全 文 ：收稿日期:2000-10-18 ,修回日期:2001-04-30
基金项目:农业部重点项目“高新技术与基础研究”(4200-C98004);广东省重点科技攻关项目(99M01504G)
作者简介:贺国安(1974年-),男 ,湖南省临武籍 ,硕士 ,现为中山大学生物工程研究中心 2000级博士研究生
通讯作者:肖火根(1963-),男 ,江西省吉水籍 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事分子植物病毒和植物抗病毒基因工程研究。
Correspondence author.E-mail:huogen@ima.org.sg
番木瓜环斑病毒畸叶株系的 CP基因克隆和序列分析
贺国安 ,肖火根 ,张曙光 ,李华平 ,范怀忠
(华南农业大学植物病毒研究室 ,广东广州　510642)
Cloning and Sequencing of Coat Protein Geng of Malformed
Leaf Strain of Papaya Ringspot Virus
HE Guo-an ,XIAO Huo-gen ,ZHANG Shu-guang , LI Hua-ping ,FAN Huai-zhong
(Laboratory of Plant Virology , South China Agrricultural Univerrsity , GuangZhou 5100642 , China)
Abstract:The coat protein(CP)gene of an isolate of papaya malformed leaf virus(PMaLV), preserved in Plant
Virology Laboratory of South China Agricultural University by Luo Xuehai ,was synthesized by reverse transcrip-
tion and polymerase chain reaction(RT-PCR)and cloned into pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System(T-
vector).The full length of the CP gene was sequenced , and it shown that the CP gene was 861 nucleotides(nt)
in length ,with 3nt deletion beginning from 66nt as compared with that of Hawaii strain(HA)and Australian
strain W of papaya ringspot virus(PRSV).Compared with Ys(yellow ringspot strain)、Sm(severe mosaic
strain)、G(Hainan isolate)、HA and W strains of PRSV , the CP gene sequence of PMaLV shared 96%、98%、
95%、89% and 89% nucleotide sequence identity respectively.The coat protein encoded by CP gene of
PMaLV consisted of 287 amino acids residues , and shared 98%、97%、97%、96% and 95% amino acid iden-
tity with those of the five strains respectively.This results of sequence analysis shown conclusively that PMaLV
is a strain of PRSV ,not a new virus , and we termed it malformed leaf strain(ML)of Papaya ringspot virus.
Key words:Papaya malformed leaf virus;Papaya ringspot virus;Malformed leaf strain of papaya ringspot virus;
Coat protein gene
摘要:采用 RT-PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒(PMaLV)的外壳蛋白(CP)基因 ,将其 CP 基因克隆
进 Promega公司的 pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System(简称 T-载体), 并进行了序列分析。结果表明 , PMaLV
CP 基因核苷酸序列全长为861nt , 推导其编码287个氨基酸。与番木瓜环斑病毒(PRSV)美国夏威夷HA 株系和澳大
利亚W 株系的 CP基因相比 ,在第 66nt处开始连续缺失 3 个核苷酸。与 PRSV 的华南 Ys、Sm 和 G 株系以及夏威夷
的HA 和澳大利亚的W 株系相比 ,其 CP基因序列同源率分别为 96%、98%、95%、89%和 89%。其推导的氨基酸序
列同源率分别为98%、97%、97%、96%和 95%。此结果表明 , PMaLV属于 PRSV 的一个株系 , 不是一种新病毒。因
此 ,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系(ML株系)。
关键词:番木瓜畸叶病毒;番木瓜环斑病毒;番木瓜环斑病毒畸叶株系;CP基因
中图分类号:S 432.41;S 436.67　　　文献标识码:A　　文章编号:1003-5125(2001)04-0369-04
　第 16 卷4 期
2001年 12 月　　　　　　　　　　　　　　　
中　国　病　毒　学
