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应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2015，21 ( 2 ) : 234-241
2015-04-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2014.08021
收稿日期 Received: 2014-08-20 接受日期 Accepted: 2014-10-21
*教育部博士点基金项目（20135103120003）、国家自然科学基金项目（31300461）、四川农业大学“人才引进项目”和四川农业大学大学生创新
性实验计划项目和科研兴趣计划项目资助 Supported by the Doctoral Fund of Ministry of Education of China (20135103120003), the National Natural
Science Foundation of China (31300461), the Research Foundation for the Introduction of Talent of Sichuan Agricultural University, and the Innovative
Experiment and Research Interest Project for Undergraduates of Sichuan Agricultural University
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: yuxiumeicool@163.com)
四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和
三叶草根瘤菌的多样性分析*
李艳梅 钟宇舟 谭 渊 何中山 徐雯芳 陈 强 余秀梅**
四川农业大学资源环境学院微生物系 成都 610041
摘 要 为了解四川地区结瘤大豆根际土壤是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤菌及其多样性，从四川
盆地采集不同种植模式下结瘤大豆根际土壤样品31份，利用紫云英、苜蓿和三叶草进行盆栽捕获试验以获得共生根
瘤，从根瘤中分离纯化出根瘤菌，对其进行表型和分子鉴定；并将根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际以
检测根瘤菌的寄主范围. 在捕获实验中，苜蓿和三叶草分别在6个土壤样品中共生结瘤，而紫云英只在2个土样中共
生结瘤，并从共生根瘤中分离出14株根瘤菌；16S rDNA基因序列的相似性分析表明这14株根瘤菌均属于根瘤菌属
（Rhizobium），且16S rDNA基因的系统发育树揭示它们分属于根瘤菌属的不同种；这14株根瘤菌在回接实验中都只
能让捕获豆科植物结瘤，而不能让其他3种豆科植物结瘤. 本研究结果表明，四川地区结瘤大豆根际土壤中的紫云英
根瘤菌（Rhizobium astragali）、苜蓿根瘤菌（R. meliloti）和三叶草根瘤菌 （R. leguminosarum var. trifolii）资源较
少，其与大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）分属于不同的属，且根瘤菌的回接实验进一步证明了根瘤菌的寄
主专一性. 图1 表2 参33
关键词 根瘤菌；大豆根际土壤；紫云英；苜蓿；三叶草
CLC S154.381(271)
Diversity of rhizobia nodulating Astragalus sinicus, Medicago sativa and
Trifolium repens in nodulated soybean rhizosphere soil in Sichuan*
LI Yanmei, ZHONG Yuzhou, TAN Yuan, HE Zhongshan, XU Wenfang, CHEN Qiang & YU Xiumei**
Department of Microbiology, College of Resource and Environmental Sciences, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
Abstract This study collected thirty-one rhizosphere soil samples of nodulated soybean with different planting styles from
the Sichuan Basin to analyze whether rhizobia nodulating with Astragalus sinicus, Medicago sativa and Trifolium repens
appear around the nodulated soybean rhizosphere, and to understand their diversity. Three leguminous plants of A. sinicus,
M. sativa and T. repens were planted in the 31 soil samples to capture rhizobia. Rhizobia strains we re isolated from different
root nodules, and then phenotype and molecule identification were performed for them. To test the nodulating host scope,
rhizobia isolates were inoculated to A. sinicus, M. sativa, T. repens and Glycine max. The capture results showed that both M.
sativa and T. repens were nodulated in six different soil samples, whereas A. sinicus was nodulated in two soil samples. All
together 14 representative rhizobia strains were isolated from the 14 root nodule samples. Similarity analysis of 16S rDNA
genes identifi ed the 14 representative rhizobia strains as Rhizobium genus. Phylogenetic tree of 16S rDNA genes indicated that
the 14 representative stains were different species of Rhizobium genus. Nodulation test for each leguminous plants showed that
the rhizobia strains could nodulate only the original leguminous plant but not any other. The research result indicated limited
resource of Rhizobium astragali, R. meliloti and R. leguminosarum var. trifolii in the nodulated soybean rhizophere soil with
rich Bradyrhizobium japonicum of Sichuan, and that the limited rhizobia strains are of different genus from B. japonicum. The
host specifi city of rhizobia is also confi rmed by the nodulation test.
Keywords rhizobia; soybean rhizosphere soil; Astragalus sinicus; Medicago sativa; Trifolium repens
23521卷 李艳梅等
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根瘤菌（Rhizobia）是一类广泛分布于土壤中的革兰氏
阴性细菌，可以浸染豆科植物根部形成根瘤，固定空气中
的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养，所固定的氮约
占生物固氮总量的65% [1]. 早期的根瘤菌分类以互接种族和
寄主范围及一些简单的形态和生理性状为依据 [2]. 随着现
代分子生物学技术的迅速发展，根瘤菌分类学不断地被补
充与完善，根瘤菌系统发育研究更加趋于系统化、科学化 .
