全 文 :榅桲实生苗抗寒性和AFLP遗传多样性分析
王 荣,张鲜鲜,张 贞,张鹏飞,毛志泉,沈 向
(山东农业大学园艺科学与工程学院,山东泰安 271018)
摘 要:为更好地了解查榅桲的生长发育规律和品种划分,搜集新疆喀什、新疆阿克苏、陕西西安、山东曲
阜、福建明溪、北京和智利9个不同种源的榅桲果实,取其种子进行层积、育苗,对所得实生苗的生长动
态、抗寒性和AFLP遗传多样性进行初步探讨,并得出以下主要结论:(1)榅桲实生苗生长可划分为4个
阶段——出苗期、生长初期、速生期和生长后期,其中处于速生阶段苗木的株高和地径生长量均达到全
年总量的70%。(2)不同产地榅桲枝条的细胞伤害度随着温度的降低而增加。但智利榅桲枝条的相对电
导度(4℃时高达63.31%)显著高于其他产地榅桲,抗寒性最差;新疆阿克苏2种类型的榅桲(苹果型和梗
瘤型)的相对电导度(-16℃时分别是 27.03%和 47.17%)低于其他地区的榅桲,抗寒性较好。(3)应用
AFLP技术筛选出的10对分辨率高的引物组合共扩增出310个总位点,其中多态性条带210个,多态位
点比率达69.41%,说明其分子遗传水平上的多态性丰富度不高。以相似系数值0.328作为划分标准,可
将9种榅桲资源划分为2类。(4)根据NTSYSpc2.10分析,9份榅桲种质之间相似性系数在0.10~0.50,以
相似系数值0.328作为划分标准,可将9种榅桲资源划分为2类。
关键词:榅桲;实生苗;生长动态;抗寒性;AFLP
中图分类号:S661.9 文献标志码:A 论文编号:2014-0599
Seedlings Cold Resistance and AFLP Genetic Analysis of Cydonia oblonga
Wang Rong, Zhang Xianxian, Zhang Zhen, Zhang Pengfei, Mao Zhiquan, Shen Xiang
(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an Shandong 271018)
Abstract: In order to better understand the growth and varieties division of the Quince (Cydonia oblonga Mill),
nine provenances of Cydonia oblonga from Akesu Xinjiang, Kashi Xinjiang, Xi’an Shannxi, Qufu Shandong,
Mingxi Fujian, Beijing and Chile were selected for this experiment, taking their seeds for seedlings and
research on different seedlings for growth dynamic, cold resistance and AFLP genetic diversity was carried out.
The main results were submitted as follows: (1) the proceeds of Cydonia oblonga seedling growth can be
divided into four stages: the seedling stage, the initial stage of growth, the fast- growing period and the late
stage; during the fast-growing period, the height and diameter growth and volume accounts for about 70% of
the annual total; (2) cell damage degree of different provenances of Cydonia oblonga seedling increased with
the decrease of temperature, the relative conductivity of Chile Cydonia oblonga (4℃, 63.31%) was higher than
that of the other samples significantly and its cold resistance was the worst, the relative conductivity of Akesu
Xinjiang Cydonia oblonga was lower than that of the other samples and its cold resistance was the best; (3)
based on AFLP markers, ten selective primers were screened and 210 polymorphic bands were observed from
total 310 bands. The polymorphic percentage (PPB) was 69.41% , the analysis indicated that there were no
基金项目:公益性行业(农业)科技项目“我国重要野生果树资源的收集、评价与优异种质创新利用技术研究与示范”(201303093);山东省良种产业化
项目“果树新资源引进开发”(2009-96)。
第一作者简介:王荣,女,1987年出生,河北邢台人,硕士在读,从事果树生物学研究。通信地址:271018山东省泰安市岱宗大街61号山东农业大学
园艺学院,Tel:0538-8249140,E-mail:wangrong201109@163.com。
通讯作者:沈向,男,1966年出生,山东曲阜人,教授,博士,研究方向为果树种质资源评价及生物技术育种。通信地址:271018山东省泰安市岱宗大
街61号山东农业大学园艺学院,Tel:0538-8249140,E-mail:shenx@sdau.edu.cn。
收稿日期:2014-03-10,修回日期:2014-06-24。
中国农学通报 2014,30(25):122-127
Chinese Agricultural Science Bulletin
large genetic variations in molecular levels; (4) according to the NTSYSpc2.10, the genetic similarity
coefficient of the nine quince germplasm was between 0.10 and 0.50, two groups of taxes were assigned based
on the results of cluster analysis with the genetic similarity coefficient at 0.328.
