全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（11）：2215–2222 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–16；修回日期：2011–10–25
基金项目：广东省植物保护新技术重点实验室开放基金项目（植重 2010-3）
* E-mail：zhaoqin0802@126.com；Tel：020-38469441
侵染节瓜的 3 种病毒多重 PCR 检测体系的建立
赵 芹 1,*，李华平 2，谢大森 1，罗少波 1，彭庆务 1
（1 广东省农业科学院蔬菜研究所,广州 510640；2 华南农业大学植物病毒研究室,广州 510642）
摘 要：根据侵染节瓜 3 种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄
瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物，在建立各种病毒单项 PCR 技术的基础上，
通过优化多重 PCR 反应条件，初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这 3 种病毒的多重 PCR 检测体系，
为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。
关键词：节瓜；小西葫芦黄花叶病毒；番木瓜环斑病毒；黄瓜花叶病毒；多重 PCR
中图分类号：S 642.9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）11-2215-08

Development of a Multiplex RT-PCR Protocol for the Detection of Three
Viruses on Benincasa hispida. var. chieh-qua
ZHAO Qin1,*，LI Hua-ping2，XIE Da-sen1，LUO Shao-bo1，and PENG Qing-wu1
（1Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2Laboratory
of Plant Virology，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）
Abstract：According to the conserved nucleotide sequences of coat protein genes of Zucchini yellow
mosaic virus（ZYMV），Papaya ring spot virus（PRSV）and Cucumber mosaic virus（CMV）infected
chieh-qua specific primers were designed. Based on the establishment of the optimal RT-PCR for the
single detection of ZYMV，PRSV and CMV，a multiplex RT-PCR protocol for the detection of three
viruses on chieh-qua was developed，which provided a simple，rapid and economic method for simultaneous
detection of three chieh-qua viruses to support the pathogen detection of chieh-qua technically and
theoretically.
Key words：chieh-qua；Benincasa hispida（Thunb.）Cogn. var. chieh-qua How.；Zucchini yellow
mosaic virus；Papaya ring spot virus；Cucumber mosaic virus；multiplex RT-PCR

节瓜又名毛瓜，为冬瓜的一个栽培变种，学名为 Benincasa hispida（Thunb.）Cogn. var. chieh-qua
How.，是我国华南地区的重要特色蔬菜，在我国南方诸省广泛种植，在广东种植面积达 3 万 hm2（He
et al.，2007）。目前在节瓜上广泛存在病毒病危害，造成褪绿斑驳、畸形疱斑等症状，以秋季种植受
害最为严重，导致大面积减产，部分田块甚至绝收。建立快速稳定的病毒检测技术，对保障节瓜生
产和控制病害很有必要。小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）（郑光宇 等，
1991）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）（古勤生 等，2002a）和黄瓜花叶病毒


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（Cucumber mosaic virus，CMV）（李向东 等，1995）是侵染葫芦科作物的常见病毒，并且在田间
经常发生复合感染（魏宁生 等，1991）。对节瓜病毒病害，卢彩鸽等（2004）鉴定了危害节瓜的小
西葫芦黄花叶病毒并克隆了其外壳蛋白基因，随后宋丽敏等（2005）制备了其外壳蛋白的抗血清，
而对不同节瓜产区、不同危害病毒的系统研究鲜见报道，因此现有研究基础不足以支撑节瓜病毒防
治技术理论的需求。
目前广泛使用的病毒病检测方法主要有生物学方法（彭斌 等，2004；尤毅 等，2009），电镜观
察法（Rubies et al.，1996；胡向武 等，1998），酶联免疫法（古勤生 等，2002b）、斑点杂交法（陈
洁云 等，2003a；孟娟 等，2007）、PCR 检测法（陈洁云 等，2003b）等。王威麟等（2010）建立