目前为止，根瘤菌科已发展到13属90种 [3]，主要有根瘤菌属
（Rhizobium）、中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、中慢生根瘤
菌属（Mesorhizobium）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、固
氮根瘤菌属（Azorhizobium）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、
叶瘤菌属（Phyllobacterium）等；其中慢生根瘤菌是固氮体
系中最主要的根瘤菌 [4]. 近年来，“可持续农业”和“绿色农
业”的提出更使得科研工作者越来越重视生物氮肥的制造
者——根瘤菌，因此，根瘤菌的属种分类还会逐渐增多.
大豆是世界上种植面积最大的油料作物和饲料作物之
一，我国是大豆的种植大国和大豆根瘤菌的发源地，因此大
豆根瘤菌的资源十分丰富[5]. 四川是主要的种植大省之一，
大豆种植推广新型的种植模式，其中“麦/玉/豆”和“麦/玉
/豆＋苕”模式是四川发展大豆生产的主要模式 [6]. 利用土
著的大豆根瘤菌可以发展推广大豆与其他作物种植模式，
研究价值较大 . 我国的土壤中含有与大豆共生结瘤的根瘤
菌较多，主要包括慢生根瘤菌属中的日本慢生根瘤菌（B.
japomicum）、辽宁慢生根瘤菌（B. liaoningense）、圆明慢生根
瘤菌（B. yuanmingense）和艾尔坎慢生根瘤菌（B. elkanii），中
华根瘤菌属中的费氏中华根瘤菌（S. fredii）以及中慢生根瘤
菌属中的天山中慢生根瘤菌（M. tianshanense）等 [3]. 1982年，
Harold从大豆根瘤中分离出的快生型根瘤菌与慢生型大豆根
瘤菌完全不一样，但能够使大豆结瘤固氮 [7]. 快生型大豆根
瘤菌（R. fredii）生长速度快，耐盐、耐碱且有很强的结瘤竞
争力，对大豆品种有明显的选择性，但能与我国的栽培大豆
有效共生，当两者形成良好的共生体系后固氮效果可超过日
本慢生根瘤菌，并能够被很好地应用于农业生产中[8].
四川地区豆科植物较多，作为饲料和肥料的紫云英、苜
蓿和三叶草在部分地区也有小面积种植，但不像大豆一样被
推广. 紫云英不仅可以作为绿肥，还具有较高的食用、饲用价
值，其根瘤菌的寄主范围较窄，感染性比较专一，接种根瘤
菌在其种植成败中起着关键作用，且多年种植紫云英的地
区接种优良的根瘤菌也能促进地上部分的增产 [9]. 苜蓿是一
种豆科牧草，口感好，营养高，适合大面积饲料种植，其根瘤
菌的固氮能力与根瘤菌的结瘤能力有关，接种筛选高效根瘤
菌后，固氮效率较高[10]. 三叶草具有生长范围广的特点，便于
种植和管理，且其优越的固氮性能对于草料产量的提高和畜
牧业的发展尤为关键，但其根瘤菌的研究相对较少[11].
四川地区的土壤类型主要是紫色土壤，主要分布在遂
宁、绵阳、资阳、乐山、自贡等多地. 黄怀琼等人研究发现种
植过大豆的紫色土壤中根瘤菌数量和种类明显多于种植非
大豆植物紫色土壤，同时证明了四川地区紫色土壤中含有丰
富的大豆根瘤菌[121. 本研究实验采集的土壤样品主要是四川
地区的结瘤大豆根际紫色土壤，所以土样中含有丰富的土著
根瘤菌. 目前，虽有对四川地区三叶草和苜蓿根瘤菌多样性
分析的相关研究报道，但尚未见到四川地区紫云英根瘤菌
多样性的研究报道，而且也没发现四川地区其他的豆科植
物根瘤菌与三叶草、紫云英和苜蓿共生结瘤的相关报道. 鉴
于此，本研究通过盆栽捕获试验分析四川地区结瘤大豆根
际土壤中是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤
菌，并分析其多样性，旨在为在四川地区种植紫云英、苜蓿
和三叶草提供可利用的菌株资源，并为充分利用土地资源开
展大豆与紫云英、苜蓿和三叶草等豆科植物的轮作种植提供
依据.
1 材料与方法
1.1 材 料
2012年8月从四川乐山、峨眉、绵阳、广安、南充、简阳、
眉山等地采集31份结瘤大豆根际土壤（表1）. 大豆种植模式
包括大豆、玉米–大豆套种、花生–大豆套种、红苕–大豆套
种、玉米–大豆–红薯套作. 采集结瘤的大豆根际土壤（根表
面10 cm范围内）装于无菌自封袋中，带回实验室在室温黑暗
条件下短期保存，并尽快进行豆科植物盆栽捕获根瘤菌试验.
1.2 方 法
1.2.1 豆科植物盆栽实验 选择紫云英、苜蓿和三叶草大小
相近且完好无损的种子，用纱布包裹于95%的酒精浸泡30
s，0.1%的HgCl2溶液浸泡灭菌5 min，无菌水清洗5-6次 [13]；撒
在灭菌的琼脂糖固体培养基（15 g L-1）上，置于温室避光发
芽. 将发芽的种子种在装有大豆根际土壤的花盆中，深度3-4
cm，放置在光照室培养3个月后，调查并收集根瘤. 种植过程
中，每隔3-5 d补充灭菌的无氮营养液 [14]（MgSO4.7H2O 0.1 g
L-1，CaSO4 0.46 g L-1，K2HPO4 0.136 g L-1，KCl 0.75 g L-1，柠檬
酸铁0.075 g L-1，H2BO3 2.86 mg L-1，MnSO4 1.81 mg L-1，ZnSO4
2.2 mg L-1，CuSO4.5H2O 0.8 mg L-1，H2MoO4 0.02 mg L-1）.