Key words: Cydonia oblonga; seedling; growth dynamic; cold resistance; AFLP
0 引言
榅桲(Cydonia oblonga)别名木梨,新疆维吾尔族
人称“比也”,蔷薇科榅桲属落叶灌木或小乔木,本属
仅此 1种,是古老稀少的果树之一。榅桲栽培历史达
4000年以上,最初生长于高加索及中亚西亚。榅桲在
中国大规模应用较少,仅新疆有小规模的种植[1]。榅
桲果实黄色芬香,含有丰富的营养成分、多种氨基酸
及其他微量元素[2-4],有重要的医药价值和经济价值,是
优良的果树[5];同时,它还具有优美的树姿、叶片、花卉
和果实,是较好的观赏果树。榅桲的适应性强,具有
较强的耐寒力、耐旱力以及耐盐碱能力,适于北方大
多数城市栽培[6-7],是一种适于北方推广的观赏果树。
近年来,榅桲在各地栽培的数量极少,在市场上
视为珍品。随着经济的发展,作为珍稀树种之一的榅
桲,越来越受到人们的高度重视。一直以来,对榅桲
的研究大都局限于作为梨矮化砧方向[8-10],对其自身的
研究鲜有报道。笔者探讨了种源榅桲实生苗的生长
动态规律和种质特异性,以此来了解榅桲的生长发育
规律、抗寒性及在传播过程中的变异,为更好地了解
榅桲的生长发育规律和品种划分提供基础资料,并为
榅桲在北方作为观赏果树的推广利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2008年 10—11月陆续收集新疆喀什、新疆阿克
苏、西安兴庆宫公园、山东曲阜、北京中科院植物园、
智利、福建明溪和西安植物园8个供试点9种榅桲(表
1),取其种子层积、播种育苗、移苗后研究实生苗的生
长规律、抗寒性和DNA图谱。
1.2 试验方法
将来自北京、新疆、山东曲阜、智利的榅桲果实取
种子,于2011年1月5日层积,经低温处理后,2011年3
月 18日播种,至榅桲幼苗长出 6~8片真叶后,于 2011
年5月12日移入大田;2011年3月将福建明溪、陕西西
安等地取得的嫁接苗植入大田。
1.2.1 榅桲实生苗生长动态研究 在榅桲实生苗生长过
程中,于5月23日、6月15日、7月23日、8月31日、9月
30日及 10月 19日分别测定其地径(距实生苗基部
10 cm处直径)、株高(实生苗顶部至地面的垂直高度)
及叶绿素含量。
1.2.2 榅桲枝条抗寒性研究 2012年1月28日,选取生
长一致的榅桲成熟枝条处于 4℃冰箱备用;3月 16日,
对其进行抗寒性研究。将材料分别放于常温(20℃)、
低温(4℃)和冷冻(-16℃)条件下处理,测其电导度 S。
计算其相对电导度和伤害度。
相对电导度=[(S1-S0)/(S2-S0)]×100%
伤害度=[(Lt-LCK)/(1-LCK)]×100%
其中:S0为对照的电导率,S1为样品的初始电导
率,S2为样品的终电导率;Lt为 t温度下处理枝条的相
对电导度,LCK常温下枝条的相对电导度[11-12]。Lt50(半致
死温度,℃,50%伤害度时的温度)可以有效地评价植
物的抗寒性[13]。
1.2.3 AFLP分子标记试验 取供试榅桲(表 1)实生苗
5~7片嫩叶,放入冰盒,带回实验室后,立即开始试
验。采用CTAB法提取榅桲幼叶DNA(北京博迈德生
物技术有限公司植物基因组DNA提取试剂盒)。将提
取的DNA进行质量检测(1.5 µL DNA进行NanoDrop
检测)。
对所选样品进行EcoRⅠ/MseⅠ双酶切,酶切与连
接反应同步进行,从 E39/M55、E40/M56、E41/M57、
E42/M58、E39/M75、E40/M76、E41/M77、E42/M78、
E39/M63、E40/M64、E41/M65、E42/M66、E47/M55、
E48/M56、E49/M57、E50/M58、E47/M75、E48/M76、
E49/M77、E50/M78、E47/M63、E48/M64、E48/M64、
E50/M66、E75/M63、E76/M63和E76/M65 27对引物中
筛选出带型清晰丰富且多态性带比较高的引物组合
(见表 2),进行 PCR选择性扩增,最后进行电泳和银
染色。
选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带,以“1”和
“0”分别记录条带的有无。在相同片段位置上有带记
为“1”,无带记为“0”。作0/1矩阵输入POPGENE 1.32