VIROLOGICA SINICA
　　　　　　　　　　　　　　　16(4):369-372
December　2001
　　世界上已报道的危害番木瓜的病毒有番木瓜环
斑病毒(Papaya ringspot virus ,PRSV)等十余种病毒 。
在华南地区 ,骆学海等[ 1]认为 ,除 PRSV 外 ,还存在
一种新病毒 ,称为番木瓜畸叶病毒(Papaya malformed
leaf virus , PMaLV),他认为 PMaLV 在病毒颗粒长度 、
血清反应方面与 PRSV 不同 ,在番木瓜上引起的症
状特点为畸叶症 。但蔡建和等[ 2]却认为 ,华南地区
危害番木瓜的病毒只有 PRSV一种 , PRSV 的Vb(沿
叶脉变灰白色)株系在番木瓜上和西葫芦上的症状
与PMaLV的相同 ,两者间存在密切的血清学关系 ,
并且两者的病毒粒体大小 、寄主范围 、介体昆虫及病
毒内含体形态等方面也基本相同 ,因而认为 PMaLV
即为 PRSV的 Vb株系。
PRSV是马铃薯 Y病毒(Potato virus Y , PVY)属
的成员之一 ,PVY属病毒分类的重要依据之一是外
壳蛋白(Coat protein , CP)基因序列及其编码的氨基
酸序列的同源性 ,同种病毒不同株系的 CP 基因序
列和 CP 氨基酸序列的同源率一般都在 90%以
上[ 3] 。目前 ,国内外已报道了 16个 PRSV株系或分
离物的 CP 基因核苷酸序列 。其中 , 华南地区的
Ys[ 4] 、Sm[ 5]和G[ 6]的 CP 基因序列已报道 ,它们之间
的同源性都在 95%以上。因此 ,为了明确 PMaLV 是
一种新病毒 , 还是 PRSV 的一个株系 ,就需要知道
PMaLV的 CP 基因序列与PRSV各株系的同源率 。
1　材料与方法
1.1　材料
毒源为骆学海教授纯化保存于本研究室的
PMaLV(果园一号 , 1997年 12月 5 日存)。JM109 大
肠杆菌菌株由本研究室保存。植物总 RNA 采用
Wilkins et al方法[ 7]获得。
1.2　cDNA的合成
P1/P2引物根据本研究室叶长明博士[ 4]设计 ,
由上海生工生物工程有限公司合成。P1:5 -TTA
GTT GGG CAT ACC CAG G-3 ;P2:5 -ATG TCC AAG
GAA GCT GTG GAT-3 。RT-PCR反应参照 Langeveld
et al 方法[ 8] ,获得 cDNA 后 ,采用宝生物工程公司
(TaKaRa)的 PCR Fragment Recovery Kit ,按照其试剂
盒使用说明操作 ,进行 cDNA产物回收和纯化 。
1.3　cDNA的合成
P1/P2引物根据本研究室叶长明博士[ 4]设计 ,
由上海生物工程有限公司合成 ,P1:5′-TTA GTT GCG
CAT ACC CAG G-3′;P2:5′-ATG TCC AAG AAT GAA
GCT GTG GAT-3′。RT-PCR反应参照 Langeveld et al
方法[ 8] , 获得 cDNA 后 , 采用宝生物工程公司
(TaKaRa)的 PCR Fragment Recovery kit , 按照其试剂
盒使用说明操作 ,进行 cDNA产物回收和纯化。
1.4　cDNA的克隆和筛选
采用Promega 公司的 pGEM-T and pGEM-T Easy
Vector Systems(简称 T-载体),按其操作说明进行连
接反应 。然后参考 Sambrook 方法[ 9] 将连接产物转
化大肠杆菌 JM109菌株 ,挑选白色单菌落 ,采用菌落
直接PCR法快速筛选重组转化子 ,筛选的重组转化
子经扩大培养后 ,参照 Sambrook的碱裂解法[ 9]抽提
质粒DNA ,以 P1/P2引物进行 PCR鉴定和 EcoR I酶
切分析 。
1.5　cDNA的序列分析
经酶切可知 ,插入的目的片段大小约为 860bp ,
采用T7和SP6引物从双链两端进行正反测序 ,测定
3个阳性克隆 。序列测定由宝生物工程(大连)公司
(TaKaRa Biotech.)完成。测序仪为:ABI PRISMTM
377XL DNA Sequencer。所获得的序列资料通过下列
网址进行分析:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
2　结果
2.1　cDNA的克隆和酶切分析
由于 Taq DNA聚合酶往往在所有的双链 DNA
的 3 末端再加上一个非模板来源的核苷酸(通常为
A),使 PCR片段的平端克隆往往效率不高。因此采
用 Promega 公司的 T-载体 。T-载体多克隆位点的 5
末端被加上了一个 T 核苷酸 ,便于与 PCR片段 3 末
端的 A 互补 。多克隆位点两边各有一个 EcoR I酶
切位点 ,便于酶切分析 。5 个经 PCR鉴定含有插入
片段的重组质粒经 EcoR I酶切 ,其中有 4个能切出
一段 670bp大小和一段 180bp 大小的两条带 ,表明
插入的目的片段中 ,距离 5 端约 670nt处存在一个
EcoRⅠ酶切位点 ,这与其后的序列分析相符 。其中
一个不能被酶切 ,可能是一个假阳性菌落(图 1)。
2.2　cDNA的序列分析
序列分析表明 ,PMaLV CP 基因核苷酸序列全长
为 864bp(含加入的 ATG 起始密码子),在 678bp处
有一个 EcoR I酶切位点 ,与酶切鉴定结果一致。推
导编码的外壳蛋白有 287 个氨基酸残基(图 2)。
PMaLVCP基因的核苷酸序列与番木瓜环斑病毒
370 中　国　病　毒　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷
图 1　重组质粒酶切鉴定
M , 200bp梯度标准;1 ,阴性对照(T-载体);2-6 ,待鉴定的质粒DNA。
Fig.1　Identification of recombinant plasmid
M , 200bp ladder marker;1 ,T-vector;2-6 ,DNA of recombinant plasmid.