了侵染西瓜的 5 种病毒的多重 PCR 检测体系，赵丽等（2008）建立了检测侵染葫芦科作物的 ZYMV、
CMV 及 WMV 的三重 RT-PCR 技术。为了提高病毒检测速度，通过从田间采集样品，根据 ZYMV、
PRSV与CMV 3种病毒的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物进行扩增，并进一步优化反应条件，
建立了能同时检测这 3 种病毒的多重 PCR 法。该方法不但灵敏度高，稳定性强，而且简化了操作步
骤，降低了检测成本，缩短了检测时间，为实际生产提供了有力的技术保障。
1 材料与方法
1.1 材料
ZYMV、PRSV、CMV 等 3 种病毒侵染的节瓜病样，2010 年 9 月采自广州市白云基地，经 RT-PCR
鉴定后保存于–70 ℃冰箱中备用。
1.2 总 RNA 的提取及引物设计
取 3 种病毒侵染的节瓜病叶 0.1 g，利用 Tiangen RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒（天根
生化科技有限公司）提取总 RNA，将之溶解于 DEPC 处理的水中，1%琼脂糖凝胶电泳分析，并利
用纳米紫外分光光度计检测 RNA 的浓度及纯度，–70 ℃保存备用。
根据 GenBank 收录的 ZYMV、PRSV、CMV 病毒外壳蛋白基因序列（AY611024，AY458618，
AY611027），应用 Primier 5.0 引物设计软件分别设计其特异引物。引物设计完成后，通过 NCBI 鉴
定其特异性（表 1），引物由广州奥科生物技术公司合成。
表 1 ZYMV、CMV 和 PRSV 引物序列及扩增产物大小
Table 1 Primer sequences and amplified products size of ZYMV，CMV and PRSV

1.3 一步法单重 RT-PCR 体系的建立
按照下列组成配成 RT-PCR 反应体系：以单种病毒侵染的节瓜病叶总 RNA 2 μL 作为模板，
PrimeScript one-Step Enzyme Mix 0.4 μL，2 × one-Step Buffer 10 μL，病毒上、下游引物（10 μmol · L-1）
各 1 μL，加入 RNase Free ddH2O 补足至 20 μL。
病毒
Virus
引物序列（5′→3′）
Primer sequence
产物大小/bp
Products size
ZYMV ZP1 TCAGGCACTCAGCCAACTGTG 840
ZP2 TTACTGCATTGTATTCACACCTAGC
PRSV PP1 AGGGATAGAGACGTCAATGCCGGA 708
PP2 GCGCATACCCAGGAGAGAGTGCAT
CMV CP1 TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG 480
CP2 GCCGTAAGCTGGATGGACAA
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利用 TaKaRa 一步 RT-PCR 法试剂盒进行扩增，退火温度进行梯度设置，反应条件为 50 ℃ 30 min，
94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，退火温度梯度（48.1 ~ 58.6 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环，72 ℃ 10 min。
将所得产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像系统观察并记录图片。
1.4 一步法多重 RT-PCR 体系的建立
3 种病毒样品各 0.1 g 等质量混合，取抽提的总 RNA 3 μL 和 3 种病毒上、下游引物各 1 μL 加入
到同一 RT 反应管中，其它条件与单重 RT-PCR 反应体系相同。PCR 反应循环参数同上。取 5 μL PCR
产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。
退火温度及引物浓度的优化：在有效的多重 RT-PCR 条件下，考察多重 PCR 主要影响因素，考
察某一影响因素时，其它因素不变。退火温度设 48.1、49.4、51.0、52.6、54.1、55.7、57.3、58.6 ℃
等 8 种处理；设 ZYMV、PRSV 与 CMV 引物浓度分别 1︰1︰1，1︰1︰0，1︰0.5︰0.5 等 3 种比值，
进行多重 RT-PCR 体系的优化。
体系灵敏度检测：将 3 种病毒样品各 0.1 g 等质量混合，取抽提的总 RNA 2 μL，用 TE 缓冲液
稀释到原浓度的 10-1 倍，然后按照 10-1 倍进行系列稀释，取每个稀释后的样品 1 μL 作为反应模板，
按照前述反应体系进行灵敏度试验。
1.5 两步法多重 RT-PCR 体系的建立
3 种病毒样品各 0.1 g 等质量混合，取抽提的总 RNA 3 μL 进行 RT 反应，依次加入 3 种病毒下
游引物（10 μmol · L-1）各 1 μL，dNTPs（10 mmol · L-1）1 μL，RNase Inhibitor（20 U · μL-1）1 μL，
MMLV 反转录酶 1 μL，反转录 buffer 4 μL，DEPC 处理的 ddH2O 7 μL，总体系为 20 μL。反应条件
为 42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。
取 RT 反应液 2 μL 作为多重 PCR 的模板，加入 dNTPs（10 mmol · L-1）0.5 μL，rTaq（5 U）0.2
μL，PCR buffer 2.5 μL，总体系 25 μL，用一步法得出的最佳引物配比和退火温度进行 PCR 反应。