1.2.2 菌株的分离、纯化和保存 用蒸馏水洗净根瘤表面的
土壤后，用0.1%的升汞溶液表面灭菌3 min，再用75%的乙醇
溶液再次表面灭菌5 min，然后用无菌水冲洗5次以确保根
瘤菌表面无残留升汞和乙醇 [15]；取3颗根瘤放置在牛肉膏培
养基 [16]（牛肉膏5.0 g L-1、蛋白胨10 g L-1、NaCl 5.0 g L-1，琼
脂粉18 g L-1，pH值为7.2-7.4）平板上培养24h以检测表面灭
菌是否彻底. 于无菌条件下，选取表面灭菌彻底的根瘤放入
无菌EP管中，用无菌镊子压破根瘤后，用无菌接种环沾取
根瘤浆液，在YMA培养基 [16]（甘露醇5.0 g L-1，酵母粉1.0 g
L-1， K2HPO4 0.5 g L-1，MgSO4.7H2O 0.2 g L-1，NaCl 0.1 g L-1，
CaCO3 3.0 g L
-1，琼脂粉18 g L-1，pH 7.0）上进行平板划线，28
℃培养箱中培养3-12 d后，挑取在YMA培养基上不吸刚果红
色素呈乳白色略透明且有粘性的单菌落 [17]，观察菌体形态，
以获得表型似根瘤菌的菌株，保种于YMA斜面上（-20 ℃）
和30%甘油管（-80 ℃）中.
1.2.3 菌株的生理生化鉴定 为了进一步证明分离菌株为根
瘤菌，将分离保存的根瘤菌进行部分生理生化实验 [18]：首
先，进行3-酮基乳糖反应，用无菌接种环点种菌株在3-酮基
乳糖培养基上，置于28 ℃培养箱培养2 d，长出明显的菌落
后，加本迪尼克特试剂掩盖菌落，室温放置1 h，观察菌落的
颜色变化，菌落周围未出现黄褐色沉淀的则可初判定为根瘤
236
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四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析 2期
菌；然后，将3-酮基乳糖反应结果显示为疑似根瘤菌的菌株
进行牛肉膏蛋白胨反应测试，即将菌株接种于牛肉膏蛋白胨
液体培养基中35 ℃培养72 h，不接菌的做空白对照，如果接
种菌株不能在试管中生长，与空白试管一样清澈，则是根瘤
菌，反之则不是根瘤菌.
1.2.4 根瘤菌DNA的提取　　根瘤菌DNA提取采用异硫氰
酸胍（GUTC）法 [19]：即接种根瘤菌到YMB菌液中，在28 ℃
150 r min-1的摇床中培养2-3 d，收集菌液到灭菌的Eppendorf
管（1.5 mL）中，再将Eppendorf 管置于离心机（Centrifuge
5804R，北京博仪恒业科技发展有限公司）内以转速8 000 r
min-1离心 5 min，弃去上清液收集菌体. 首先，往收集好菌
体的离心管中加入10 μL的溶菌酶置于37 ℃的控温箱裂解菌
体30 min， 再加入300 μL的4 mol L-1 GUTC充分混匀后10 000
r min-1离心1 min，转移上清液加入硅藻土吸附液30 μL，静置
15 min后10 000 r min-1离心1 min，弃上清液；再加200 μl 4 mol
L-1 GUTC，离心后弃上清液；先用洗涤缓冲液300 μL洗涤硅
藻土沉淀3次，再用200 μL 70%酒精洗涤1次，10 000 r min-1离
心3 min弃上清液，37 ℃烘干40 min，加入40 μL 1 × TE缓冲液
（Tris-HCl 0.024 22 g，EDTA 0.074 55 g ，先用超纯水溶解，待
溶解后用超纯水定容至200 mL），55 ℃水浴10 min，取上清
液进行琼脂糖凝胶电泳检测后保存于-20 ℃冰箱.