软件进行分析。计算个体间的Nei相似系数(包括遗
编号
1
2
3
4
品系产地
北京中科院植物园
山东曲阜
智利
福建明溪
编号
5
6
7
8
品系产地
陕西西安兴庆宫公园
陕西西安植物园
新疆喀什
新疆阿克苏(苹果型和梗瘤型)
表1 榲桲供试材料
王 荣等:榅桲实生苗抗寒性和AFLP遗传多样性分析 ··123
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传多样性指数H、Shannon信息指数 I等参数),并用
NTSYSpc 2.10软件对 29份种质采用非加权配对类平
均法(UPGMA)进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同产地榅桲1年生实生苗生长动态
不同产地榅桲 1年生苗木株高、地径年生长量均
表现出相似的递增趋势(图1)。5月23日—6月15日,
实生苗株高平均生长量为 13.19 cm,生长速度缓慢;7
月 25日、7月 23日和 8月 31日,测量实生苗株高平均
生长量为23.49、18.53和17.23 cm,其生长显著加快;9
月3日和10月19日,测量实生苗株高平均生长量分别
为6.88和5.49 cm,其生长量极显著减慢。实生苗地径
生长曲线与苗高生长曲线相似,5月23日—6月15日,
地径平均生长量为0.06 cm,生长速度缓慢;7月25日、
7月 23日和 8月 31日,实生苗地径平均生长量为
0.1894、0.1161和 0.1050 cm,生长速度显著加快。9月
3日和10月19日,测量实生苗株高平均生长量分别为
0.0872和0.0471 cm,生长速度明显减慢。曲阜榅桲实
生苗株高、地径的年生长量均小于其他产地的,智利、
北京实生苗的年生长量较大,但是各产地榅桲实生苗
的年生长量差异不显著。
试验结果表明,榅桲实生苗的生长可以划分为 4
表2 筛选出的接头序列和引物序列
接头与引物
EcoRI
MseI
E39:EcoRⅠ+ATG
E40:EcoRⅠ+AGC
E42:EcoRⅠ+AGT
E47:EcoRⅠ+CAA
E48:EcoRⅠ+CAC
E76:EcoRⅠ+GTC
序列(5-3)
GACTGCGTACCAATTC
GATGAGTCCTGAGTAA
GACTGCGTACCAATTCATG
GACTGCGTACCAATTCAGC
GACTGCGTACCAATTCAGT
GACTGCGTACCAATTCCAA
GACTGCGTACCAATTCCAC
GACTGCGTACCAATTCGTC
接头与引物
E75:EcoRⅠ+GTA
M55:MseⅠ+CGA
M56:MseⅠ+CGC
M58:MseⅠ+CGT
M63:MseⅠ+GAA
M65:MseⅠ+GAG
M75:MseⅠ+GTA
M76:MseⅠ+GTC
序列(5-3)
GACTGCGTACCAATTCGTA
GATGAGTCCTGAGTAACGA
GATGAGTCCTGAGTAACGC
GATGAGTCCTGAGTAACGT
GATGAGTCCTGAGTAAGAA
GATGAGTCCTGAGTAAGAG
GATGAGTCCTGAGTAAGTA
GATGAGTCCTGAGTAAGTC
0
20
40
60
80
100
120
5.23 6.15 7.7 7.23 8.31 9.3 10.19
测定时间(月.日)
株
高
/cm
阿克苏苹果型
阿克苏梗瘤型
北京
喀什
曲阜
智利
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
5.23 6.15 7.7 7.23 8.31 9.3 10.19
测定时间(月.日)
地
径
/cm
阿克苏苹果型
阿克苏梗瘤型
北京
喀什
曲阜
智利
图1 不同产地榲桲1年生实生苗生长动态
个阶段——出苗期、生长初期、速生期和生长后期。从
2011年 3月 18日榅桲播种至 5月 12日移栽为榅桲的
出苗期;5月12日—6月15日实生苗生长缓慢,为生长
初期;6月 15日—8月 31日实生苗生长迅速,地径、株
高生长迅速,为实生苗的生长旺盛期即速生期;8月31
日以后,榅桲实生苗进入缓慢生长期,地径、株高及叶
绿素相对含量的增长速率减缓,为生长后期。不同产
地榅桲1年生实生苗的年生长量无显著差异。
2.2 不同产地榅桲实生苗枝条在不同温度条件下电导
度变化
2.2.1 相对电导率 如图2所示,随着温度的逐渐降低,
