全 文 ：研究报告
Research Report
紫云英丛枝菌根共生锌转运蛋白基因 AsZIP2的克隆与表达调控
韩亚超 1,2 谢贤安 2 范晓宁 2 普明宇 2 林会 2 赵斌 2 *
1阜阳职业技术学院生化工程学院,阜阳, 236031; 2华中农业大学生命科学技术学院,武汉, 430070
*通讯作者, binzhao@mail.hzau.edu.cn
摘 要 土壤中锌的缺乏已成为农业中普遍存在的问题，会导致粮食的减产减质。ZIP家族蛋白质对农作物
吸收 Zn与 Fe起着关键作用。本研究利用 RACE技术从豆科植物紫云英中分离到一个全长的 ZIP家族 Zn
转运基因，命名为 AsZIP2；利用热不对称交错 PCR与反向 PCR方法获取了 AsZIP2基因上游长度为 1.6 kb
的启动子序列。生物信息学分析表明 AsZIP2基因编码 339个氨基酸；预测的 AsZIP2蛋白质含有保守的 ZIP
结构域并由 9个跨膜结构域构成；序列比对与系统进化分析表明 AsZIP2与蒺藜苜蓿及日本百脉根的 Zn转
运蛋白 ZIP2的亲缘关系密切。利用 RT-PCR与定量 PCR方法检测紫云英 AsZIP2基因在丛枝菌根中的表
达，结果显示 AM真菌的侵染强烈地抑制 AsZIP2的表达。与已知的 MtZIP2基因一致，施加 Zn会诱导
AsZIP2的表达。有趣地是，在低磷条件下，AsZIP2在根中的表达显著地增强。研究结果表明，AM真菌，Zn或
Pi水平均影响 Zn转运基因 AsZIP2在根中的表达水平。对 AsZIP2基因在分子特征与表达谱方面的初步研
究将有利于进一步功能性鉴定该基因参与植物生长和发育。
关键词 锌, ZIP家族蛋白质,紫云英, AsZIP2,丛枝菌根
Cloning and Expression Regulation of a ZIP Family of Transporter Gene
AsZIP2 in Arbuscular Mycorrhizal Roots of Astragalus sinicus
Han Yachao 1,2 Xie Xianan 2 Fan Xiaoning2 Pu Mingyu 2 Lin Hui 2 Zhao Bin 2*
1 College of Biochemical Engineering, Fuyang Vocational and Technical College, Fuyang, 236031; 2 College of Life Sciences and Technology,
Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070
* Corrresponding author, binzhao@mail.hzau.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.035.000610
Abstract Zinc de覱ciency in soil which has led to the reduction of grain yield and quality has become a common
problem in agriculture. The ZRT-IRT-like protein (ZIP) plays a pivotal role in the acquisition of Zn and Fe in crop
plants. In this study, a full length cDNA of ZIP family of transporter encoding gene, designed as AsZIP2, was
isolated from legume Astragalus sinicus through RACE technique; and a 1.6 kb length of promoter sequence of
AsZIP2 gene was identified using TAIL-PCR and inverse PCR methods. In silico analysis showed that AsZIP2
encoded 339 aa protein; the deduced AsZIP2 protein which was composed of 9 transmembrane domains contains a
conserved ZIP domain. Sequence alignment and phylogenetic analysis indicated that AsZIP2 has close genetic
relationship with Medicago truncatula and Lotus japonicus Zn transporter ZIP2. The RT-PCR and quantitative PCR
methods were applied to detect the expression of Chinese milk vetch AsZIP2 gene in arbuscular mycorrhizal roots.
The result showed that the infection of AM fungi strongly repressed the expression of AsZIP2. In agreement with
the MtZIP2 gene identified, AsZIP2 was induced in roots by Zn fertilization. Interestingly, the AsZIP2 gene was
dramatically enhanced in roots under low Pi conditions. These results indicated that the expression levels of AsZIP2
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目“丛枝菌根真菌 Glomus mosseae Gm201基因在共生早期信号转导中的生物学功
能研究”(31270159)、教育部高等学校青年骨干教师国内访问学者项目(201312045)、安徽省教育厅振兴计划“地方高职院校构
建产学研平台的研究与实践”(2014ZDJY120)和安徽省教育厅自然科学项目“生态农业模式下淮北地区沼液中微生物多样性
分析及土壤修复性能的研究”(KJ2015A365)共同资助
基因组学与应用生物学，2016年，第 35卷，第 3期，第 610-621页
Genomics and Applied Biology, 2016, Vol.35, No.3, 610-621
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
gene in roots was influenced by the AM fungi, Zn or Pi status. The initial study of AsZIP2 gene in the aspects of
molecular characteristics and expression profiles will be useful for further functional identification of the gene
involving in the growth and development of A. sinicus.