在每 10 μL 的 PCR 反应产物混入 1 μL 10 × PCR 上样缓冲液，加入到 1.0%的琼脂糖凝胶中，在 90 V
的电压下进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并记录图片。
1.6 PCR 产物的克隆和测序
取一步法多重 RT-PCR 扩增的 DNA 靶片段，用 H. Q. & Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，纯化的
PCR 产物与 pMD18-T vector 16 ℃过夜连接，采用 CaCl2 法制备大肠杆菌 JM109 感受态细胞，将连
接产物转化入大肠杆菌 JM109，用 Amp 抗生素和半乳糖苷酶的底物 X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克
隆经菌落 PCR 和限制性内切酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒送广州奥科生物技术有限公司测
序。
1.7 田间样品检测
从广州白云基地随机采集 6 份病毒侵染节瓜样品，提取总 RNA，进行一步法多重 RT-PCR 检测，
以验证其效果。
2 结果与分析
2.1 一步法单重 RT-PCR 反应体系的建立
将侵染 ZYMV、PRSV 和 CMV 3 种病毒的节瓜病样总 RNA 电泳分析，在凝胶中可见 28S、18S
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图 1 节瓜病毒样品总 RNA 电泳分析
M：DNA 分子标准 DL 5000；1：节瓜病毒样品总 RNA。
Fig. 1 Electrophoresis analysis of total RNA extracted from
chieh-qua viral samples
M：DNA marker DL 5000；1：Total RNA extracted from
chieh-qua viral samples.
及 5S 清晰条带（图 1），这说明提取的总 RNA
基本没有降解；利用紫外分光光度计测定其浓
度分别为 208、234 和 522 μg · mL-1，其 A260/230
值分别为 1.917、1.878 和 1.883，均在 1.8 ~ 2.0
之间，说明提取的 RNA 浓度较高，纯度较好，
基本不存在酚与蛋白的污染，可用于后续研究。
在 48.1 ~ 58.6 ℃系列退火温度下，ZYMV、
PRSV 和 CMV 的 PCR 扩增产物条带均明亮、
清晰，且只有一条带，扩增片段长度分别为
840、708 和 480 bp，符合设计预期大小（图 2）。
图 2 ZYMV（A）、PRSV（B）和 CMV（C）一步法单重 RT-PCR 在不同退火温度下的电泳结果
M：DNA 分子标准 DL 2000；1 ~ 8：退火温度分别为 48.1、49.4、51.0、52.6、54.1、55.7、57.3 和 58.6 ℃。
Fig. 2 Electrophoresis analysis of one-step multiplex RT-PCR of ZYMV（A），PRSV（B）and CMV（C）
under different annealing temperatures
M：DNA marker DL 2000；1–8：The PCR production under different annealing-temperature 48.1，
49.4，51.0，52.6，54.1，55.7，57.3 and 58.6 ℃.
2.2 一步法多重 RT-PCR 反应体系退火温度及引物浓度的优化
由图 3 可以看出，ZYMV 与 CMV 在 51.0 ~ 58.6 ℃间都有一条明亮的扩增条带，而 PRSV 在 51.0
~ 54.1 ℃间可见明亮的条带，在其它温度为弱带或没有扩增。综合 3 种病毒的扩增情况，认为 3 种
病毒在一步法 RT-PCR 反应的最佳退火温度为 52.6 ℃。由图 4 可以看出，ZYMV、PRSV 与 CMV
等 3 种引物浓度比值均可扩增得到对应条带，但当比值为 1︰1︰0.5 时，3 种病毒特异条带更明亮一
些。因此，一步法多重 PCR 反应的最佳引物浓度比值为 1︰1︰0.5。
2.3 一步法多重 RT-PCR 体系灵敏度检测分析
将提取的总 RNA 进行系列稀释后，采用一步法 RT-PCR 进行 3 种病毒灵敏度检测试验，结果
（图 5）表明，ZYMV 在样品浓度 10-5 倍稀释后仍能扩增出特异条带，10-6 倍稀释后条带非常微弱；
PRSV 与 CMV 在样品 10-2 倍稀释后仍能扩增出清晰的特异条带，10-3 倍稀释后扩增条带很微弱。这
些结果表明，不同病毒可能由于在植株中含量不同，而导致其检测灵敏度不同，其中对 ZYMV 的检
测灵敏度最高，其次为 PRSV 与 CMV。依据抽提 RNA 的样品质量，可以得出 ZYMV、PRSV 和 CMV
的检测灵敏度分别相当于 10-6、10-3 和 10-3 mg 组织量。
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图 3 一步法多重 RT-PCR 在不同退火温度下扩增产物的凝胶电泳
M：DNA 标准 DL 2000；1 ~ 8：退火温度分别为 48.1、49.4、51.0、52.6、54.1、55.7、57.3 和 58.6 ℃；9：阴性对照。
Fig. 3 Electrophoresis analysis of the one-step multiplex RT-PCR under different annealing temperatures
M：DNA marker DL 2000；1–8：The PCR production of different annealing-temperature 48.1，49.4，51.0，52.6，54.1，
55.7，57.3 and 58.6 ℃； 9：Negative control.