不同产地榅桲枝条的相对电导率出现不同程度增加。
4℃时,智利、新疆喀什、北京、曲阜地区以及新疆阿克
苏苹果型、梗瘤型的相对电导度分别为 63.31%、
37.59%、24.35%、21.16%、13.76%和 11.50%;当温度降
至 -16℃时,各产地榅桲的相对电导度依次增大到
··124
85.68%、79.57%、48.88%、34.00%、27.03%和47.17%。
4℃时,智利榅桲枝条相对电导率极显著高于其他
产地榅桲枝条的相对电导率,新疆梗瘤型、新疆苹果
型、北京和曲阜榅桲枝条的相对电导率之间差异不显
著,但都极显著低于喀什和智利榅桲的;-16℃时,智利
榅桲枝条相对电导率显著高于除新疆喀什之外其他
产地榅桲枝条的相对电导率,其他各产地榅桲枝条的
相对电导率差异不显著。
2.2.2 伤害度和半致死温度 如图 3所示,随着温度的
逐渐降低,不同产地榅桲枝条的伤害度逐渐增加。在
4℃和-16℃时,智利榅桲枝条的伤害度(87.34%)均大于
其他产地榅桲的,并且在-16℃,其差异达到极显著水
平;-16℃时,新疆苹果型榅桲的伤害度(50.61%)最小,
极显著小于智利榅桲(87.34%),显著小于喀什榅桲
(83.92%),与其他产地榅桲枝条伤害度差异不显著。
Lt50(半致死温度,℃)可以有效地评价植物的抗寒
性。图3表明,新疆苹果型榅桲的半之死温度最低,其
次是北京榅桲、新疆梗瘤型榅桲、喀什榅桲、曲阜榅
桲,智利榅桲的最高。说明不同产地榅桲的抗寒性依
次是新疆苹果型榅桲、北京榅桲、新疆梗瘤型榅桲、喀
什榅桲、曲阜榅桲和智利榅桲。
2.3 不同产地榅桲DNA指纹测定分析
2.3.1 DNA的检测结果及出筛选的选择性引物组合
样品 DNA的纯度对于 AFLP分析至关重要,用于
AFLP分析的高质量DNA应无降解且没有RNA和其
他杂质的污染。笔者提取获得的DNA检测,条带整
齐,紫外分光光度计检测结果表明,大部分样品的
OD260/OD280在 1.7~1.9,DNA纯度较好,少有蛋白污染
或降解。
从合成的 27对EcoRⅠ/MseⅠ引物组合中筛选出
了10对条带丰富且多态性比较高的引物组合,可用于
提供样品种质资源遗传多样性研究。筛选出的引物组
合 为 :E42/M58、E39/M75、E76/M63、E40/M76、
E47/M55、E76/M65、E39/M55、E48/M56、E75/M63、
E40/M64。
2.3.2 不同产地榅桲的AFLP扩增结果 以所筛选出的
10对引物组合对榅桲种质基因组DNA进行扩增与分
析,结果如表 3所示。10对引物组合共扩增出总位点
310个,其中多态性条带210个,多态位点比率达69.41%,
不同引物组合扩增效率有所不同,其中 E75/M63
(GTA/GAA)最低,多态位点百分率为80.95%。
利用 POPGENE 1.32软件对各电泳条带进行分
析,计算个体间的Nei相似系数(H)及Shannon信息指
数(I)。结果表明,榅桲平均遗传多样性(H)为 0.1946,
种群 Shannon信息指数(I)均值为 0.3017;各位点遗传
多样性程度存在较大差别,Nei’s遗传多样性指数最大
值为 0.2858,最小值 0.1383;Shannon信息指数最大值
是0.4189,最小值是0.2326,说明本研究种质间存在一
定程度的遗传变异。
2.3.3 DNA指纹聚类分析结果 根据NTSYSpc 2.10分
析,9份榅桲种质之间相似性系数在 0.10~0.50,1号新
疆喀什和2号新疆阿克苏苹果型之间的相似系数值最
大,福建与其他榅桲种质相似系数最小。基于遗传相
似性系数,所得的聚类分析如图 3所示。以相似系数
值 0.328作为划分标准,可将 9种榅桲资源划分为 2
类。第 1类包含了榅桲的大部分资源,即新疆、西安、
北京、山东曲阜及智利等产地的榅桲;第2类包含1个
榅桲资源,即福建榅桲。
3 结论与讨论
3.1 榅桲实生苗生长动态和抗寒性
苗木生长的快慢不仅与树种的遗传特性有关,还
主要与气候条件和管理水平有关。掌握不同产地榅桲
010
2030
4050
6070
8090
20 4 -16
处理温度/℃
相
对
电
导
率
/%
曲阜 喀什
苹果型 梗瘤型
北京 智利
图2 不同产地榲桲枝条相对电导率比较
010
2030
4050
6070
8090
20 4 -6
处理温度/℃
伤
害
度
/%
智利 曲阜
喀什 苹果
梗瘤 北京
图3 不同产地榲桲枝条伤害度比较