Keywords Zinc, ZRT-IRT-like protein, Astragalus sinicus, AsZIP2, Arbuscular mycorrhizal roots
锌是植物生长发育必不可少的矿质元素，缺锌
会使农作物减产减质，而且粮食中锌含量过低最终
会导致人体内锌的缺乏(Ruel and Bouis, 1998)。另一
方面，由于采矿活动及其他人为干扰使得一些土壤
中的锌含量超标，对农作物与植物造成毒害作用，造
成粮食的减产，甚至危及到人体健康。尽管锌是植物
和人体内非常重要的微量元素，但是植物在分子水
平上如何吸收、转运、贮藏和利用金属元素知之甚
少。首次从拟南芥中分离并鉴定了锌转运基因，这些
基因被命名为 AtZIP1-4，它们与植物及酵母中的锌
和铁转运体 ZIP家族，IRT 家族的金属转运蛋白形
成一个亚家族(Grotz et al., 1998; Guerinot, 2000)。近
年来，不同植物中 ZIP类锌转运蛋白基因相继被阐
明(Scheers et al., 2013; Milner et al., 2013; Astudillo et
al., 2013)。已报道的植物锌转运基因不受外界锌水平
的影响或者受外界高锌浓度的下调或上调表达
(Tiong et al., 2014; Li et al., 2015)，植物中是否存在其
他类型的 ZIP类锌转运蛋白尚不清楚。
丛枝菌根(arbuscule mycorrhiza, AM)是土壤中
的丛枝菌根真菌与陆生维管束植物的根系形成的互
惠共生体。自然界中 80%以上的高等陆生植物能够
与土壤中的菌根真菌形成这种 AM 共生体(Smith
and Gianinazzi-Pearson, 1988)。AM的形成可以改良
土壤结构、增强植物抗逆性、增强植物对土壤的适应
性、改善宿主植物的矿质营养、特别是对磷素营养的
吸收的促进作用尤为明显(Leyval et al., 1997)。由于
大部分陆生植物都会形成 AM体系，特别是豆科和
禾本科粮食作物，因此对于菌根共生体系的研究就
更有经济价值。自 1981年 Bradley报道石楠菌根降
低植物对过量重金属铜和锌的吸收后，人们对菌根
参与重金属污染的生物修复的研究产生了浓厚的兴
趣，研究涉及重金属污染下的菌根生理、生态、应用
等多个方面(Janou觢ková et al., 2005;廖妤婕等, 2014)，
然而关于菌根对重金属污染土壤中植物生长与吸收
重金属的影响及其机制尚无定论。
AM真菌最显著的作用是促进磷的吸收，并且多
项研究结果表明菌根对磷的吸收、转运和锌的耐抗性
之间存在着一定的联系(Bradley et al., 1981; Vogel-
Miku觢 et al., 2006; Tamayo et al., 2014)，但这些研究更
多是基于生理层面，并未深入到分子水平探索，因而
AM菌根调节磷与锌变化的分子机制还不清楚。近期
研究表明在 AM真菌中发现了与铜、铁、锌吸收转运
相关的基因(Tamayo et al., 2014)，在植物中也发现了
受 AM菌根调节的锌转运蛋白基因(Burleighl et al.,
2003)，为进一步研究锌的吸收、转运和锌耐抗性的分
子机制提供了理论基础，因此，本研究通过克隆紫云
英锌转运蛋白基因 AsZIP2，并在不同条件下对该基
因的表达进行分析，探索了丛枝菌根、磷与锌对
AsZIP2表达的影响及这三个要素之间的互作关系，
为 AsZIP2基因的分子调控机制的研究奠定基础。更
重要地是，本研究为如何利用菌根真菌在农业生产
中消除锌等重金属的影响提供了理论依据。
1结果与分析
1.1 AsZIP2基因的结构与进化
基因编码区测序与生物信息学分析表明 AsZIP2
基因含有一个长度为 1 020 bp的开放阅读框(ORF)并
编码 339个氨基酸。通过NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)
进行同源搜索，查寻拟南芥，番茄，苜蓿和酿酒酵母
等锌转运蛋白相关基因及其氨基酸序列，并对紫云
英锌转运蛋白(AsZIP2)进行结构预测(图 1)。结果表
明 AsZIP2蛋白质含有 9个跨膜的结构域(图 1黑色
模块)和一个 N端信号肽(图 1左端第 1个灰色线段)。
通过 EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)
对 AsZIP2及其他同源蛋白进行多序列比对(图 2)，
在氨基酸序列水平上，蒺藜苜蓿的锌转运蛋白(MtZIP2)
图 1预测的 AsZIP2跨膜结构域
注: 9个黑色的模块表示 9个跨膜(TM)结构域;左边第一个灰
色段为 N端信号肽;第 4与第 5跨膜区之间的灰色段为位于
细胞质侧的可变区
Figure 1 The predicted transmembrane domains of AsZIP2
Note: The nine black modes indicated the nine transmembrane
(TM) domains; The first gray line at the left indicated the N ter-
minal signal peptide; The gray line between TM4 and TM5 indi-
cated cytoplasmic variable region
611
紫云英丛枝菌根共生锌转运蛋白基因 AsZIP2的克隆与表达调控
Cloning and Expression Regulation of a ZIP Family of AsZIP2 in Arbuscular Mycorrhizal Roots of Astragalus sinicus 612
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
与紫云英的锌转运蛋白(AsZIP2)相似性最高。通过
MEGA 4.1软件对不同物种的 10个不同的锌或金属
离子转运子的氨基酸序列进行系统进化分析，结果
显示 AsZIP2与MtZIP2具有很高的同源性(图 3)。这
些数据充分说明从紫云英中分离的 AsZIP2 基因编
码一个锌转运蛋白质，它属于 ZIP家族的一个成员。
1.2 AsZIP2启动子中顺式作用元件的分析
首先通过 TAIL-PCR的方法扩增 5端上游 DNA
序列，结果仅得到 200 bp长度的片段，不能包含一个
完整的启动子，进一步通过反向 PCR的方法再次进
行扩增得到 1.6 kb的片段，测序得到准确的核苷酸序
列。通过 PLACE数据库对克隆的 5序列的启动子进
行预测分析(Prestridge, 1991; Higo et al., 1999)，预
测的顺式元件及其可能的功能列于表 1中，发现该
启动子中还含有与锌和低磷诱导相关的顺式元件
WBBOXPCWRKY1和 P1BS，推测 AsZIP2的表达可
能会受到这 2个因子的调控，特别是 P1BS，它在菌根
诱导的磷缺乏胁迫下起到激活表达的作用，是一个位
