全 文 ：【收稿日期】2008-10-07
【基金项目】安徽省教育厅教研基金(2006jq1090);安徽省自然科学基
金(070413141)
【作者简介】张红艳(1974-),女 ,讲师 ,从事牙周病学 、牙体牙髓病因
学研究 , Email:toothyan@126.com
文章编号:1005-376X(2009)03-0251-03 【口腔微生态学】
天然植物黄蜀葵提取物对变形链球菌生长及黏附抑制作用的实验研究
张红艳 1 ,董六一 2 ,杨柳1 ,黄升海 3
(1.口腔医学院;2.药理学教研室;3.病原生物学教研室 ,安徽医科大学 安徽 合肥　230032)
　　【摘要】　目的　通过研究黄蜀葵花总黄酮对变形链球菌生长及黏附的影响 , 为临床龋病预防提供实验基础。
方法　采用二倍稀释法观察不同浓度的黄蜀葵花总黄酮对变形链球菌生长的影响 , 测定该药物的最小抑菌浓度
(MIC);以低于 MIC的 5个浓度梯度配置含药的 TPY液体培养基 , 接种变形链球菌 , 厌氧培养 24 h, 计算黄蜀葵花
总黄酮对变形链球菌的黏附抑制率。结果　一定浓度的黄蜀葵花总黄酮能够抑制变形链球菌的生长 , MIC为 2.5
g/L;变形链球菌的黏附率随培养基中黄蜀葵花总黄酮浓度的升高而下降 , 且抑菌作用呈现明显的浓度依赖性 。结
论　天然植物黄蜀葵提取物黄蜀葵花总黄酮对变形链球菌的生长和黏附都有一定的抑制作用。
【关键词】　天然药物;变形链球菌;细菌生长;细菌黏附
【中图分类号】R378.12　　　　【文献标识码】A
TheexperimentalstudyofTFAonthegrowthandadhesionofS.mutans
ZHANGHong-yan1 , DONGLiu-yi2 , YANGLiu1 , HUANGSheng-hai3
(1.StomatologyCollege;2.DepartmentofPhamacology;3.DepartmentofMicrobiologyParasitology, AnHuiMedicalUniver-
sity, Hefei230032, China)
【Abstract】　Objective　TostudytheefectofTotalFlavoneofAbelmoschusmanihot(L.)Medicus(TFA)onthe
growthandadhesionofS.mutans, thustoprovideexperimentalstudybasisforpreventionofcaries.Method　Theefectof
differentconcentrationTFAonthegrowthofS.mutanswereobserved.Minimalinhibitoryconcentration(MIC)wasdeter-
minedbydoubledilutionmethod.TheefectsofTFAonadherenceofS.mutanswereexaminedbyusingTPYmediawith
fivediferentconcentrationsoftheTFA(2.50, 1.25, 0.63, 0.32, 0.16 g/L)andanaerobiccultivatingrespectively.Thead-
herentratesweredeterminedbyreadingoftheopticaldensity.Result　AcertainconcentrationsofTFAcouldinhibitthe
growthofS.mutans.TheMICofTFAwas2.5g/L.TFAinhibitedthegrowthofthebacteriadose-dependentlyandthead-
herentrateswasdescendingwhentheconcentrationsofTFAwasadvancing.Conclusion　Abelmoschusmanihot(L.)Me-
dicusextractshavedeterminateinhibitedingefectonthegrowthandadhesionofS.mutans.