1. 2 . 5 16 S r DNA扩增和序列分析 P C R扩增引物为
16S rDNA的基因通用引物对 [20] P1（5’- CGGGATCCAG
AGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGAACGCT-3’）和P6（5’-CG
GGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCA CCCC-3’），引
物由深圳华大基因公司合成；PCR扩增采用50 μL体系[21]，其
中Reaction Buffer（10 ×）5.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，
P1（10 μmol/L）1.0 μL，P6（10 μmol/L）1.0 μL，Taq聚合酶（5
U/μL）0.5 μL，模板DNA（50 ng）1.0 μL，ddH2O 40.5 μL（PCR
扩增试剂均购置于上海生工生物技术有限公司）. PCR扩增
程序 [22]为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1
min，72 ℃延伸1.5 min，共进行30个循环，然后72 ℃延伸10
min. PCR产物用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性
PCR产物进行测序（华大基因，深圳）. 16S rDNA基因序列
在GenBank数据库里进行BLAST分析 [23]，获得16S rDNA基
因的序列相似性及同源基因. 然后，用MEGA5.0软件采用邻
表1 结瘤大豆根际土样信息及紫云英、苜蓿和三叶草捕获分离的根瘤菌
Table 1 Characteristics of soil samples from nodulated soybean rhizosphere and the rhizobia strains captured by Astragalus sinicus, Medicago sativa
and Trifolium repens
土样
Soil sample
采集地点
Collection site
经纬度
Longitude and latitude
大豆种植模式
Planting pattern of
soybean
紫云英
Astragalus
sinicus
苜蓿
Medicago
sativa
三叶草
Trifolium
repens
SR1 仁寿县 Renshouxian 29°55’07.0 N, 104°08’ 31.8 E I - - -
SR2 井研县 Jingyanxian 29°34’58.6 N, 104°03’ 02.0 E I HR1 - -
SR3 贡井区 Gongjingqu 29°23’24.5 N, 104°34’ 11.5 E II - - HR11
SR4 富顺县 Fushunxian 29°10’56.8 N, 104°57’ 10.3 E V - - -
SR5 翠屏区 Cuipingqu 28°45’18.0 N, 104°41’ 28.7 E I - - -
SR6 长宁县 Changningxian 28°40’20.5 N, 104°58’ 51.7 E III - - HR14
SR7 江安县 Jianganxian 28°45’55.3N, 105°16’ 19.9 E III - - -
SR8 龙马潭 Longmatan 28°56’27.6N, 105°26’ 46.9 E III - - -
SR9 泸县 Luxian 29°08’19.5N, 105°22’ 28.2 E III - - -
SR10 东兴区 Dongxingqu 29°23’30.3N, 105°04’58.1 E III - - -
SR11 资中县 Zizhong 29°49’49.3N, 104°43’10.2 E III - - -
SR12 安岳县 Anyuexian 30°08’53.3N, 105°21’51.8 E III - - HR9
SR13 安岳县 Anyuexian 29°57’16.5N, 104°36’51.3 E IV - - HR10
SR14 简阳市 Jianyangshi 30°20’51.3N, 104°35’19.5 E II - HR5 -
SR15 简阳市 Jianyangshi 30°18’23.4N, 104°45’59.2 E V - - -
SR16 乐至县 Lezhixian 30°09’56.4N, 105°10’13.2 E I - - -
SR17 船山区 Chuanshanqu 30°34’20.2N, 105°37’02.0 E I - - -
SR18 蓬溪县 Pengxixian 30°28’17.4N, 105°49’13.0 E I - - -
SR19 武胜县 Wushengxian 30°22’08.0N, 106°20’19.5E III - HR8 -
SR20 岳池县 Yuechixian 30°40’12.1N, 106°27’26.4E III - - -
SR21 蓬安县 Penganxian 31°01’12.7N, 106°27’34.9E I - - -
SR22 仪陇县 Yilongxian 31°17’37.6N, 106°28’01.9E I - HR3 -
SR23 南部县 Nanbuxian 31°12’46.9N, 106°11’53.8E I - - HR12
SR24 西充县 Xichongxian 31°09’01.9N, 105°50’49.4E I - - -
SR25 盐亭县 Yantingxian 31°13’18.7N, 105°17’37.7E I HR2 - -
SR26 三台县 Santaixian 31°08’42.1N, 105°06’14.6E III - - -
SR27 中江县 Zhongjiangxian 31°05’00.2N, 104°46’43.6E I - HR6 -
SR28 梓潼县 Zhitongxian 31°36’24.0 N, 103°06’36.0E I - - HR13
SR29 峨眉山 Emeishan 29°35’34.7 N, 103°22’ 38.0 E III - HR7 -
SR30 峨眉山 Emeishan 29°35’56.9 N, 103°17’ 29.6 E III - - -
SR31 峨眉山 Emeishan 29°34’47.4N, 103°26’34.7E III - HR4 -
-：豆科植物在盆栽捕获实验中未结瘤，因而无分离纯化的根瘤菌. 大豆种植模式：I，玉 /豆套种；II，玉 /豆＋苕套种；III，大豆单种；IV，苕/豆套种；
V，花生/豆套种.
-: No rhizobia strains isolated because the leguminous plants did not nodulate in the capture experiment. Planting patterns of soybean: I, Corn/Soybean; II,
Corn/Soybean/ Sweet potota; III, Soybean; IV, Sweet potota/Soybean; V, Peanut/Soybean.
23721卷 李艳梅等
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接（Neighbour-Joining）对根瘤菌的16S rDNA构建系统发育
树[24].
