全 文 ：植物病理学报
ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA　38(4):357-363(2008)
收稿日期: 2007-03-20;修回日期: 2008-03-07
基金项目:国家重大基础研究 “ 973”前期专项(2005CCA01700)
通讯作者:古勤生 ,副研究员 ,研究方向为植物病毒学;Tel:0371-65330997, E-mail:guqsh@ 126.com。
基于外壳蛋白基因序列对 3种葫芦科作物
病毒的分子分析
古勤生 1＊ , 田延平 1 , 彭 斌1 , 刘丽锋1 , 邓丛良 2 , 粱新苗 2 , 孟 娟 1
(1中国农业科学院郑州果树研究所 , 郑州 450009;2北京出入境检验检疫局 , 北京 100026)
摘要:从山西运城的南瓜(Cucurbitamoschata)、河南开封和孟津的西葫芦(Cucurbitapepo)上通过 ELISA分别检测到南瓜
花叶病毒(Squashmosaicvirus, SqMV)、西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus, WMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papa-
yaringspotvirus-Watermelontype, PRSV-W), 通过接种分离纯化获得其病毒毒原(CH99/211, CH99/113, CH99/69)。本研
究克隆了这 3个分离物的外壳蛋白基因 ,应用 DNAStar、ClustalX、Phylip等分析软件将这些序列同已报道的相应序列进行
分析并构建系统树。结果发现 SqMV可以分为两个组 , CH99/211分离物与美国的 Arizona分离物接近 , 应属于 Z组;
WMV分为两个组 , CH99/69同国内黑龙江分离物(WMV-HLJ)和云南分离物(WMV-CHN)最接近 ,成一小簇;PRSV分成
两个组 , CH99/113属于Ⅱ组 ,与国内 SP、MZ和 BN分离物接近。序列分析表明 PRSV和 WMV在进化上具有地理相关性。
SqMV和 PRSV-W外壳蛋白基因序列分析属国内首次报道。
关键词:番木瓜环斑病毒;西瓜花叶病毒;南瓜花叶病毒;外壳蛋白基因;分子分析
Molecularanalysisofthreecucurbitvirusesbasedoncoatproteingenesequences
GUQin-sheng1 , TIANYan-ping1 , PENGBin1 , LIULi-feng1 , DENGCong-liang2 , LIANGXin-miao2 ,
MENGJuan1　(1ZhengzhouFruitResearchInstitute, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Zhengzhou450009, China;
2PlantQuarantineLab, BeijingExit-EntryInspectionandQuarantine, Beijing100026, China)
Abstract:SqMV, WMVandPRSVwereisolatedfrominfectedpumpkin(Cucurbitamoschata)andsquash
(Cucurbitapepo)from ShanxiandHenanprovinceofChinarespectively.CoatproteingenesofWMV,
SqMV, PRSV-Wwerecloned, andanalyzedwithwhichreportedintheGenBankbyDNAStar, ClustalX,
Phylipetc.TheresultsshowedthatthereweretwoclustersforSqMVandWMVrespectively:CH99/211
closedtoSqMVUSAisolate(Arizona)whthinZgroup;CH99 /69closedtoWMV-HLJandWMV-CHNiso-
lates;CH99 /113 belongedtogroupⅡ ofPRSV.SequencesanalysissuggestedthatPRSVandWMVdiversi-
fiedbasedongeographicoriginalevolution.ThisisthefirstreportaboutSqMVandPRSV-W atmolecular
levelfromChina.