于磷转运蛋白基因启动子上一个重要元件(Chen et al.,
2010)，值得深入研究其对锌转运蛋白基因 AsZIP2表
达中的作用。
1.3丛枝菌根真菌的侵染抑制 AsZIP2基因的表达
以组成型表达的 Actin基因为内参，通过控制
RNA浓度，进行 RT-PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳后
EB染色，RT-PCR结果初步说明了 AsZIP2基因在非
图 2预测的 AsZIP2氨基酸序列与其它 7种模式植物中 ZIP2蛋白质的多序列比对
注: AtZIP2:拟南芥锌转运蛋白 2; LeZIP2:番茄离子转运蛋白 2; StZIP2:马铃薯锌转运蛋白 2; AsZIP2:紫云英锌转运蛋白 2;
MtZIP2:苜蓿锌转运蛋白 2; LjZIP2:日本百脉根锌转运蛋白 2; GmZIP2:大豆锌转运蛋白 2; OsZIP2:水稻锌转运蛋白 2; AsZIP2
预测有 9个跨膜结构域(TM1~TM9),金属结合位点位于 TM1附近的红色和蓝色序列;“*”表示相同的氨基酸序列;“:”表示相似
的氨基酸序列;“-”表示用缺口使序列对齐
Figure 2 Predicted amino acid sequence of AsZIP2 and its alignment with ZIP2 proteins from other seven model plants
Note: AtZIP2: Arabidopsis thaliana zinc transport protein 2; LeZIP2: Lycopersicon esculentum zinc transport protein 2; StZIP2: Solanum
tuberosum zinc transport protein 2; AsZIP2: Astragalus sinicus zinc transport protein 2; MtZIP2: Medicago truncatula zinc transport
protein 2; LjZIP2: Lotus japonicus zinc transport protein 2; GmZIP2: Glycine max zinc transport protein 2; OsZIP2 Oryza sativa zinc
transport protein 2; The nine putative transmembrane domains (TM1~TM9) are underlined; A predicted metal binding site to AsZIP2
is nearby theTM1 ingreen andblue; *: identical amino acids; :: similar amino acids; –: gaps introduced to facilitate alignment
图 3 AsZIP2与 ZIP家族中 9种已知的金属转运子的蛋白质序
列的系统进化比较
注:这个系统进化树由MEGA4.1软件生成;天蓝遏蓝菜 TcZNT1
(AAF61374),拟南芥 AtZIP4 (AAB65480),拟南芥 AtZIP1 (AAC
24197.1),番茄 LeIRT1 (AAD30548.1)与 LeIRT2 (AAD30549.1),
拟南芥 AtZIP3 (AAC24199.1),酿酒酵母 ZRT2 (NP-013231),拟
南芥 AtZIP2 (AAC24198.1),苜蓿MtZIP2 (AAG09635.1)
Figure 3 Phylogenetic comparison of AsZIP2 with the predicted
protein sequences of nine characterized members of the ZIP family
of metal transporters
Note: This phylogeny was generated using MEGA4.1 software;
TcZNT1 (AAF61374),AtZIP4 (AAB65480),AtZIP1 (AAC24197.1),
LeIRT1 (AAD30548.1), LeIRT2 (AAD30549.1), AtZIP3 (AAC
24199.1), ZRT2 (NP-013231), AtZIP2 (AAC24198.1), MtZIP2
(AAG09635.1)
菌根与菌根中的转录水平的变化(图 4A)。从紫云英根
接种菌根真菌(+Myc)和不接种菌根真菌(-Myc)处理的
RT-PCR结果，可以明显地看出在接种菌根真菌后，
AsZIP2基因在转录水平上的表达明显地下降(图 4A)。
从紫云英根接种菌根真菌 (AM roots) 和不接种 AM
真菌(NM roots)两种处理的荧光定量 PCR结果，可见
613
表 1 AsZIP2启动子中的一些顺式元件及其可能功能
Table 1 Some predicted cis-elements and putative functions in promoter region of AsZIP2
顺式元件
cis-elements
AACACOREOSGLUB1
ABRELATERD1
ABRERATCAL
ACGTABOX
ANAERO1CONSENSUS
ARFAT
ARR1AT
BIHD1OS
BOXIINTPATPB
CACTFTPPCA1
CANBNNAPA
CBFHV
CCA1ATLHCB1
CGACGOSAMY3
CIACADIANLELHC
CURECORECR
DPBFCOREDCDC3
EECCRCAH1
GARE1OSREP1
GMHDLGMVSPB
GT1GMSCAM4
LTRECOREATCOR15
位置
Sites
1 029 (+)
570 (+)
569 (+)
1 599 (+)
451 (+)
288 (+)
830 (+)
1 471 (+)
362 (+)
33 (+)
1 533 (+)
1 187 (+)
203 (+)
231 (+)
687 (+)
507 (+)
12 (+)
1 410 (-)
811 (-)
1 491 (+)
1 593 (+)
230 (+)
核心序列
Core sequences
AACAAAC
ACGTG
MACGYGB
TACGTA
AAACAAA
TGTCTC
NGATT
TGTCA
ATAGAA
YACT
CNAACAC
RYCGAC
AAMAATCT
CGACG
CAANNNNATC
GTAC
ACACNNG
GANTTNC
TAACAGA
CATTAATTAG
GAAAAA
CCGAC
功能
Functions
与水稻中胚乳特异表达相关
Rice endosperm-specific expression regulatory elements
拟南芥中与缺水胁迫诱导相关
Response to dehydration in Arabidopsis thaliana
