘤中也表
现出与根瘤菌类菌体共定位的特征，与报道的 NCＲ
定位特征相同。
在豆科植物不定型根瘤中，类菌体具有细胞伸
长、基因组加倍、膜通透性改变、细菌失去分裂繁殖
能力等特点［17］。在百脉根(缺少 NCＲ 基因和终极
类菌体分化)中人为表达 NCＲ035 基因可以诱导其
形成终极分化的类菌体［18］。而且，FITC(fluorescein
isothiocyanate)标记的 NCＲ多肽累积于细菌分裂板，
这暗示 NCＲ 多肽可能与细菌分裂器发生相互作
用［19］。苜蓿根瘤菌培养物在体外经过 NCＲ 多肽处
理后，可诱导膜损伤和通透性［20］，也可诱导类似类
菌体分化的表型特性［21］。不定型根瘤类菌体分化
是一个复杂、有序的过程［22］。紫云英-华癸中慢生
根瘤菌互作形成不定型根瘤，预示着紫云英 NCＲ可
能也具有调控类菌体分化的功能。
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a nodule-specific CCPs gene identified in Astragalus sinicus L．
ZHANG Xiaoyuan WANG Jianyun WEI Feng LI Zhenpeng XIE Fuli LI Youguo
State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，
Wuhan 430070，China
Abstract The nodule-specific expressed protein AsF259 which are homologous to the CCPs was identified
in Astragalus sinicus，expressed in Escherichia coli (DH10B)to study the subcellular localization in onion epider-
mal cell and in Astragalus sinicus nodule． The real time qPCＲ was used to analyze the gene expression． Ｒesults
showed that AsF259 protein was distributed in the cell wall，cell membrane and cytoplasm，and highly nodule-
specific expressed in the nodules with the highest expression level during the crucial stage of bacteroids differenti-
ation． AsF259 protein was co-localized with the bacteroids，indicating that AsF259 gene belongs to a novel mem-
ber of NCＲ family and may play an important role in bacteroids differentiation，maintenance and nitrogen fixa-
tion．
Keywords Astragalus sinicus L．;rhizobium;symbiotic nitrogen fixation;CCPs;AsF259;bacteroid;NCＲ
family
(责任编辑:张志钰)
55