Keywords:Squashmosaicvirus;Watermelonmosaicvirus;Papayaringspotvirus;coatprotein;mole-
cularanalysis
中图分类号:S432.41　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2008)04-0357-07
　　葫芦科作物在我国广泛栽培 ,具有重要的经济
地位。随着全球变暖和保护地栽培面积扩大 ,露地
作物病害也逐年加重 ,病毒病已成为生产发展的限
制因素 。国际上已报道的侵染葫芦科作物的病毒
至少有 38个病毒确定种 、9个暂定种 、1个类病毒 ,
其中小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyelowmosaic
virus, ZYMV)、南瓜花叶病毒 (Squashmosaic
virus, SqMV)、黄瓜花叶病毒 (Cucumbermosaic
　
植物病理学报 38卷
virus, CMV)、西瓜花叶病毒 (Watermelonmosaic
virus, WMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya
ringspotvirus-Watermelontype, PRSV-W)等为常
发病毒 [ 1 ～ 5] 。
南瓜花叶病毒属于豇豆花叶病毒属(Comovi-
rus)。Nelson和 Kuhtsen将西半球的 SqMV分离
物分为 6个生物型 (2个血清型 )。 Provvidenti
等 [ 6]根据 SqMV在甜瓜和南瓜上症状严重程度分
为 SqMV-1(甜瓜株系 )和 SqMV-2(南瓜株系)。
Haudenshield等 [ 7] 通过 Northernblot和序列分析
将 SqMV分为 K和 Z组 。 2004年 Zhao[ 8]将新疆
感染甜瓜的南瓜分离物定义为 SqMV-XJ株系。
番木瓜环斑病毒属于马铃薯 Y病毒属(Poty-
virus),根据寄主范围可以分为番木瓜株系(P型)
和西瓜株系(W型)[ 9] 。 Cai等 [ 10]将其分为 4个不
同的株系(Ys、Vb、Sm和 Lc)。 He等 [ 11]利用 RT-
PCR-RFLP-SSCP技术将 Ys、Vb和 Sm3个株系一
次性区分开 。Jain等 [ 12]研究表明 PRSV可以分为
两个簇 ,但与地理起源并不相关 。
西瓜花叶病毒属于马铃薯 Y病毒科(Potyviri-
dae)马铃薯 Y病毒属 , 旧称西瓜花叶病毒 2号
(WMV-2),主要通过蚜虫以非持久方式传播。 2004
年 Yang等[ 13]指出株系可能与地域和生态条件有关。
目前植物病毒还没有有效的防治方法 ,了解病
毒株系分类情况可以更好的认识病毒 。株系分类
主要参考寄主范围 、血清学等方面的标准 ,但是这
些标准存在一定的局限性 ,尤其是难将相近的病毒
株系区分开来 ,随着病毒基因组数据的丰富 ,病毒
的基因组结构和序列已成为反映植物病毒种的进
化关系的重要标准[ 14] 。本研究分别从河南 、山西
两省葫芦科作物分离得到了 SqMV、PRSV和
WMV3种病毒 ,克隆了外壳蛋白基因 ,对这 3个分
离物同 GenBank中相关分离物进行了序列分析。
1　材料与方法
1.1　材料
1999年从山西运城的南瓜 (Cucurbitamos-
chata)、河南开封和孟津的西葫芦(Cucurbitape-
po)上通过 ELISA分别检测到 SqMV、PRSV-W和
WMV,进一步通过生物学测定纯化分别获得 3种
病毒毒原 , 3种毒原分别繁殖在寄主西葫芦上 。
总 RNA提取试剂 TRIzol购自 Invitrogen公
司 , TaqDNA聚合酶 、dNTP、DNAMarker、RNA酶
抑制剂购自大连宝生物公司 , 反转录酶 M-MLV
(Moloney murine leukemia virusreverse tran-
scriptase)购自 Promega公司 ,琼脂糖凝胶回收试剂
盒购自鼎国生物技术公司 , 大肠杆菌 (E.coli
DH5α)感受态细胞由本实验室制备。
1.2方法
1.2.1　植物总 RNA提取　参照 Invitrogen公司
TRIzolRNA提取试剂盒说明书 。从接种发病的西
葫芦中提取植物总 RNA。
1.2.2　RT-PCR　根据 GenBank中序列设计针对
SqMV、PRSV和 WMV的特异性引物(表 1),以植
物总 RNA为模板进行 RT-PCR。反转录程序参照
Promega公司 M-MLV说明书;PCR反应体系为 25
μL,其中超纯水 17.2μL, 10×PCRbuffer2.5μL,