拟南芥中与钙离子浓度变化诱导相关
Response to dehydration calcium ion concentration in Arabidopsis thaliana
水稻中与糖的胁迫有关
Sugar-repressive element in rice
植物中与厌氧条件诱导相关
In the plant response to the anaerobic conditions
与植物激素诱导相关
Plant hormone-induced element
水稻中与细胞分裂素诱导相关
Cytokinin-responsive element in rice
水稻中与抗病有关
Disease resistance element in rice
与番茄中质体 atpB基因启动子活性相关
Important for the activity of the tomato plastid atpB gene promoter
存在于 PEP羧基酶基因的启动子
Exists in the promotor of PEP carboxylase gene
在与胚和胚乳时期特异表达相关
Embryo and endosperm-specific expression regulatory elements
大麦中与冷适应相关
Involved in cold adaptation in barley
拟南芥中与植物色素调节相关
Regulation of plant pigment in Arabidopsis thaliana
与水稻的淀粉酶表达相关
Associated with the expression of amylase in rice
与番茄日夜生长节律相关
Necessary for circadian expression in tomato
与铜诱导相关
Copper-responsive element
与脱落酸诱导相关
Element involved in abscisic acid responsiveness
与二氧化碳诱导相关
Carbon dioxide-responsive element
水稻中与赤霉素上调相关
Element involved in gibberellin responsiveness in rice
在大豆中与磷浓度相关
Response to the concentration of phosphorus in soybean
病菌和氯化钠诱导相关
Bacteria and sodium chloride induced element
与寒冷和干旱诱导相关
Element involved in cold and drought responsiveness
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Cloning and Expression Regulation of a ZIP Family of AsZIP2 in Arbuscular Mycorrhizal Roots of Astragalus sinicus 614
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
续表 1
Continuing table 1
顺式元件
cis-elements
MYCATERD1
NRRBNEXTA
OSE2ROOTNODULE
P1BS
PRECONSCRHSP70A
RHERPATEXPA7
ROOTMOTIFTAPOX1
SURECOREATSULTR11
TATAPVTRNALEU
WBBOXPCWRKY1
WBOXATNPR1
位置
Sites
541 (-)
464 (+)
313 (+)
799 (+)
230 (+)
864 (+)
562 (+)
289 (-)
1 132 (-)
1 413 (-)
338 (+)
核心序列
Core sequences
CATGTG
TAGTGGAT
CTCTT
GNATATNC
SCGAYNRNNNNNN
NNNNNNNNNHD
KCACG
ATATT
GAGAC
TTTATATA
TTTGACY
TTGAC
功能
Functions
拟南芥中与缺水干旱胁迫相关
Associated with water shortage drought stress in Arabidopsis thaliana
与植物损伤有关
Related to plant damage
与丛枝菌根真菌侵染相关
Response to arbuscular mycorrhizal fungi infection
与磷缺乏诱导相关
Response to phosphorus deficiency
可能具有增强子功能
Acts as an enhancer
与根毛细胞特异表达相关
Root hair-specific expression regulatory elements
与根部特异表达相关
Root-specific expression regulatory elements
拟南芥根中与硫缺乏相关
Response to sulfur deficiency in roots of Arabidopsis thaliana
玉米中与厌氧胁迫有关
Involved in anaerobic stress in maize
拟南芥中与锌离子激活相关
Zinc-dependent transcriptional activator in Arabidopsis thaliana
拟南芥中与病原诱导相关
A defense response element in Arabidopsis thaliana
AsZIP2在 NM根中的转录水平是AM 根中的 16 倍
(图 4B)，这与 RT-PCR结果一致，因此菌根真菌对紫
云英根系的侵染明显地抑制了 AsZIP2基因的表达。
1.4高浓度 Zn诱导 AsZIP2基因的表达
通过扩增组成型表达基因 Actin为内参，消除因不
同处理组中总的表达量不同而导致的 AsZIP2mRNA
的差异。图 5A为紫云英在低(0.3mg/kg)、中(1.2mg/kg)
和高(2.5 mg/kg)锌浓度处理下的 RT-PCR结果，可见
随着 Zn浓度的提高，AsZIP2的表达量也随之提高。
相对定量 PCR结果表明中(1.2 mg/kg)、高(2.5 mg/kg)
浓度锌处理下的根中 AsZIP2 的表达量分别是低
(0.3mg/kg)浓度锌处理的 1.75倍和 3倍(图 5B)，这与
RT-PCR的结果吻合，表明随着外界锌浓度的不断提
高，AsZIP2的表达量也不断增加。因此，AsZIP2基因
的表达与 Zn浓度呈现正相关。
1.5低浓度 Pi诱导 AsZIP2基因的表达
为了研究不同磷水平对 AsZIP2基因表达的影响，
将紫云英置于极低磷(0.065mmol/L)、低(0.2mmol/L)和
高(1.0mmol/L)磷浓度下生长。RT-PCR结果表明在极