【Keywords】　Naturalyoccurringdrugs;Streptococcusmutans;Bacterialgrowth;Bacterialadhesion
　　龋病是严重危害人类口腔健康的一种疾病 ,变形
链球菌(Mutansstreptococci, MS)是口腔中重要的致
龋菌之一[ 1] ,对光滑表面具有较强的黏附能力 ,它通
过黏附到牙釉质表面的获得性膜而形成牙菌斑并持
续产酸 [ 2] ,在酸的积累作用下导致牙釉质表面局部
脱矿[ 3]形成龋坏 。因此 ,控制细菌在牙面的黏附可
以减少龋病的发生 、发展。黄蜀葵(abelmoschusman-
ihotLmedic)为锦葵科秋葵属植物 ,其主要药用部分
为黄蜀葵花 , 黄蜀葵花总黄酮(Totalflavoneofabel-
moschusmanihotLmedic, TFA)是从黄蜀葵的花中提
取的有效成分 ,性甘寒 ,具有清热解毒 ,润燥滑肠及调
节非特异性免疫之功效。体外实验表明黄蜀葵花总
黄酮有一定的抗菌作用 [ 4] ,但对变链菌生长产酸和
黏附作用有无影响尚不明确 。本研究测定了不同浓
度的黄蜀葵花总黄酮对变链菌的生长及黏附能力的
影响 ,为其应用于龋病防治提供实验数据。
1　材料与方法
1.1　材料　黄蜀葵花总黄酮:由安徽省医学研究所
植化室提供 ,批号:20010624;TPY液体培养基按标准
配方自行配制;变链菌国际标准株 ATCC25175由安
徽医科大学口腔医学院中心实验室提供。
1.2　菌液制备　将复苏 48 h的变链菌菌株接种于
TPY液体培养基中 , 80% N2、20% CO2 , 37 ℃厌氧培
养 24 h,经涂片检查后 ,调节菌液浓度为 0.5麦氏点 ,
即菌液浓度 1.5×108CFU/ml,备用。
1.3　抗菌药物配制　称取 1 g黄蜀葵花总黄酮加入
无菌生理盐水 5 ml,充分混匀 ,调节溶液 pH7.0,
100 ℃灭菌 10 min。无菌试验阴性后 4 ℃保存备用 。
1.4　黄蜀葵花总黄酮对变链菌最低抑菌浓度(MIC)
测定　(1)采用液体试管法测定最低抑菌浓度:将
TFA设 10个稀释度 ,每个稀释度设 3个复管 。同时
第 11孔管作细菌对照 ,第 12孔管作培养基对照 。先
用 TPY培养基把 TFA调至 40 g/L。然后用 TPY培
养液将 TFA等量(2倍)稀释为 20.00、10.00、5.00、
2.50、1.25…0.04g/L,分别置于试管中(1ml/管),
251中国微生态学杂志　2009年 3月第 21卷第 3期
DOI :10.13381/j.cnki.cjm.2009.03.011
每管加 0.05 ml菌液 , 充分摇匀后 80% N2、 20%
CO2 , 37 ℃下厌氧培养 24 h,观察结果 。(2)结果的
判定:凡药物浓度管外观清晰者为无菌生长 ,即待测
细菌的最低抑菌浓度 ,以 g/L表示。
1.5　黄蜀葵花总黄酮对变形链球菌的黏附抑制作用
采用 HAMADA等 [ 5]的研究方法测定 TFA对变
链菌的黏附抑制作用。为排除黄蜀葵花总黄酮对变
链菌抑制作用产生假阳性结果 ,根据抑菌试验的 MIC
测定结果 ,选取 MIC值以下黄蜀葵花总黄酮溶液作
为实验浓度 。实验分 2个组:黄蜀葵花总黄酮组和空
白对照组。实验组分为 5个浓度组 ,即在 TPY液体
培养基中添加黄蜀葵花总黄酮 ,使黄蜀葵花总黄酮终
浓度分别为 2.50、1.25、0.63、0.32和 0.16 g/L。空
白对照组为不含黄蜀葵花总黄酮的 TPY液体培养
基 。以上各组平行做 3管 ,每支试管按分组加入液体
培养基 3 ml以及来自同一试管培养 24 h的 MS菌
液 。所有试管 30°水平角厌氧环境培养 24 h。 24 h
后轻轻翻转试管 3次 ,将菌液倒入第 2支试管 ,从无
黏附的试管侧加入 3 ml磷酸盐缓冲液 (PBS, 0.01
mol/L),振荡 5s,将含松散黏附细菌的液体转移至第
3支试管中;在第 1支试管中加入 3 ml磷酸盐缓冲
液 ,将试管壁上紧密黏附的细菌全部刮下;第 2、3支
试管离心 ,弃上清 ,再加入 3 ml缓冲液 。每管充分混
悬均匀 ,以 PBS作为空白对照 ,在分光光度计(日本
uV-1601型)测 A值 ,每管测 3次 ,取均值 ,分别获得
值 I、Ⅱ 、Ⅲ 。
细菌的黏附率 =I/(I+Ⅱ +Ⅲ )×100%。 TFA对变形链
球菌的黏附抑制作用使用黏附抑制率表示。黏附抑制率 =
(空白对照组黏附率 -实验组黏附率)×100/空白对照组黏
附率。
1.6　统计处理　各浓度药物对细菌黏附抑制作用的
研究数据采用 SPSS10.0统计软件分析 ,选用单因素
方差分析比较各实验组与阳性对照组间差异有无显
著性。
2　结果
2.1　TFA的体外抑菌作用　由表 1可知 , TFA对 MS