图 4 一步法多重 RT-PCR 在不同引物浓度比下扩增产物的凝胶电泳分析
M：DNA 分子标准 DL 2000；1 ~ 3：ZYMV、PRSV 与 CMV 引物浓度为 1︰1︰1；4 ~ 6：ZYMV、PRSV 与 CMV 引物浓度为 1︰1︰0.5；
7 ~ 9：ZYMV、PRSV 与 CMV 引物浓度为 1︰0.5︰0.5。
Fig. 4 Electrophoresis analysis of the one-step multiplex RT- PCR under different primers concentration ratio
M：DNA marker DL 2000；1–3：The concentration ratio of ZYMV，PRSV and CMV was 1︰1︰1；4–6：The concentration ratio of ZYMV，
PRSV and CMV was 1︰1︰0.5；7–9：The concentration ratio of ZYMV，PRSV and CMV was 1︰0.5︰0.5.

图 5 节瓜 3 种病毒一步法多重 RT-PCR 检测灵敏度分析
M：DNA 分子标准 DL 2000；1 ~ 7：未稀释，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6 稀释；8：阴性对照。
Fig. 5 The sensitivity analysis for detecting 3 viruses of Chieh-qua with one-step multiplex RT-PCR
M：DNA marker DL 2000；1–7：Undiluted，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5 and 10-6 dilution；8：Negative control.
2.4 两步法多重 RT-PCR 检测体系的建立
采用 MMLV 反转录酶，将病毒反转录和 PCR 扩增分开进行，其扩增产物分析结果见图 6。检
测单个病毒的两步法单重 PCR 方法（图 6，A）和同时检测 3 种病毒的两步法多重 PCR 方法（图 6，
B），均能够扩增出符合预期要求的各种病毒的单一条带。两种方法扩增的同一病毒条带分子量大小
一致，而且均没有产生非特异带。这表明所建立的两步法 RT-PCR 体系不仅可以用于节瓜单个病毒
的检测，而且可同时用于节瓜 3 种病毒的检测。
尽管一步法多重 RT-PCR 的实用性及有效性优于两步法多重 RT-PCR，但 TaKaRa 一步法
RT-PCR 试剂盒价格不菲，使用两步法多重 RT-PCR 可明显节约成本。
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图 6 两步法单重（A）及两步多重（B）RT-PCR 检测节瓜单个和多个病毒的凝胶电泳分析
M：DNA 分子标准 DL 2000；A：1. 小西葫芦黄花叶病毒，2. 番木瓜环斑病毒，3. 黄瓜花叶病毒；B：1 ~ 2. 3 种病毒。
Fig. 6 Electrophoresis analysis of the two-step single（A）and multiplex（B）RT-PCR for
detection of single and multiple viruses on chieh-qua
M：DNA marker DL 2000；A：1. ZYMV，2. PRSV，3. CMV；B：1–2. Three viruses.