低或低磷浓度下，AsZIP2基因受到诱导表达，而在高磷
浓度下，AsZIP2基因表达量很低(图 6A)，推测低磷浓度
更有利于 AsZIP2的表达，很有可能细胞内较低的磷浓
度是表达 AsZIP2的一个必要条件，过高的磷浓度会产
生抑制该基因表达的信号。从相对定量 PCR结果看，
发现低浓度磷(0.2 mmol/L)处理的根中 AsZIP2基因的
表达量最高，分别是极低浓度磷(0.065 mmol/L)和高
浓度磷(1.0 mmol/L)根中的 3.5倍和 8倍(图 6B)，这与
RT-PCR的结果基本一致，因此低浓度磷促进 AsZIP2
的表达，而高浓度磷会抑制该基因的表达。
综上所述，根据 RT-PCR与实时相对定量 PCR
的结果与分析，可以充分证实丛枝菌根真菌的侵染、
低浓度锌或者过高的磷处理均会抑制 AsZIP2 基因
的表达；相反地,高浓度锌或低浓度磷会诱导 AsZIP2
基因的表达。
2讨论
2.1 AsZIP2是 ZIP家族的一个成员
从紫云英中分离到的 AsZIP2蛋白质包含 9个跨
膜结构域，在第 4与第 5跨膜域之间存在可变区，氨
615
图 4 AsZIP2基因在正常 Zn条件下(1.2 mg/kg)的紫云英丛枝
菌根中的表达
注: A:凝胶电泳检测 RT-PCR扩增的 AsZIP2转录产物(上胶图
信号)与 AsActin转录产物(下胶图信号); B:经过与 AsActin基
因表达量均一化后, AsZIP2基因的相对表达量;采用 2-ΔΔCt法
分析定量 RT-PCR数据;误差线表示标准偏差(n为 3个生物重
复);星号表示与对照根样品平均值比较的显著差异: **p<0.01;
-Myc/NM根表示未接种根; +Myc/AM根表示被玻璃状巨大
球囊霉菌侵染的根
Figure 4 Expression of AsZIP2 in the roots of A. sinicus grown
under control Zn conditions (1.2 mg/kg) when colonized by AM
fungus
Note: A: RT-PCR-amplified AsZIP2 transcripts (upper signals) and
AsActin transcripts (lower signals) were gel electrophoresed. B:
The relative expression levels ofAsZIP2were normalised to that of
AsActin; Quantitative RT-PCR data were analyzed following the
2 -ΔΔCtmethod; Error bars indicate standard deviations (n=3); Ast-
erisks indicate significant differences from the NM roots mean:
**p< 0.01; -Myc/NM roots indicated the uncolonized roots; +Myc/
AMroots indicated the roots colonizedbyGigaspora margarita
图 5 AsZIP2基因在不同 Zn水平处理的紫云英根中的表达
注: A:凝胶电泳检测 RT-PCR扩增的 AsZIP2转录产物(上胶图
信号)与 AsActin 转录产物(下胶图信号); B: 经过与 AsActin
基因表达量均一化后, AsZIP2基因的相对表达量;采用 2-ΔΔCt
法分析定量RT-PCR数据;误差线表示标准偏差(n为 3个生物重
复);星号表示与 Zn0.3根样品平均值比较的显著差异: *p<0.05,
**p<0.01; Zn 0.3, Zn 1.2或 Zn 2.5分别表示施加 0.3 mg/kg Zn,
1.2 mg/kg Zn或 2.5 mg/kg Zn的植物根
Figure 5 Expression of AsZIP2 in A. sinicus roots fertilized with
various levels of Zn
Note: A: RT-PCR-amplified AsZIP2 transcripts (upper signals)
and AsActin products (lower signals) were gel electrophoresed;
B: The relative expression levels of AsZIP2 were normalised to
that of AsActin; Quantitative RT-PCR data were analysed follow-
ing the 2-ΔΔCt method; Error bars indicate standard deviations (n=
3); Asterisks indicate significant differences from the Zn 0.3
treatment mean: *p<0.05, **p<0.01; Zn 0.3, Zn 1.2 or Zn 2.5 ind-
icated the roots of plants fertilized with 0.3 mg/kg Zn, 1.2 mg/kg
Zn or 2.5 mg/kg Zn, respectively
基和羧基端都位于外膜，这些均是 ZIP家族的共有
保守特征，因此推测 AsZIP2也是其中一员(Guerinot,
2000; Pence et al., 2000)。根据系统发生树分析(图 3)，
发现 AsZIP2与苜蓿的MtZIP2以及拟南芥的 AtZIP2
有很高的同源性，但是与 AtZIP2不同的是，AsZIP2含
有与 AtZIP1及 AtZIP4类似的金属离子结合区域的
氨基酸序列(Eng et al., 1998)；并且 AsZIP2的金属离子
结合域中含有 HGGHGDSDH结构域(图 2)，这是一个
内肽酶的锌配体结构域(HXXXHXXXXXH) (Verkleij
et al., 1998)，而不是 ZIP家族其他成员(MtZIP2除外)
的 HXHXHXH结构域；而且这个金属离子结合域位于
氨基端，其它的 ZIP (MtZIP2除外)家族成员都是位于
第 3和第 4跨膜域的可变区。由于 AsZIP2和MtZIP2
两个基因非常相似，推测 AsZIP2与 MtZIP2具有类
似的功能，将细胞间隙的过量的 Zn转移到细胞内，
进而由未知的 Zn转运子将 Zn离子转入液泡储存。
根据基因的转录水平变化，发现 AsZIP2的表达量随
着 Zn浓度的提高而上升，可见 AsZIP2的主要功能
是转移植物体内过多的 Zn，防止 Zn的积累对自身
造成毒害。相反地，植物中其它的 Zn转运基因大多
是受高浓度 Zn的抑制(Pence et al., 2000; Yang et al.,
2009)。在高锌水平下这些基因受到下调表达,说明了
它们编码的锌转运蛋白有可能可以清除土壤中的锌