2.5 mmol/LdNTP1.0 μL, 引物各 1.0 μL(10
μmol/L)反转录产物 2.0 μL, TaqDNA聚合酶
0.3 μL(5 U/μL)。PCR程序如下:94℃ 3 min,
94℃ 30s, 50℃ 30s, 72℃ 1 ～ 3min(根据目的片段
大小确定延伸时间), 扩增 30个循环 , 72℃延伸
10min。PCR产物经 1%低熔点琼脂糖凝胶电泳 ,
回收目的片段 ,回收程序参照北京鼎国公司胶回收
试剂盒说明书。
Table1　PrimersforCPgeneofSqMV, PRSVandWMVinthisresearch
Primer Sequence Tm(℃) Position(nt)
SqMV-F 5′-TGGATCCGCGTGGTTTGAT-3′ 53.1 640-651
SqMV-R 5′-TGTCGACAAACTGGGAAAGAAGC-3′ 49.9 3 287-3 301
PRSV-F 5′-GGATCCGCAATGATAGAGTC-3′ 50.4 8 950-8 963
PRSV-R 5′-TGTCGACAATAGAAGCGGTGGC-3 55.0 10 207-10 221
WMV-F 5′-TGGATCCTGGGATAGGAGCAAG-3′ 50.9 8 651-8 665
WMV-R 5′-TGTCGACATAACGACCCGAAATG-3′ 49.9 9 814-9 829
358
　
　4期 古勤生 ,等:基于外壳蛋白基因序列对 3种葫芦科作物病毒的分子分析
1.2.3　克隆及测序　利用 T4 DNA连接酶将目的
片段与 pUCm-T载体连接(参见 pUCm-T试剂盒
说明书),连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态 ,
进行蓝白斑筛选 。挑取白色菌落于含有合适抗生
素的 LB培养基 , 37℃培养过夜 。微量法提取质粒
DNA方法参考 Han等[ 15]并做适当改进 ,经 PCR
和酶切鉴定阳性克隆 。每个分离物挑选两个阳性
克隆 ,每个克隆分别从正向和反向测通 ,测序由大
连宝生物技术有限公司完成。
1.2.4　序列分析　利用 DNAStar6.0对 3种病毒
的核苷酸及氨基酸进行同源性分析 , 用 ClustalX
(Version1.83)对序列进行比对 , 输出结果通过
Phylip(Version3.65)软件包中的 Seqboot、Dna-
dist、Neighbor、Consense程序构建系统树 , 结果通
过 Treeview(Version1.6.6)查看 。
2　结果
2.1　RT-PCR和目的基因片段回收
利用合成的引物 ,以提取的植物总 RNA为模
板进行 RT-PCR, PCR产物在 1.0%低熔点琼脂糖
凝胶电泳 。结果表明 , 经扩增 , PRSV、WMV和
SqMV分别获得 1.2 kb、1.2 kb和 2.7 kb左右的
基因片段 ,与预期的结果一致。
2.2　序列测定及分析
对阳性重组质粒的插入片段进行序列测定 ,发
现每个分离物的两个克隆序列一致 ,不存在 PCR
扩增或测序错误。通过 BLAST比对分析证明得
到的为目的基因 。 3种病毒的核苷酸序列在
GenBank中的登录号分别为:DQ868881(SqMV)、
EF127832(WMV)和 DQ868880(PRSV)。
通过 DNAStar分析了 GenBank中所有 SqMV
分离物 、WMV分离物以及 PRSV中国分离物的核
苷酸及氨基酸同源性 ,并利用 ClustalX、Phylip分
别构建了系统树(图 1 ～图 3)。
2.2.1　SqMV序列分析结果　目前 GenBank中
SqMV的分离物不多 ,其中包含 RNA2部分序列的
分离物共 5个。以属内典型代表种豇豆花叶病毒
(Cowpeamosaicvirus, CPMV)作为外组 , GenBank
中所有的分离物中 RNA2的大外壳蛋白 (large
coatprotein)连同本研究中的分离物分别构建系统
树(图 1),可以分为 K和 Z两个组:K组内同源性
差异较大(核苷酸 93% ～ 99.5%,氨基酸 98.4% ～
99.5%);Z组内只含有两个分离物 ,核苷酸与氨基
酸同源性一致(98.7%);组间的同源性较低 ,核苷
酸同源性仅为 87.7% ～ 88.8%,氨基酸同源性为
96.3% ～ 97.1%。小外壳蛋白同大外壳蛋白构建
系统树结果一致(未列出)。
2.2.2　PRSV序列分析结果　分析发现 PRSV的
CP核苷酸序列变异性比较大(857 ～ 867 bp)。从
CP的氨基酸序列来看 , CP氨基端 KE基序重复数