最低抑菌浓度为 2.50g/L。
表 1　不同浓度 TFA对 MS生长的影响
TFA浓度(g/L) 观察结果
20.00　 -
10.00　 -
5.00 -
2.50 -
1.25 ±
0.63 +
0.32 +
0.16 +
0.08 +
0.04 +对照 +
2.2　不同浓度 TFA对 MS黏附的影响 　结果见
表 2。结果显示 ,空白对照组变形链球菌的黏附率为
44.97%,随着 TFA浓度的增加 , MS黏附率逐渐下
降 ,从 0.16g/L浓度时的 37.27%下降到 2.5 g/L浓
度时的 2.62%。黏附率的变化与 TFA的浓度之间呈
剂量依赖性相关;经统计分析 ,各浓度组与对照组相
比差异均有显著性 (P<0.05)。 TFA各浓度组间差
异也有显著性 (P<0.05)。而 TFA对变形链球菌的
黏附抑制率随浓度升高而增强(P<0.05)。
表 2　TFA对 MS黏附的影响
TFA浓度(g/L) 黏附率(%) 黏附抑制率(%)
2.50 2.62±0.93 94.14±2.26
1.25 9.83±2.85 78.07±6.19
0.63 19.90±4.47 55.90±7.93
0.32 32.15±1.70 28.38±3.09
0.16 37.27±2.21 16.95±4.63　 空白对照 44.97±3.57 0
3　讨论
变形链球菌是口腔中重要的致龋菌之一 ,对光滑
表面具有较强的黏附能力;而变形链球菌在牙面的黏
附定植并形成菌斑是其致龋的始动因子和先决条
件 [ 1 ～ 3] :因此 ,控制细菌在牙面的黏附可以减少菌斑
的形成并抑制龋病的发生发展 。由此 ,对变链菌的黏
附抑制作用为防龋药物研究的重要指标之一 ,开发具
有抑制致龋菌生长黏附作用的口腔护理产品逐渐引
起学者们的重视 。
多年来人们一直试图采用药物控制或预防龋病 。
早期采用的抗生素类如青霉素 、红霉素 、四环素或螺
旋霉素等 ,虽具有一定的防龋效果 ,但长期使用可引
起口腔和肠道菌群失调而导致其他疾病。氟化物防
龋是研究最多且广为认可的方法 ,但其应用有诸多局
限性 ,如氟浓度的稳定性保证 ,防止氟的毒副作用以
及口腔耐氟菌株选择性生长等方面的问题尚未解决 。
龋病在本质上是菌群生态失衡性疾病 ,其致病菌均为
口腔正常菌群 。因此 ,寻找一种使用安全 ,能有效调
理口腔菌群平衡的防龋药物成为研究的重点。
近年来许多学者致力于从天然植物中分离提取
天然抗菌斑和抗龋药物 ,并已初获成效 。如发现茶中
以鞣酸为主的酚类化合物可抑制变链菌的生长及葡
252 ChineseJournalofMicroecology, Mar.2009, Vol.21No.3
糖基转移酶 (GTF)活性 , 从而有利于龋病的防
治 [ 6, 7] 。有学者 [ 8] 发现蜂房提取物对口腔主要致龋
菌有抑制作用。 DUARTE等[ 9]也发现蜂胶提取物对
变链菌的生长黏附具有抑制作用 ,也能明显降低 GTF
的活性 。国内谢倩等 [ 10]研究发现中药五倍子提取物
对 6种主要致龋菌(变形链球菌 、血液链球菌 、唾液
链球菌 、内氏放线菌 、粘性放线菌和乳酸杆菌)都有
一定的抑制作用 ,五倍子对变形链球菌的抑制作用可
能通过抑制细菌代谢所需的酶类而产生 。黄正蔚
等 [ 11]研究了传统中药血藤 (Caulisargentodoxae)、三
七(RadixNotoginseng)、黄芩(RadixScutelariae)和
五倍子(GalaChinensis)对变链菌在唾液获得性膜上
粘附的影响 ,发现上述中药能有效抑制变形链球菌对
唾液获得性膜的早期黏附 ,有预防龋病的作用 。
黄蜀葵花最早记载于 《嘉佑本草 》,在我国分布
广泛 、资源丰富 , 《本草纲目》记载:其花气味甘 、寒 、
滑 、无毒 ,治诸恶疮脓水久不瘥者 ,作末敷之即愈 ,为
疮家要药。消疽肿 ,浸油涂汤火伤等 。现代药理学研
究表明 ,黄蜀葵花的主要有效成分是黄酮类成分 ,目
前对化学成分的研究也集中于 TFA及其单体。自 20
世纪 80年代至今已有 7个黄酮类单体分离鉴定 。王
先荣等 [ 12]最早从黄蜀葵花中分得槲皮素 -3-洋槐
糖苷 、槲皮素 -3′-葡萄糖苷 、金丝桃苷 、槲皮素及杨
梅素等 5种黄酮类成分;有研究表明 ,黄蜀葵花的黄
酮类成分具有明显抗菌作用 [ 4] ,修复口腔黏膜溃疡 、
保护脑缺血 、心肌缺血 ,消除钠潴留 、改善肾功能等作
用 。本研究将不同浓度的 TFA与 MS共同培养 ,结果
表明一定浓度的 TFA能够抑制变形链球菌的生长和
黏附 ,最小抑菌浓度为 2.5 g/L,变形链球菌的黏附率
随培养基中黄蜀葵花总黄酮浓度的升高而下降 ,且抑
菌作用呈现明显的浓度依赖性;随着 TFA浓度的增
加 , MS黏附率逐渐下降 ,从 0.63 g/L浓度时的 37.