或者细胞间质的锌。锌转运蛋白很可能位于液泡膜
上，因为液泡对于植物而言是贮存重金属防止其毒
害细胞的最佳的结构(Küepper et al., 1999; Burleigh
et al., 2003)。但是AsZIP2蛋白的N端和 C端均位于生
物膜外，而 Zn是从生物膜外向内被转入的(Guerinot,
2000; Pence et al., 2000)。因此，如果 AsZIP2是位于
液泡膜上，那么很可能是将 Zn从液泡内转运出来到
紫云英丛枝菌根共生锌转运蛋白基因 AsZIP2的克隆与表达调控
Cloning and Expression Regulation of a ZIP Family of AsZIP2 in Arbuscular Mycorrhizal Roots of Astragalus sinicus 616
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
细胞质中，但是细胞质中过量的锌明显对细胞自身
有毒害作用。那么，更符合逻辑的推测应该是该蛋白
位于细胞膜上，将胞外 Zn转运到液泡内，据此，在与
AsZIP2同源性非常相近的 MtZIP2的研究中，已经
通过 MtZIP2-GFP 融合基因的表达证明了这一点，
MtZIP2定位于细胞膜上(Burleighl et al., 2003)。因此
AsZIP2可能也有类似的功能，将细胞间隙过量的 Zn
转运到液泡中，维持细胞质适宜的 Zn浓度。
2.2 AsZIP2和丛枝菌根共生体系
AM真菌是一种有益的根际微生物，能够通过为
宿主植物提供包括 Zn在内的矿质元素来促进植物
生长(Clark and Zeto, 2000)。因此对 AM共生体的研
究对理解植物如何调节 Zn的水平是非常有必要的。
根据本研究的结果可以明显看出菌根真菌的侵染有
效地抑制了 AsZIP2的表达，因此抑制该基因的表达
对于降低细胞质内过多的 Zn起到非常重要的作用，
菌根的形成能够降低重金属的毒害作用，那么在植
物自身的排 Zn基因，即 AsZIP2受到抑制的情况下
如何使自身避免高浓度锌的毒害。目前有一种观点
可以解释，当土壤中的重金属过高时，AM真菌使重
金属结合吸附固定在细胞壁上，减少重金属的吸收，
或者通过对根际的重金属的沉积和螯合作用，减少
对重金属的吸收(王红旗等, 2005)。这样菌根的作用
就使根系吸收的过量 Zn的浓度下降到植物生理所
需的适宜水平，从而不会对植物自身有毒害作用，然
而具体的分子细胞机制还不是很清楚。
2.3 菌根真菌、Zn 和磷对 AsZIP2 表达的影响及三者
之间的互作关系
以上结果和数据表明菌根真菌的侵染，低锌和高
磷的条件均会抑制 AsZIP2的表达，尤其以菌根真菌的
侵染对该基因的抑制作用最为显著。但是菌根的形成
会提高植物对重金属的抗性，那么在菌根形成的条件
下，可能足以使根际的过量 Zn浓度降低到安全值，使
植物吸收适量的 Zn供菌根植物生长，而且菌根的形成
降低了 Zn的浓度(Burleighl et al., 2003)，因此可能抑制
了 AsZIP2基因的转录，这可能是菌根在长期进化过程
中形成的一种机制，防止过量的 Zn离子抑制细胞内代
谢过程。菌根真菌的侵染可以帮助植物吸收土壤中的
磷元素，那么植物体内高浓度的磷含量可能就会抑制
AsZIP2的表达。这样可以解释菌根真菌的侵染可能会
降低 AsZIP2的表达，以上的定量 PCR的结果显示菌
根真菌的侵染对该基因的抑制作用比高水平 Zn或 Pi
单因素的作用更强，推测除了锌和磷调控该基因表达
的信号通路外至少还有一个更强的抑制信号通路，可
能是别的矿质元素作为信号分子引起，也可能是菌根
真菌分泌的信号物质引发的信号传导途径。
3材料与方法
3.1实验材料
3.1.1生物材料
本研究所用的紫云英(Astragalus sinicus)种子购
于湖北省种子公司；分子克隆所用的大肠杆菌 Esche-
richia coli DH5α 以及用于盆栽实验丛枝菌根真菌
Gigaspora margarita接种剂均由本实验室保藏。
3.1.2培养基
LB培养基：5.0 g酵母提取物；10.0 g胰蛋白胨；
10.0 g氯化钠；蒸馏水定容至 1 L，pH调至 7.0，121℃灭
图 6 AsZIP2基因在不同 Pi水平处理的紫云英根中的表达
注: A:凝胶电泳检测 RT-PCR扩增的 AsZIP2转录产物(上胶
图信号)与 AsActin 转录产物(下胶图信号); B: 经过与 As－
Actin基因表达量均一化后, AsZIP2基因的相对表达量;采用
2-ΔΔCt法分析定量 RT-PCR数据;误差线表示标准偏差(n为 3
个生物重复);星号表示与 P1.0根样品平均值比较的显著差异:
**p<0.01, ***p<0.001; P 0.065, P 0.2 或 P 1.0 分别表示施加
0.065 mmol/L Pi, 0.2 mmol/L Pi或 1.0 mmol/L Pi的植物根
Figure 6 Expression of AsZIP2 in A. sinicus roots fertilized with
various levels of Pi
Note: A: RT-PCR-amplified AsZIP2 transcripts (upper signals)
and AsActin products (lower signals) were gel electrophoresed; B:
The relative expression levels of AsZIP2 were normalised to that
of AsActin; Quantitative RT-PCR data were analysed following
the 2-ΔΔCt method; Error bars indicate standard deviations (n=3);
Asterisks indicate significant differences from the P 1.0 treatment
mean: **p<0.01; ***p<0.001; P 0.065, P 0.2 or P 1.0 indicated the
roots of plants fertilized with 0.065 mmol/L Pi, 0.2 mmol/L Pi
or 1.0mmol/LPi, respectively
617
菌 30min。水琼脂培养基：培养基按 0.5%~1% (w/v)的
量添加琼脂粉。
3.1.3主要生化试剂及仪器
本研究用的限制性内切酶、dNTPs、T4 DNA 连
接酶、DNA Marker、反转录反应体系等试剂均购于
TaKaRa 公司；Ex Taq DNA聚合酶购于全式金生物
公司；凝胶回收试剂盒购于东盛生物公司；荧光染料
试剂购自 TOYOBO公司；引物合成由上海生工生物
工程有限公司完成，DNA序列测序由华大基因公司
完成；电泳级琼脂糖购于 Spanish 公司；1.5×CTAB