(PRSV)华南的 Ys 、Sm 、G 株系的同源率分别为
96%、98%、95%,与 PRSV夏威夷HA和澳大利亚W
株系株系的同源率都为 89%,其推导编码的氨基酸
序列与上述PRSV各株系的同源率分为 98%、97%、
97%、96%、95%(表 1)。
表 1　PMaLV 、Ys、Sm、G、HA 和W株系的 CP基因核苷酸序列及
其推导的氨基酸序列同源率比较(%)
Table 1　Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequence of
coat protein gene of PMaLV 、Ys、Sm、G、HA and W
PMaLV Ys Sm G HA W
PMaLV 96 98 95 89 89
Ys 98 95 95 90 89
Sm 97 97 94 89 89
G 97 97 95 91 90
HA 96 95 95 96 96
W 95 95 95 96 98
对角线上方的是核苷酸序列同源率比较 ,对角线下方的是推导的
氨基酸序列同源率比较。
Figures above the diagonal refer to comparisons of nucleotide sequence ,
figures blow the diagonal refer to comparisions of deduced amino acid se-
quence.
　　
3　讨论
关于华南地区番木瓜病毒的毒源种类 ,骆学海
等[ 1]认为 ,除 PRSV 外还可能存在一种番木瓜畸叶
病毒(Papaya malformed leaf virus , PMaLV), 蔡建和
等[ 2]却认为 ,华南地区危害番木瓜的病毒只有 PRSV
一种 ,并认为 PMaLV就是华南 PRSV的Vb株系 。另
外 ,肖火根等人[ 10] 的研究表明 , Vb 的潜育期与
PMaLV相同 ,PMaLV与华南 PRSV的 Ys株系和夏威
夷 PRSV的HA5-1株之间的血清学关系密切 ,至于在
番木瓜上的症状 , Ys和 PMaLV之间的差异也不显
著 ,在温度较低(10℃-20℃)时 , Ys也能引致叶片畸
形 ,因而他也认为 PMaLV是 PRSV的 Vb株系。
371第 4期　　　　　　　　　　　　贺国安等:番木瓜环斑病毒畸叶株系的 CP基因克隆和序列分析
为了从分子生物学上明确 PMaLV是一种新病
毒还是PRSV的一个株系 ,本研究克隆了 PMaLV 的
外壳蛋白(CP)基因并进行了序列分析 。CP 基因序
列分析表明 , PMaLV与 PRSV国内 Ys 、Sm和 G 株系
的同源率都达 95%以上 ,其中与 Sm 株系的同源率
最高 ,达 98%;与夏威夷 HA株系和澳大利亚W 株
系的同源率也近达 90%(表 1)。其推导的氨基酸序
列相互之间的同源率更高 ,都达 95%以上(表 1)。
由此表明 ,骆学海保存的 PMaLV 应属于 PRSV 的一
个株系 ,而不是一种新的病毒 ,这与前人[ 2 , 10]根据生
物学和血清学得出的观点一致 ,因此 ,我们建议把
PMaLV称为番木瓜环斑病毒畸叶株系(PRSV ML 株
系)。至于 PRSV ML株系是否为Vb株系 ,还需对蔡
建和等[ 2]保存的 Vb毒源进行 CP 基因序列分析后
才能作出最后的结论 。
参考文献
[ 1] 　骆学海 , 范怀忠.番木瓜畸叶病毒新发现的一种番木瓜病毒
[ J] .华南农业大学学报 , 1988, 9(3):79-80.
[ 2] 　蔡建和 ,范怀忠.华南番木瓜病毒及环斑病毒株系的调查鉴定
[ J] .华南农业大学学报 , 1994 , 15(4):13-17.
[ 3] 　Shukla DD ,Ward CW.Identification and classificat ion of potyvi ruses on
the basi s of CP sequence data and serology[ J] .Arch.Virol , 1989 , 108:
170-200.
[ 4] 　叶长明 ,叶寅 ,骆学海 ,等.番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的构
建[ J] .植物病理学报 , 1991 , 21(3):161-164.
[ 5] 　刘俊君 ,彭学贤 ,莽克强.番木瓜环斑病毒学分离物(Sm)外壳
蛋白基因克隆及序列分析[ J] .微生物学报 , 1991 , 18(6):350-
351.
[ 6] 　龚洁敏, 郑学勤 , 潘乃 , 等.番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的
cDNA克融合全序列测定比较[ J] .植物学报 1993, 35:416-421.
[ 7] 　Wilkins TA ,Smart LB.Isolation of RNA from plant ti ssue[ A] .Paul A
Krieg.A laborototy guide to RNA:Isolation , analysis , and synthesis
[ C] .New York:Wiley-Liss Inc., 1994 ,21-41.
[ 8] 　Langeveld SA , Dore Jm ,Memelink J , et al.Identifi cation of potyviruses
using the polymerase chain reaction with degenerate primers[ J] .J Gen
Virology , 1991 , 72:1531-41.
[ 9] 　Sambrook , J., Fritsch , EF , Maniatis , T.et al.Molecular Cloning:A
Laboratory Manual[ M] .2nd ed.USA:Cold Spring Harbor Laboratory
Press , 1989.
[ 10] 　肖火根 ,范怀忠.番木瓜斑病毒的生物学和血清学研究[ J] .华
南农业大学学报 ,1994 , 15(3):50-54.
372 中　国　病　毒　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