27%下降到 2.5g/L浓度时的 2.62%。黏附率的变
化与 TFA的浓度之间呈剂量依赖性相关;经统计分
析 ,各浓度组与对照组相比差异均有显著性(P<0.
05)。TFA各浓度组间差异也有显著性(P<0.05)。
天然植物资源丰富 ,使用上相对安全而有着良好
的应用前景 ,从天然植物中可以获得较为理想的防龋
制剂。但是由于天然植物具有较强的地域特性 ,成分
错综复杂 ,这在一定程度上影响了其有效成分的分离
纯化以及作用机制的深入研究。因此 ,如何利用现代
科学技术 ,分离纯化鉴定天然药用植物的有效成分 ,
深入认识天然植物的防龋机制是未来的主攻方向 ,有
待于众多学者努力和深入研究 。本研究表明天然植
物黄蜀葵提取物 TFA对变链菌的生长和黏附具有非
常显著的抑制作用 ,因此 TFA在龋病防治中具有一
定应用前景 ,但是否能应用于临床 ,尚需动物实验和
毒理学实验等大量研究奠定基础 。
【参考文献】
[ 1] KORITHOSKIB, KRASTEIK, CVITKOVITCHDG, eta1.Transport
andmetabolismofcitratebyStreptococcusmutans[ J] .Bacteriology,
2005, 187(13):4451-4456.
[ 2] KURAMITSUHK, WANGBing-yan.Virulencepropertiesofcariogenic
bacteria[ J].BMCOralHealth, 2006, 6(Suppl1):S11.
[ 3] vanRUYVENFO, LINGSTR? MP, vanHOUTET, etal.Relationship
amongmutansstreptococci, “low-pH” bacteria, andlodophilicpolysac-
charide-producingbacteriaindentalplaqueandearlyenamelcariesin
humans[ J] .JDentRes, 2000, 79(2):778-784.
[ 4]张红艳 ,董六一 , 江勤 ,等.黄蜀葵花总黄酮抗感染性口腔粘膜溃
疡及体外抗菌作用 [ J] .安徽医药 , 2006, 10(11):810-812.
[ 5] HAMADAS, TORIIM, KOTANIS, TSUCHITANIY.Adherenceof
Streptococcussanguisclinicalisolatestosmoothsurfacesandinterac-
tionsoftheisolateswithStreptococcusmutansglucosyltransferase[ J] .
InfectImmun, 1981, 32(1):364-372.
[ 6] NAKAHARAK, KAWABATAS, ONOH, etal.Inhibitoryefectofoo-
longteapolyphenolsonglycosyltransferasesofStreptococcimutans[ J] .
ApplEnvironMicrobiol, 1993, 59(4):968-973.
[ 7]肖悦 ,刘天佳 ,詹玲, 等.茶多酚影响致龋菌在唾液获得性膜粘附
的研究 [ J] .华西口腔医学杂志, 2000, 18(5):336-338.
[ 8]左渝陵 ,谢倩 ,李继遥 ,等.天然药物蜂房化学成分提取物对口腔
细菌生长的实验研究 [ J] .中国微生态学杂志 , 2005, 17(1):23-27.
[ 9] DUARTES, KOOH, BOWENWH, etal.Efectofanoveltypeof
propolisanditschemicalfractionsonglucosyltransferasesandon
growthandadherenceofmutansstreptococci[ J] .BiolPharmBull,
2003, 26(4):527-531.
[ 10]谢倩 ,李继遥 ,左渝陵 ,等.天然药物五倍子提取物对致龋菌生长
的影响 [ J] .华西口腔医学杂志, 2005, 23(1):82-84.
[ 11]黄正蔚 ,李继遥 ,周学东 ,等.传统中药影响黏性放线菌对唾液获
得性膜黏附的研究 [ J] .中国微生态学杂志 , 2003, 15(1):44-45.
[ 12]王先荣 ,周正华 ,杜安全 ,等.黄蜀葵花黄酮成分的研究 [ J].中国
天然药物 , 2004, 2(2):91-93.
253中国微生态学杂志　2009年 3月第 21卷第 3期