分离缓冲液，乙醇、氯仿、异丙醇等生化试剂均为国药
集团药业股份有限公司的产品。TaKaRa PCR仪购自
日本，CX31RTSF型光学显微镜购自日本 OLYMPS，
HZQ-Q型恒温振荡培养箱购自哈尔滨东联电子技术
有限公司，DK-8D型电热恒温水浴锅购自上海一恒
科技有限公司，核酸分光光度计(Thermo NANO Drop
2 000 Spectrophotoer)用于 DNA与 RNA定量分析，
荧光定量 PCR仪(ABI7300)用于基因表达分析。
3.1.4 PCR引物
本研究所用的 PCR 引物以及其序列见本实验
所用的引物(表 2)。
3.2实验方法
3.2.1紫云英的盆栽实验
种子的表面灭菌与萌发：选取紫云英种子，置于三
角瓶中。在超净台中，取 75%乙醇注入装有紫云英种子
的三角瓶中，反复振荡 8min，弃 75%乙醇，用无菌水涮
洗 3次；加入 3%的 NaClO溶液吹打震荡 10 min，弃
NaClO溶液，用无菌水清洗 3次；将灭菌的紫云英种
子放入 26℃培养箱，待种子吸水膨胀后在水琼脂培养
基上铺种子使其萌发。幼苗的盆栽：将洗干净的细沙
进行 121℃高压灭菌 1 h，每天进行一次高压灭菌，连
续三次；盆钵表面用 75%酒精擦拭消毒，每个盆植入
等量且生长状态一致的幼苗；用保鲜膜覆盖后置于
22℃培养箱中炼苗(每天 16 h光照, 8 h黑暗)，2~3 d后
掀开保鲜膜。
紫云英处理：每个处理做 3个生物重复。用接种
菌根真菌和不接种的盆栽土种植紫云英，每天早晚各
浇蒸馏水 10 mL；在不加接种剂的盆栽土中培养，用配
置的梯度磷酸二氢钾溶液(浓度分别为 0.065 mmol/L,
0.2 mmol/L, 1.0 mmol/L)，每天早晚各浇 10 mL；在不
加接种剂的盆栽土中种植，用配置的梯度七水硫酸
锌溶液(浓度分别为 0.3 mg/kg, 1.2 mg/ kg, 2.5 mg/kg)，
每天早晚各浇 10 mL。以上盆栽实验均在 22℃光照培
养箱(每天进行 16 h光照, 8 h黑暗)内进行，培养 4周。
3.2.2紫云英总 DNA与 RNA的抽提及 cDNA合成
采集适量(约 0.1 g)的紫云英幼嫩叶片，用液氮
研成粉末，参照植物总 DNA提取试剂盒方法(天根
试剂 Plant DNA mini Kit,北京)；用核酸定量仪检测
DNA的浓度与纯度。将处理过的紫云英从盆钵中小
心取出，保证根的完整性，将根系在蒸馏水中漂洗干
净，用吸水纸擦净后置于液氮中。采用 CTAB法提取紫
云英的总 RNA。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的
完整性，利用核酸定量仪(Thermo NANODrop 2 000)
检测RNA的浓度和纯度。依据 TaKaRa公司的反转录
试剂盒操作手册进行实验，反转录合成第一链 cDNA，
并放入-20℃冰箱保存。
3.2.3 AsZIP2基因的克隆
通过 GenBank数据库中的豆科植物、马铃薯、番
茄等锌转运蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序
列，设计保守引物 AsZIPF1与 AsZIPR2，扩增目标
表 2本实验所用的引物
Table 2 Sequences of the primers used in this work
引物名称
Primer names
AsZIPF1
AsZIPF4
AsZIPF5
AsZIPR1
AsZIPR3
AsZIPR4
AsZIPR5
AsZIPR6
AsZIPR8
AsInvF1
AsInvF2
AsActinF
AsActinR
AD1
AD2
AD3
AD4
AC
dT18
引物序列 (5-3)
Primer sequences (5-3)
CAAAACCCTAAAGTCAAC
GTGACACTATTCTTCTCATCCTTGC
CTTAGGATGTTACCAAAG
TCAATCCCAAATCATGACAAC
CTCCATGCTTCCCCTTTAGTACCTG
CCACAACTTTATCTTCCCTCTG
GAAGAAAAGTCTCATTCCAACC
CTGAATCACCGTGTCCTCCATGACC
TTGGTTTTGGAGGATGAAGCC
GGTGGTGTGTCTCCTTACTTC
CTTGAGTGATTCCAATGAAACCT
GTTCTTTTCCAGCCTTCTATGA
ATGTTTCCGTACAGATCCTTTC
ATGGACTCCAGAGCGGCCGC
(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA
ATGGACTCCAGAGCGGCCGC
(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT
ATGGACTCCAGAGCGGCCGC
(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA
ATGGACTCCAGAGCGGCCGC
(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT
ACGATGGACTCCAGAG
TTTTTTTTTTTTTTTTTT
紫云英丛枝菌根共生锌转运蛋白基因 AsZIP2的克隆与表达调控
Cloning and Expression Regulation of a ZIP Family of AsZIP2 in Arbuscular Mycorrhizal Roots of Astragalus sinicus 618
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
AsZIP2基因编码区。反应程序：94℃预变性 1 min；
94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30 个
循环；72℃延伸 10 min，降温至 20℃。
AsZIP2基因 5端 UTR的克隆：通过 TAIL-PCR
的方法(Liu and Chen, 2007)扩增 5端未知 DNA序列，
反应程序见 TAIL-PCR的反应程序(表 3)，反应体系
如下：预扩增 PCR反应体系(20 μL)：1×Buffer，dNTPs
(0.25 mmoL)，AD (1, 2, 3, 4) (0.5 μmoL)，AsZIPR4
(0.5 μmoL)，DNA模板 1μL，TaqDNA聚合酶(0.05U)，
用 ddH2O补足到 20μL；第一轮 PCR反应体系(25μL)：
1×Buffer，dNTPs (0.2 mmoL)，AC (0.32 μmoL)，AsZIPR5
(0.32μmoL)，DNA模板(预扩增产物稀释 40倍) 1 μL，
TaqDNA聚合酶(0.04U)，用 ddH2O补足到 25μL；第二
轮 PCR反应体系(25μL)：1×Buffer，dNTPs (0.2mmoL)，