1.2.6 根瘤菌的回接实验 根瘤菌回接试验采用改进的
Leonard’s Jar装置 [25]来进行种植，即称取一定量的蛭石装入
啤酒瓶中，用无氮营养液润湿基质，并在下方的塑料底瓶中
加满无氮营养液，用透气封口膜密封瓶口上方，在灭菌锅内
1 × 105 Pa 121 ℃灭菌30 min. 将紫云英、苜蓿、三叶草和大豆4
种豆科植物的种子按照上述1.2.1的方法灭菌催芽，在无菌操
作台里将表面灭菌催芽的紫云英、苜蓿、三叶草和大豆种子
播种在已灭菌并冷却后的啤酒瓶的蛭石内，并密封瓶口，置
于温室中培养；待植物长出土表2-3 cm后，接种根瘤菌菌悬液
（108个细胞）1 mL于植物根围，并在表面铺上已灭菌并干燥
石英砂防止杂菌进入装置. 每个处理3个重复，并以不接菌的
处理作为对照，在光照室（25 ℃光照17 h和17℃黑暗7 h）中培
养35 d后调查植株结瘤情况.
2 结果与分析
2.1 盆栽捕获实验和菌株的分离纯化
紫云英在2个土壤样品（SR2和SR25）中结瘤，苜蓿在6
个土壤样品（SR14，SR19，SR22，SR27，SR29和SR31）中结
瘤，三叶草在6个土壤样品（SR3，SR6，SR12，SR13，SR23和
SR28）中结瘤. 挑选每个结瘤植株根系较大的3颗根瘤进行
表面灭菌后破瘤，将根瘤浆液在刚果红YMA平板上进行划
线分离培养3-12 d后，平板上面长出均匀的乳白色鼻涕状单
菌落. 每个样品挑取2-3个单菌落进行纯化镜检，并选择革兰
氏染色为阴性的短杆状细菌，最后获得35株菌株.
2.2 菌株的生理生化鉴定
3-酮基乳糖反应实验表明，这35个分离纯化的菌株中
有19株菌株菌落不能在3-酮基乳糖培养基上形成黄褐色沉
淀，从而排除这19株菌株是土壤杆菌的可能性；进而对这19
株菌株进行牛肉膏蛋白胨反应，结果只有14株菌株（表1）不
能在牛肉膏蛋白胨培养基中生长，推测其为根瘤菌；其中，紫
云英根瘤菌2株（HR1和HR2），苜蓿根瘤菌6株（HR3，HR4，
HR5，HR6，HR7和HR8），三叶草根瘤菌6株（HR9，HR10，
HR11，HR12，HR13和HR14）.
2.3 根瘤菌16S rDNA基因的序列相似性分析
将这14株菌株的16S rDNA的PCR扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳检测，其扩增条带均（约1 400 bp）与根瘤菌16S
rDNA序列大小一致，且进行PCR产物测序. 并对14株菌株的
16S rDNA基因序列在GenBank数据库BLAST比对分析，其
与GenBank数据库内根瘤菌属的16S rDNA相似度达到99%-
100% （表2）. 因此，推测这14株根瘤菌菌株均属于根瘤菌
属. 提交这14个根瘤菌的16S rDNA基因序列到GenBank数据
库获得相应的序列编号（KM276556-KM276569）（表2）.
2.4 根瘤菌16S rDNA基因的系统发育树
利用软件MEGA5.0的邻接法（Neighbour-Joining）对14
株捕获的根瘤菌和根瘤菌属中的69个不同种标准菌株的16S
rDNA构建系统发育树（图1）. 结果表明，这14株根瘤菌在
16S rDNA的系统发育树上被聚为3个大类，分处于不同的进
化位置上，与标准菌株的相似度各不相同. 其中，来自苜蓿
的6株菌株（HR3，HR4，HR5，HR6，HR7，HR8）和来自三叶
草的2株菌株（HR13和HR14）在系统发育树上同处于一个分
支上面，且与R. pusense和R. larrymoorei遗传距离最近；而来
自三叶草的另外4株菌株（RH9，RH10，RH11和RH12）和R.
nepotum和R. radiobacter被聚类在同一个大的分支上面，说明
他们的遗传距离最近，而Rhizobium sp. HR11和HR10处于一
个独立的小分支上面，说明他们与另外两株菌株的16S rDNA
还有不同之处；紫云英捕获的两株根瘤菌（RH1和RH2）与R.
phaseoli、R. trifolii、R. pisi、R. leguminosarum、R. laguerreae
和R. fabae同处与一个分支上，说明他们的相似度最高，遗传
距离最近.
2.5 根瘤菌的回接实验
为进一步验证根瘤菌的寄主范围，将盆栽捕获的14株根
瘤菌分别接种到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际. 结果表
表2 根瘤菌的16S rDNA基因序列信息及相似性分析
Table 2 16S rDNA gene sequence information and similarity analysis of rhizobia isolates
菌株编号
Strain number
寄主植物
Host plant
序列编号
Accession number
长度(bp)
Length
16S rDNA相似性分析 Similarity analysis of 16S rDNA
分类类群
Class group
序列编号
Accession number
同源性
Similarity
属名
Genus name
HR1 紫云英 Astragalus sinicus KM276556 1345 II EF549398 100% Rhizobium sp.
HR2 紫云英 Astragalus sinicus KM276557 1350 II KC462456 100% Rhizobium sp.
HR3 苜蓿 Medicago sativa KM276558 1363 I KF008226 99% Rhizobium sp.
HR4 苜蓿 Medicago sativa KM276559 1276 I KF008225 99% Rhizobium sp.
HR5 苜蓿 Medicago sativa KM276560 1300 I KF542923 100% Rhizobium sp.