王 荣等:榅桲实生苗抗寒性和AFLP遗传多样性分析 ··125
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
年生长规律,可为因地制宜、科学管理榅桲苗木生长提
供科学依据[14]。
郑益兴等[15-16]通过研究规律表明,1年生印楝实生
苗的年生长可划分为出苗期、生长初期、速生期和生长
后期 4个阶段,其中处于速生阶段苗木株高地径生长
量均超过千年总量的 70%。本研究表明,榅桲 1年生
实生苗在观测过程中呈现逐渐增长的趋势,其动态生
长过程也可以划分为4个时期——出苗期(播种—5月
上旬)、生长初期(5月上旬—6月上旬)、速生期(6月中
旬—8月下旬)和生长后期(9月上旬—停止生长),其
中速生期阶段的苗木生长量达全年生长量的70%。苗
木生产速率与同化物的积累有相关性,在速生期同化
物积累慢,光合产物主要为实生苗的生长提供物质基
础,缓慢生长期时,光合产物主要用于物质的积累。
植物在低温下受到伤害时最先被冲击的是膜系
统。膜因低温引起的不均匀收缩、膜脂相变、膜脂过氧
化、冰冻造成的机械胁迫等而受到伤害,半透性丧失,
细胞内电解质外渗;且膜损伤越严重,离子渗出率越
高。即植物受伤害程度越大,膜功能受损,其电导度随
之增加,因而电导度的增加值可以反映植物受伤害程
度,并且植物的半致死温度可以反映植物的抗寒性[17-18]。
植物的抗寒性虽是遗传性状,但其受环境的影响较大[19]。
长期生长在不同地区不同环境的榅桲由于生长环境的
差异,其抗寒性也会有所不同。笔者研究表明,新疆阿
克苏 2种类型榅桲的抗寒性较其他地区的榅桲要好,
而智力榅桲抗寒性较差。
3.2 榅桲AFLP遗传多样性探讨
遗传多样性可以使同一物种更好地适应环境、抵
御逆境,种内遗传变异程度决定着物种的进化趋势。
长期生长在某一环境下的植物在与环境的互作过程中
逐渐形成了对自身有利的特性,并将其以可遗传的性
质保留下来[20-21]。模式植物拟南芥在抵御病原体和各
引物
E42/M58
E39/M75
E76/M63
E40/M76
E47/M55
E76/M65
E39/M55
E48/M56
E75/M63
E40/M64
均值
总位点
16
35
68
19
24
51
30
22
21
22
31
多态位点
11
26
40
10
19
28
21
17
17
17
21
多态位点比率/%
68.75
74.29
58.82
52.63
79.17
54.90
70.00
77.27
80.95
77.27
69.41
观测等位基因(A)
1.6875
1.7429
1.5882
1.5263
1.7917
1.5490
1.7000
1.7727
1.8095
1.7727
1.6941
有效等位基因数(Ae)
1.2721
1.5050
1.2615
1.2781
1.3802
1.2748
1.2073
1.3621
1.3306
1.3621
1.3234
遗传多样性(H)
0.1703
0.2858
0.1596
0.1631
0.2284
0.1628
0.1383
0.2173
0.2030
0.2173
0.1946
Shannon信息指数(I)
0.2711
0.4189
0.2495
0.2471
0.3530
0.2493
0.2326
0.3367
0.3225
0.3367
0.3017
表3 不同产地榲桲的AFLP扩增结果
试验材料标号同表1
图4 榲桲种质资源AFLP分析遗传相似性聚类分析图
1
2
3
5
6
7
4
9
8
0.640.570.500.440.370.300.240.170.10
Coefficient
··126
种逆境(如干燥和潮湿、炎热和寒冷)时,遗传基因突变
使得拟南芥可以抵抗逆境,形成了不同的遗传类型,表
明外界环境对植物遗传多样性具有重要的作用[22-24]。
不同地区的榅桲在与环境长期互作或生存竞争的过程
中,逐渐形成适应各自生存环境的形态结构、生理生化
代谢等方面的特异性。本试验通过AFLP测序,将9份
榅桲种质资源划分为2个类群,第1类包含了榅桲的大
部分资源,即新疆、西安、北京、曲阜及智利等产地的榅
桲;第2类包含1个榅桲资源,即福建榅桲。野生榅桲
的品种划分有待进一步研究。
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王 荣等:榅桲实生苗抗寒性和AFLP遗传多样性分析 ··127