存在很多差异 ,这也造成了核苷酸在长度上的差
Fig.1　PhylogenetictreeanalysisforCPgeneofdiferentSqMVisolatesCPMVasoutgroup
359
　
植物病理学报 38卷
Fig.2　PhylogenetictreeanalysisforPRSVCPgeneofalChineseisolatesWMVCP
inthisstudyasoutgroup
Theaccessionnumberinthisfigure:AB044341, AF243496, AF469065, AF469066, AY027810,
AY027811, AY027812, DQ340769, DQ340770, DQ340771, DQ419573, DQ449532,
DQ449533, DQ449534, DQ449535, DQ449536, X96538, X97251, DQ868880.
异 。以本研究中得到的 WMVCP的核苷酸序列作
为外组 ,将 GenBank中所有的中国分离物外壳蛋
白的核苷酸序列同本研究得到的分离物通过
ClustalX和 Phylip分析发现 ,总体上可以分为两
个组:Ⅰ和 Ⅱ(图 2)。华南地区的分离物 (SM、
Vb、Ys、SouthChina)及 ES、BC分离物构成 Ⅰ组;
台湾地区的分离物(YK、W/PT、W/TN、W/CI、P、
SMN、SM、DF)及 BN、MZ、SP、CH99/113构成 Ⅱ
组 , Ⅱ组又可以分为两个亚组。Ⅰ组分离物间同源
性差异比较大 (核苷酸 91.9% ～ 100%, 氨基酸
93.7% ～ 100%), Ⅱ组包括 12个分离物 ,分离物间
同源性差异性较 Ⅰ 组的小 (核苷酸 94.7% ～
99.1%,氨基酸 95.8 ～ 100%), Ⅰ组与 Ⅱ组间核苷
酸同源性为 90.1% ～ 95.6%, 氨基酸同源性为
92% ～ 98.6%。
2.2.3　WMV序列分析结果　分析发现本研究中
的分离物与日本 Habenaria分离物比其他的分离物
在 CP的 N端多出 2个氨基酸(KE)。以本研究中
得到的 PRSV-W分离物作为外组 ,利用 ClustalX
软件将所获得的 WMV序列同 GenBank中其他
WMVCP核苷酸序列进行比对 , 比对结果通过
Phylip软件构建系统树(图 3)。分析发现所有的
WMV分离物总体上可以分为两个大的组群:Ⅰ和
Ⅱ。 Ⅰ组内包含 8个分离物 ,组内核苷酸同源性为
97.4% ～ 99.9%(氨基酸同源性 97.9% ～ 100%),
Ⅱ组内包含 47个分离物 ,组内同源性差异较大
92% ～ 100%(氨基酸同源性 94.7% ～ 100%)。 Ⅰ
组与 Ⅱ组间同源性为 91% ～ 95.3%(氨基酸同源
性94.7% ～ 98.2%)。在 Ⅱ组中 3个中国分离物
(WMVCP、WHM-HLJ和 WMV-CHN)加上日本
的 Habenaria分离物聚集在一个簇。 Ⅰ 、Ⅱ组中大
部分来自同一地区的分离物聚集在一起 。
360
　
　4期 古勤生 ,等:基于外壳蛋白基因序列对 3种葫芦科作物病毒的分子分析
Fig.3　PhylogenetictreeanalysisofCPgenesforaltheWMVisolatesPRSV-W
W/CH99/113(PRSV-W)isolateasoutgroup
Theaccessionnumberinthisfigure:AB001994, AB127934, AF322376, AJ579481, DQ399708, AY464948, AJ579482,
AJ579483, AJ579484, AJ579485, AJ579486, AJ579487, AJ579503, AJ579504, AJ579505, AJ579506, AJ579507, AJ579509,
AJ579510, AJ579511, AJ579512, AJ579513, AJ579514, AJ579515, AJ579488, AJ579489, AJ579490, AJ579491, AJ579492,
AJ579493, AJ579494, AJ579495, AJ579496, AJ579497, AJ579498, AJ579499, AJ579500, AJ579501, AJ579502, AJ579516,
AJ579517, AJ579518, AJ579519, AJ579520, AJ579521, AJ579522, AJ579523, AJ579524, AY437609, AY995215, D00535,
D13913, L22907, EF127832.