HR6 苜蓿 Medicago sativa KM276561 1361 I KF008226 99% Rhizobium sp.
HR7 苜蓿 Medicago sativa KM276562 1354 I KF542923 99% Rhizobium sp.
HR8 苜蓿 Medicago sativa KM276563 1240 I KF542923 100% Rhizobium sp.
HR9 三叶草 Trifolium repens KM276564 1316 I KF170820 100% Rhizobium sp.
HR10 三叶草 Trifolium repens KM276565 1206 I KF465964 99% Rhizobium sp.
HR11 三叶草 Trifolium repens KM276566 1153 I AB809378 99% Rhizobium sp.
HR12 三叶草 Trifolium repens KM276567 1254 I KF170820 100% Rhizobium sp.
HR13 三叶草 Trifolium repens KM276568 1241 I KF542923 99% Rhizobium sp.
HR14 三叶草 Trifolium repens KM276569 1322 I KF542923 99% Rhizobium sp.
分类类群来源于系统发育树16S rDNA（图1）.
Class groups are from the phylogenetic tree of 16S rDNA (Fig. 1).
238
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四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析 2期
图1 根瘤菌16S rDNA基因序列的邻接系统发育树. 粗体：捕获根瘤菌菌株. 参比菌株：根瘤菌属的标准菌株.
Fig. 1 Neighbour-Joining phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence for rhizobia isolates. Bold font: captured rhizobia strains. Reference strains:
standard strain of Rhizobium genus.
Rhizobium sp. HR7 (KM276562)
Rhizobium sp. HR8 (KM276563)
Rhizobium sp. HR6 (KM276561)
Rhizobium sp. HR5 (KM276560)
Rhizobium sp. HR3 (KM276558)
Rhizobium sp. HR4 (KM276559)
Rhizobium sp. HR13 (KM276568)
Rhizobium sp. HR14 (KM276569)
Rhizobium larrymoorei AF3.10 (Z30542)
Rhizobium pusense NRCPB10 (FJ969841)
Rhizobium rubi LMG17935 (AM181759)
Rhizobium skierniewicense Ch11 (HQ823551)
Rhizobium sp. HR10 (KM276565)
Rhizobium sp. HR11 (KM276566)
Rhizobium sp. HR9 (KM276564)
Rhizobium sp. HR12 (KM276567)
Rhizobium nepotum Pulawska39/7 (FR870231)
Rhizobium radiobacter IAM12048 (AB247615
Rhizobium selenitireducens B1 (EF440185)
Rhizobium halophytocola YC6881 (GU322905)
Rhizobium aggregatus IFAM1003 (X73041)
Rhizobium rosettiformans W3 (EU781656)
Rhizobium taibaishanense CCNWSX0483 (HM776997)
Rhizobium vitis NCPPB3554 (U45329)
Rhizobium undicola LMG11875 (Y17047)
Rhizobium daejeonense KCTC12121 (AY341343)
Rhizobium sphaerophysae CCNWGS0238 (FJ154088)
Rhizobium giardinii H152 (U86344)
Rhizobium herbae CCBAU83011 (EU399716)
Rhizobium subbaraonis JC85 (FR714938)
Rhizobium fredii LMG6217 (X67231)
Rhizobium meliloti IAM12611 (D14509)
Rhizobium huakuii IFO15243 (D13431)
Rhizobium ciceri NBRC100389 (AB681164)
Rhizobium loti ATCC33669 (D14514)
Rhizobium alamii GBV016 (AM931436)
Rhizobium mesosinicum CCBAU25010 (DQ100063)
Rhizobium endophyticum CCGE2052 (EU867317)
Rhizobium mesoamericanum CCGE501 (JF424606)
Rhizobium grahamii CCGE502 (JF424608)
Rhizobium tibeticum CCBAU85039 (EU256404)
Rhizobium phaseoli ATCC14482 (EF141340)
Rhizobium trifolii ATCC14480 (AY509900)
Rhizobium pisi ATCC10004 (AY509899)
Rhizobium leguminosarum ATCC10004 (AY509899)
Rhizobium laguerreae FB206 (JN558651)
Rhizobium fabae CCBAU33202 (DQ835306)
Rhizobium sp. HR2 (KM276557)
Rhizobium sp. HR1 (KM276556)
Rhizobium etli USDA9032 (U28916)
Rhizobium tubonense CCBAU85046 (EU256434)
Rhizobium calliandrae CCGE524 (JX855162)
Rhizobium multihospitium CCBAU83401 (EF035074)
Rhizobium hainanense I66 (U71078)
Rhizobium freirei PRF81 (EU488742)
Rhizobium tropici CIAT899 (U89832)
Rhizobium leucaenae LMG9517 (X67234)
Rhizobium jaguaris CCGE525 (JX855169)
Rhizobium vallis CCBAU65647 (FJ839677)
Rhizobium rhizogenes ATCC11325 (AY945955)
Rhizobium lusitanum P1-7 (AY738130)
Rhizobium mayense CCGE526 (JX855172)
Rhizobium miluonense CCBAU41251 (EF061096)
Rhizobium borbori DN316 (EF125187)
Rhizobium soli DS-42 (EF363715)
Rhizobium huautlense USDA4900 (AFO25852)
Rhizobium alkalisoli CCBAU01393 (EU074168)
Rhizobium galegae LMG6214 (X67226)
Rhizobium vignae CCBAU 05176 (GU128881)
Rhizobium paknamense L6-8 (AB733647)
Rhizobium sullae IS123 (Y10170)
Rhizobium azibense 23C2 (JN624691)
Rhizobium indigoferae CCBAU71042 (AF364068)
Rhizobium gallicum R-602 (U86343)
Rhizobium loessense CCBAU07190 (AF364069)
Rhizobium mongolense USDA1844 (U89817)
Rhizobium yanglingense SH22623 (AF003375 )
Rhizobium oryzae Alt505 (EU056823)
Rhizobium pseudoryzae J3-A127 (DQ454123)
Rhizobium endolithicum JC140 (HE818072)
Rhizobium rhizoryzae J3-AN59 (EF649779)
Rhizobium tarimense PL-41 (HM371420)
Rhizobium lupini DSM30140 (X87273)
99
99
99
93
96
80
99
86
76
97
50
99
58
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23921卷 李艳梅等
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明，这14株根瘤菌只能与来源寄主豆科植物共生结瘤，而对
其他的寄主豆科植物不能结瘤；结瘤率为100%，根瘤颜色为
红色，结瘤植株长势高大，叶片为深绿色；未接根瘤菌对照
豆科植物和其他非来源寄主豆科植物都不能共生根瘤，植株
长势相对较为矮小，且叶片出现黄化现象.