2.5 PCR 产物序列分析
将 3 次重复扩增的一步法三重 RT-PCR 产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到 T
载体，将连接产物转化到大肠杆菌 JM109 感受态中，送交广州奥科生物技术有限公司进行序列测定。
测序结果表明，ZYMV、PRSV 和 CMV 的扩增产物序列分别由 840、708 和 480 个核苷酸组成，与
设计的 PCR 产物大小相同，分别为 ZYMV、PRSV 和 CMV CP 基因的部分序列（GenBank 登录号
分别为 JN559382、JN559383 和 JN559384）。序列同源性分析结果表明，所得序列与参考序列的同
源率分别达到 98%、98%和 95%（图略），证明了多重 RT-PCR 检测结果的可靠性。
2.6 田间样品的检测
利用优化后的一步法多重 RT-PCR 检测技术对 6 份已知带病毒的节瓜样品进行检测。结果显示，
节瓜发病样品中存在病毒复合侵染的情况，其中 6 份样品均存在 ZYMV 病毒的侵染，样品 1 和样品
3 仅有 ZYMV 侵染，样品 4 ~ 6 由 ZYMV 及 CMV 复合侵染，样品 2 由 ZYMV、PRSV 和 CMV 复
合侵染（图 7），这表明本研究建立的多重 RT-PCR 体系检测效果显著，对生产实践具有重要的意义。
图 7 节瓜田间发病样品的多重 RT-PCR 检测电泳结果
M：DNA 分子标准 DL 2000；1 ~ 6：节瓜田间发病样品检测结果。
Fig. 7 Multiplex RT-PCR detection result of chieh-qua viral samples from field of Guangzhou
M：DNA marker DL 2000；1–6：Detection results of chieh-qua viral samples from field.
3 讨论
瓜类病毒多重 RT-PCR 检测，至今报道的并不多。王威麟等（2010）建立了侵染西瓜的 5 种病
毒多重 RT-PCR 检测体系，赵丽等（2008）建立了侵染葫芦科作物的主要 3 种病毒的多重 RT-PCR
检测体系，但对节瓜病毒方面的研究尚未有报道。节瓜病毒病在华南地区发生严重，其中 ZYMV、
PRSV 及 CMV 是危害节瓜等葫芦科作物的重要病毒。作者通过进一步优化多重 RT-PCR 反应条件和
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反应体系，建立了同时检测节瓜 3 种病毒（ZYMV、PRSV 及 CMV）的一步法多重 RT-PCR 检测方
法，这样就将反转录和 PCR 扩增同时在一个试剂管中完成，这样不但简化了操作步骤，降低了检测
成本，缩短了检测时间，而且更重要的是能够减少和防止在整个检测操作过程中的污染。与本研究
建立的可明显节约试验成本的两步法 RT-PCR 相比，一步法多重 RT-PCR 体系更具实用性及有效性。
对大田样品的检测表明一步法多重 PCR 检测体系在节瓜田间病毒检测中具有较广阔的应用前景。
在多重 RT-PCR 反应中，引物的设计至关重要，它决定着多重 PCR 反应的成功与否（Bertolini
et al.，2001）。本研究中设计的引物是针对 3 种病毒各自相对保守的 CP 基因序列，CP 基因具有高
度保守性，因此能够用作 PCR 扩增的目的基因（Henegariu et al.，1997）。在设计引物时，将扩增
ZYMV、PRSV 及 CMV 这 3 对引物的 G + C 含量控制在 45% ~ 60%，这样能确保所有的引物在相近
的退火温度进行多重 RT-PCR 扩增，为成功进行多重 RT-PCR 反应奠定基础。另一方面，在考虑退
火温度时，将退火温度调整为 48.1 ~ 58.6 ℃，能让病毒各自的目的条带都得到充分地扩增。另外，
利用 DNAStar 对这 3 对引物进行了同源性、二级结构分析，以避免 3 对引物之间形成复杂的二级结
构及引物二聚体而影响扩增后结果判定（Menzel et al.，2002；Periasamy et al.，2006）。另外，检测
体系中要根据不同的模板和引物对其加以调整，以保证结果的特异性和可靠性（黄留玉，2005）。本
研究中在引物设计上利用扩增片段长度的不同（ZYMV 840 bp，PRSV 708 bp，CMV 480 bp），对引
物配比进行摸索，以判定扩增结果，使该多重 PCR 结果判定时更简便、直观和实用。
近年来，随着节瓜种植规模的不断扩大，小西葫芦黄花叶病毒、番木瓜环斑病毒和黄瓜花叶病
毒对节瓜种植业造成的危害日趋严重。本研究中建立的ZYMV、PRSV及CMV的多重RT-PCR检测方
法，可以快速准确、简便经济地检测出带毒情况，对控制田间病害的发生，减少经济损失，抗病筛
选和病害流行预测具有重要的意义；同时检测多种节瓜病毒病害在国内还鲜有报道，这项技术可应
用于田间节瓜病害复合侵染的同步检测。本研究中也再次证明多重RT-PCR检测方法是一种检测植物
病毒的有效手段。

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