361
　
植物病理学报 38卷
3　讨论与结论
传统上的病毒分类标准包括寄主范围 、症状
学 、血清学和传播介体专化性等 ,有时也考虑细胞
质内内含体的形态 。但是传统上的生物学分类标
准存在结果的不可靠性 ,费时费力 ,而血清学还存
在交叉反应 。在现今病毒分类上一般仅具有参考
价值。基因组结构和序列能真实反映植物病毒种
的进化关系 。随着数据库的丰富 ,基因组结构和序
列已成为病毒分类的重要标准 。
国内对南瓜花叶病毒研究较少 ,本研究在国内
首次报道了 SqMV的序列并对其外壳蛋白进行了
分析。根据 Haudenshield的研究 , 本研究中的
CH99/211分离物同 Z组的 Arizona分离物接近 ,
同源性为 98.7%。2002年 Han等 [ 16]报道 Y-SqMV
分离物为独立于 K和 Z的第三组 ,但通过聚类结
果看 , SqMV更倾向于分为 K和 Z两个组 , CH99 /
211属于 Z组 。
通过分析发现 PRSV-W的序列差异性非常
大 ,主要与 CP5′-端氨基酸 KE重复多少有关。 N
端其他的位置却相当的保守 ,尤其是 DAG基序及
附近序列 ,这也可能与此区域具有功能上或结构上
的特点有关 [ 17] 。本研究中采用的 BN、MZ和 SP3
个分离物地理起源不清楚 ,所以还不能认为 PRSV
的变异性与地理起源有关。地理起源已知的分离
物总是按相同地理来源聚集在一起。虽然 Jain
等 [ 12]指出 PRSV序列多样性与地理起源不相关。
但是其构建的系统树中 ,除个别分离物与地理起源
不一致外 ,其它的分离物与地理起源具有相关性。
出现这种情况 ,也存在人为或其他因素导致分离物
在不同地区扩散的可能。
国内西瓜花叶病毒分离物偏少 , 本研究对
GenBank中所有的 WMV分离物核苷酸进行了分
析 。通过分析西班牙分离物 ,发现组内相同地区的
分离物聚集在一起 ,说明 WMV的进化具有地理特
异性[ 18] 。虽然其它地区分离物不多 ,但相同地区
的分离物(中国 、巴基斯坦)总是聚集在一个分支。
地理上接近的中国 、日本 、巴基斯坦分离物在系统
发育树的遗传距离接近 ,进一步说明了 WMV的变
异具有一定的地理特异性 。
本文在国内首次将南瓜花叶病毒部分基因组
序列登录到 GenBank, SqMV分为 K和 Z两个组 ,
CH99 /211属于 Z组 , 目前基因组全序列和侵染性
克隆方面的研究正在进行 , 将更好地揭示基因的
功能和分子进化 。作者首次对国内所有 PRSV分
离物在中国的变异情况做了分析。 PRSV和 WMV
在进化上具有地理起源相关性 ,相同或相近地理起
源的分离物聚集一簇 。这些结果将为抗病品种的
选择和种植以及病害流行学提供科学参考。
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责任编辑:张国珍
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