3 讨论与结论
大豆是四川地区的主要粮食作物之一，至2011年大豆年
种植面积达42万hm2，且播种面积还在逐年扩大. 近年来，四
川地区大面积推广“玉/豆”和“玉/豆＋苕”的种植模式 [26].
本研究采集的31份大豆根际土壤来自于“玉/豆套种”、“玉/
豆＋苕套种”、“花生/豆套种”、“苕/豆套种”、“大豆独种”
的种植模式，包括了四川地区大豆的主要种植模式，且土壤
样品采集范围广. 因此，土壤样品的来源和环境条件各不相
同. 据调查发现，四川大部分地区种植的大豆都能与土著根
瘤菌共生结瘤，说明四川地区土壤中含有丰富的大豆根瘤
菌；而作为牧草和饲料的三叶草在四川地区种植较为普遍，
紫云英在四川盆地的部分地区有少量种植，而苜蓿是近年
新引进西南地区的豆科牧草. 目前，我们还不清楚四川盆地
土壤是否像大豆一样含有丰富的三叶草、苜蓿和紫云英根
瘤菌. 为了确保土壤中含有根瘤菌且土壤环境适合根瘤菌生
长，以及探索大豆与其他豆科植物的轮作模式的可行性，本
研究主要采集了四川盆地结瘤大豆根际土壤来进行盆栽捕
获实验，分析四川盆地结瘤大豆根际土壤中是否也含有丰富
的紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌，这将为这3种豆科植物在四
川地区的推广种植以及其与大豆的轮作种植提供理论依据.
盆栽捕获实验结果显示紫云英、苜蓿和三叶草只能在31
个大豆根际土壤样品中的14个土壤样品中结瘤，说明含有丰
富大豆根瘤菌土壤中含有的紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌较
少；苜蓿和三叶草在6个不同土壤样品中结瘤来，紫云英只在
2个土壤样品中结瘤，说明紫云英根瘤菌不及苜蓿根瘤菌和
三叶草根瘤菌资源丰富. 据报道，豆科植物能与一种根瘤菌
或一种根瘤菌的几个菌株共生结瘤，而不能与其他根瘤菌共
生结瘤，且一种根瘤菌只能浸染一定范围的豆科植物，产生
有效根瘤，这表明豆科植物-根瘤菌共生体系的建立具有选
择性和寄主专一性 [27]. 本研究中的14个结瘤样品中并没有出
现两种以上豆科植物在同一土壤样品中结瘤，也表明了豆科
植物的根瘤菌具有寄主专一性. 陈文新等通过对中国多个地
区大量根瘤菌的研究，发现根瘤菌与豆科植物共生体系的建
立不只是由细菌与植物两者之间的关系决定，而是根瘤菌、
植物及环境三方相互作用的结果，豆科植物只有与适应环境
条件下的根瘤菌才能够建立共生体系[28]. 本研究中的盆栽实
验是在温室大棚模拟自然环境来完成的，与自然条件下农田
种植环境存在着一定的差异. 因此，紫云英、苜蓿和三叶草
只在少数几个土壤样品结瘤有可能受到外界环境的影响. 然
而，这14个结瘤样品又证明了盆栽实验条件是可行的，且温
室盆栽种植保障了实验条件的一致性和匹配性，因此，豆科
植物的盆栽捕获实验结果是可靠的.