AC (0.32 μmoL)，AsZIPR7 (0.32 μmoL)，DNA模板(第
一轮产物稀释 10倍) 1 μL，Taq DNA聚合酶(0.04 U)，
用 ddH2O补足到 25 μL。
通过反向 PCR方法(Benkel and Fong, 1996)扩增
AsZIP2基因上游启动子序列：利用 Primer Premier 5
软件，查找已测序的编码区序列中单酶切位点 BglⅡ
和 SpeⅠ，设计两对嵌套的反向 PCR引物：AsInvF1/
AsZIPR7、AsInvF2/AsZIP8， 进 行 反 向 PCR 扩 增
AsZIP2的启动子区。首先对基因组 DNA进行 BglⅡ
表 3 TAIL-PCR的反应程序
Table 3 Thermal conditions for TAIL-PCR
预扩增反应
Pre-amplification
第一轮 TAIL-PCR
Primary TAIL-PCR
第二轮 TAIL-PCR
Secondary TAIL-PCR
步骤
Step
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
温度(℃)
Temperature (℃)
93
95
94
58
72
Go to step3
94
25
Ramping to 72℃
72
94
58
72
Goto step11
72
End
时间(min:s)
Time (min:s)
2:00
1:00
0:30
1:00
3:00
10 times
0:30
2:00
0.5℃/s
3:00
0:20
1:00
3:00
25 times
5:00
步骤
Step
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
温度(℃)
Temperature (℃)
94
65
72
94
65
72
94
50
72
Go to step1
72
End
时间(min:s)
Time (min:s)
2:00
1:00
3:00
0:20
1:00
3:00
0:20
1:00
3:00
7 times
5:00
步骤
Step
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
温度(℃)
Temperature (℃)
94
56
72
Go to step1
94
56
72
94
56
72
94
50
72
Go to step5
72
End
时间(min:s)
Time (min:s)
2:00
1:00
3:00
1 times
0:20
1:00
3:00
0:20
1:00
3:00
0:20
1:00
3:00
13 times
5:00
或者 SpeⅠ单酶切，然后进行 16℃过夜酶连反应。最
后以上述连接反应产物作为模板，进行两次嵌套
PCR扩增 5片段，反应体系及程序如下：第一轮 PCR
反应体系 (20 μL)：1×Buffer，dNTPs (0.25 mmoL)，
AsZIPR7 (0.4 μmoL)，AsInvF1 (0.4 μmoL)，DNA模板
2 μL，TaqDNA聚合酶(0.025U)，ddH2O补足到 20μL；
反应程序：94℃预变性 1 min；94℃变性 45 s，60℃退
火 40 s，72℃延伸 3 min，32循环；72℃延伸 10 min，
降至 20℃。第二轮 PCR反应体系(20 μL)：1×Buffer，
dNTPs(0.25 mmoL)，AsZIPR8 (0.4 μmoL)，AsInvF2
(0.4 μmoL)，DNA模板(稀释 20倍) 2 μL，Taq DNA聚
合酶(0.025 U)，ddH2O补足到 20 μL；PCR反应程序：
94℃预变性 1min，94℃变性 45 s，56℃退火 40 s，72℃
延伸 3 min，32循环；72℃延伸 10 min，降至 20℃。
利用RACE方法(Scotto-Lavinoetal.,2006a;2006b)
从紫云英根组织的 RNA 中获得 AsZIP2 基因全长
cDNA序列。
3.2.4紫云英 AsZIP2基因表达量的检测
以反转录得到的第一链 cDNA作为模板，分别
用设计的锌转运蛋白基因特异引物(AsZIPR3/4)与内
参肌动蛋白基因引物(AsActinF/R)进行 PCR反应，扩
增 AsZIP2和 AsActin，通过琼脂糖凝胶电泳和 EB染
色观察条带亮度检测 AsZIP2基因转录水平。通过荧
619
光定量 PCR检测不同处理对紫云英 AsZIP2的转录
水平的影响：将以上 cDNA稀释 5倍作为模板，以
AsActinF/R作为内参，荧光定量染料为 SYBR Green
Real time PCR Master Mix (TOYOBO)。利用 Applie
Biosystems 荧光定量 PCR 仪 (Step oneTM Real-Time
PCR system Thermal cycling ABI7300)进行基因表达
以及定量检测，反应后进行溶解曲线分析，结果采用
相对定量 2-△△Ct的计算方法。
3.3 统计分析
每组实验设置至少 3个生物重复，实验重复至少
3次，数据用 SPSS 16.0软件进行 t检验分析，p<0.05
视为差异显著, p<0.01或 p<0.001视为差异极其显著。
作者贡献
韩亚超和谢贤安是本研究的实验设计和实验执
行人，完成了数据分析和论文初稿的写作，是本研究
的共同第一作者；范晓宁、普明宇和林会参与实验设
计及试验结果分析；赵斌是项目的构思者及负责人，
指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作
者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目“丛枝菌根真菌
Glomus mosseae Gm201基因在共生早期信号转导中
的生物学功能研究”(31270159)、教育部高等学校青年
骨干教师国内访问学者项目(201312045)、安徽省教育
厅振兴计划“地方高职院校构建产学研平台的研究与
实践”(2014ZDJY120)和安徽省教育厅自然科学项目
“生态农业模式下淮北地区沼液中微生物多样性分析
及土壤修复性能的研究”(KJ2015A365)共同资助。
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International Journal of Marine Science (IJMS)
International Journal of Marine Science (ISSN 1927-6648) is an open access, peer reviewed
journal published online by BioPublisher. The journal publishes all the latest and outstanding
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