16S rDNA由于基因序列的保守性已经被广泛应用于细
菌分类鉴定，主要包括16S rDNA的相似性分析和系统发育树
的构建. 本研究捕获的14株根瘤菌的16S rDNA基因序列与根
瘤菌属高度同源（99%-100%），说明他们都属于根瘤菌属菌
株（Rhizobium sp.）. 虽然只分析16S rDNA基因序列不能十分
准确地揭示出根瘤菌的分类地位，但还是能初步确定这些根
瘤菌在分类学中属的位置，对比很多确定菌株种属的方法，
16S rRNA序列测定分析更合适确定属及属以上分类单位的
亲缘关系[29]. 从16S rDNA基因系统发育树上看，根瘤菌属中
所有种的根瘤菌被分为了7大类，其中12株苜蓿和三叶草根
瘤菌属于I类，2株紫云英根瘤菌属于II类，但这14株根瘤菌在
系统发育树的进化地位是不同的. 其中，2个紫云英根瘤菌与
三叶草根瘤菌、豌豆根瘤菌和蚕豆根瘤菌等遗传距离最近；
苜蓿捕获不同土壤中的6个根瘤菌和三叶草捕获的2个根瘤菌
（RH13和RH14）同处于一个分支上面，与来自鹰嘴豆根际的
根瘤菌遗传距离最近；另外4株三叶草根瘤菌（RH9，RH10，
RH11和RH12）与放射根瘤菌遗传距离最近；6个三叶草根瘤
菌在系统发育树上处于3个不同的分支上面，说明它们虽然
相似度很高，都集中于I类大分支上面，但是他们还是有所不
同，这可能与来源和环境不同有关.
盆栽捕获的14株根瘤菌对紫云英、苜蓿、三叶草和大豆
4种植物的回接实验结果显示，其只能与来源寄主豆科植物
共生结瘤，而对其他的寄主豆科植物不能结瘤，这说明了根
瘤菌的寄主专一性. 大豆根际土著根瘤菌不一定与其他豆科
植物结瘤固氮，也说明了大豆根瘤菌的寄主范围较窄以及寄
主的专一性 [30]. 陈文新等研究江西、湖北、安徽、四川和浙
江等5省的67株待测菌株，发现三叶草根瘤菌主要分属于快
生根瘤菌属、中华根瘤菌属、中慢生根瘤菌属和慢生根瘤菌
属 [31]；吕飞等研究发现新疆、陕西三叶草根瘤菌主要属于三
叶草根瘤菌、豌豆根瘤菌（R.1eguminosarum）[11]；这说明了不
同属种的根瘤菌存在地区分布上的局限性和专一性. 本研究
从四川地区捕获的三叶草根瘤菌都属于根瘤菌属，也揭示了
四川地区三叶草根瘤菌的局限性 . 冯春生对西北地区天蓝
苜蓿的67株根瘤菌进行16S rDNA RFLP分析，发现苜蓿根瘤
菌菌株分别归属于中华根瘤菌属、根瘤菌属的卢根瘤菌（R.
gallicum）、豌豆根瘤菌属、内蒙古根瘤菌属（R. mongolense）
和土壤杆菌属 [32]. 管风贞利用16S rDNA进行序列分析，确定
紫云英根瘤菌的系统发育地位分属于中慢生根瘤菌属、黄单
孢菌属（Xanthomonas）、土壤杆菌属、根瘤菌属等 [13]. 本研究
捕获到14株根瘤菌都属于根瘤菌属，与前人报道的紫云英、
苜蓿和三叶草根瘤菌都包含有根瘤菌属菌株是一致的，说明
四川地区耕作土壤中根瘤菌属菌株资源相对较为丰富. 回接
实验中结瘤的豆科植物长势好，叶片发绿，结瘤的颜色为红
色，比未接根瘤菌对照豆科植物和其他非来源寄主豆科植物
长势较好. 李阜新等人的研究发现，有效瘤的颜色为肉色，是
由于根瘤中含有与固氮作用密切相关的红色的豆血红蛋白，
是固氮的先决条件 [33]. 因此，本研究回接实验中结瘤豆科植
物的红色根瘤是有效瘤，可以帮助豆科植物进行生物固氮提
供氮素营养.
紫云英、苜蓿和三叶草可作为肥料或饲料，且苜蓿还可
作为水土保持植物，防止水土流失，改善生态环境，因此应
用价值和潜力较大，值得进行大面积地推广种植. 本研究结
果说明四川地区耕作土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌较
240
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四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析 2期
少，因此要在四川地区种植作为饲料或肥料原材料的豆科植
物（紫云英、苜蓿和三叶草）还需补充氮素营养，而仅仅利用
土著根瘤菌来供给生长氮素营养所需是远远不够的；本研究
捕获的根瘤菌菌株资源可以被开发成为共生固氮豆科植物
的生物菌肥，可在种植过程中增施到植物根际，为其生长发
育提供氮营养，并可逐渐改善土壤中这些根瘤菌资源缺乏的
问题. 同时，由于四川地区土壤中大豆根瘤菌十分丰富，而苜
蓿、三叶草和紫云英根瘤菌比较少，因此可推广大豆与这3种
植物的轮作，可以使紫云英、苜蓿和三叶草间接利用大豆与
土著根瘤菌共生固氮补给土壤中的氮素营养，从而减少它们
在种植过程中工业氮肥的施用量；此外还可以充分利用大豆
种植前后的土地闲置期来合理地轮作大豆、紫云英、苜蓿和
三叶草等，达到充分利用土地资源的目的.
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