全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2014 年
紫云英根瘤中共生固氮下调表达基因的
分离与初步分析
李一星，吴 梅，李友国
（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）
摘要：对前期利用抑制消减杂交技术（Suppressive subtractive hybridization， SSH）构建的紫云英（Astra-
galus sinicus） 根部组织的共生固氮差异表达 cDNA 文库进行了全文库测序和初步分析， 并利用半定量
RT－PCR 方法验证了其中 5 个基因片段在根瘤中的下调表达。结果表明，从 180 个克隆中共获得 94 个有
效序列，文库插入片段长度为 200～1 300 bp。 BLAST 同源比对分析结果表明，有 90 个序列可以找到同源
片段，有 4 个可能为新基因，按功能分为 10 个类群。
关键词：紫云英（Astragalus sinicus）；共生固氮；抑制消减杂交；下调表达基因
中图分类号：S541＋．3；Q786 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）07－1684-06
Isolation and Analysis of Down－regulated Symbiotic Nitrogen Fixation Genes in
Astragalus sinicus Root Nodules
LI Yi－xing， WU Mei， LI You－guo
（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract： In previous work， a cDNA library of Astragalus sinicus genes related with symbiotic nitrogen fixation was con-
structed with suppressive subtractive hybridization（SSH）． The library containing down－regulated genes was sequenced and an-
alyzed． Among the sequenced genes， five fragments were sckeened and its down－regulated expressions were confirmed by se-
mi－quantitative RT－PCR． The results showed that 94 genes were obtained from 180 clones and the average length of inserted
fragments was 200～1 300 bp． Nucleotide BLAST homological analysis showed that 90 genes had similarities to known genes
and 4 genes were putatively novel genes． All the 94 genes were divided into 10 functional categories．
Key words：Astragalus sinicus； symbiotic nitrogen fixation； suppressive subtractive hybridization； down－regulated gene
第 53卷第 7期
2014年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.7
Apr．，2014
收稿日期：2014－01－10
基金项目：国家自然科学基金项目（31371549）；教育部博士点基金资助项目（20110146110012）
作者简介：李一星（1979－），女，河南南阳人，讲师，主要从事根瘤菌共生固氮的分子机理方面的研究，（电话）13627202708（电子信箱）liyixing39
＠mail．hzau．edu．cn；通讯作者，李友国，教授，博士，博士生导师，主要从事生物固氮、农业环境微生物方面的研究，（电话）
027-87281685（电子信箱）youguoli＠mail．hzau．edu．cn。
根瘤菌和豆科植物可以共生固氮，共生固氮是
一个二者相互识别、相互作用的复杂过程。 根瘤的
形成以及根瘤菌的入侵、分化和发育离不开植物基
因的参与和调控［1］。 这种调控涉及多种代谢途径和
信号传递过程，有多个基因参与。 对共生固氮过程
中基因表达情况进行全局性的研究，可以发现并鉴
定出更多与根瘤形成和固氮过程相关的基因，有助
于建立共生固氮的调控网络。 如研究者从蒺藜苜蓿
中鉴定出 756 个与根瘤形成和固氮相关的差异表
达基因，其中 313 个基因上调表达，而 443 个基因
则下调表达［2］。Lohar 等［3］也从苜蓿中检测出在根瘤
菌感染的 1～72 h 内各阶段上调或下调表达的基
因。 抑制消减杂交技术是一种以 mRNA 差异显示
为基础的筛选差异表达基因技术，已被广泛应用于
植物差异表达基因的研究。 Fan 等 ［4］利用抑制消减
杂交技术筛选出火龙果中与干旱胁迫相关的基因；
Guo 等 ［5］采用抑制消减杂交从胡椒中鉴定出 73 个
在低温胁迫下可能受脱落酸调控的基因； 韩明鹏
等 ［6］构建了紫花苜蓿高温胁迫条件下的抑制消减杂
交文库，用来筛选高温诱导表达的基因。 抑制消减
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.07.041
第 7 期
杂交技术同样是研究共生条件下差异表达基因的
有效手段。 Clement等［7］构建了干旱条件下大豆根瘤
的抑制消减杂交文库，并从中鉴定出一批与干旱条
件下根瘤的固氮功能相关的新基因。 Godiard等［8］通
过抑制消减杂交技术筛选出 52 个在根瘤菌－苜蓿
共生固氮过程中起调控作用的基因。
紫云英（Astragalus sinicus）是一种主要分布于
中国、日本和韩国等东南亚国家的豆科绿肥。 它和
华癸中慢生根瘤菌共生，形成不定型根瘤，二者的
共生具有严格的宿主专一性，是研究共生固氮的好
材料［9］。前期工作中 Chou等［10］构建了紫云英根瘤的
正向和反向抑制消减杂交文库，并通过上调文库鉴
定出 16 个共生条件下增强或诱导表达的新基因。
相对于上调表达基因， 下调表达基因同等重要，本
研究对前期构建的下调文库进行了全文库测序，并
对测序结果进行了同源比对分析，为后续基因功能
的研究提供参考。
1 材料和方法
1．1 材料
华 癸 中 慢 生 根 瘤 菌 7653R （Mesorhizobium
huakuii 7653R）为华中农业大学农业微生物学国家
重点实验室固氮室保存。 RNA抽提所用 Trizol试剂
购自 Invitrogen 公司 ，Taq DNA 聚合酶 、DNaseⅠ、
Reverse Transcriptase M－MLV 均购自 Takara 大连
有限公司。
1．2 方法
1．2．1 植物培养及结瘤 将紫云英种子用 70％乙
醇处理 5 min，再用 3％NaClO处理 10 min，然后用无
菌水洗涤 5～6次，将消毒后的种子用无菌水浸泡 2 h
后，平摊于含有 0．5％蔗糖和 1．2％琼脂的平皿上，置
于光照培养箱中 22 ℃培养。 待胚根长至 1 cm 左右
时，将种子接种于无菌沙钵中培养，子叶展开后接
种华癸中慢生根瘤菌 7653R。 所有植株均用无氮营
养液浇灌。
1．2．2 总 RNA 的提取和 cDNA 合成 接种根瘤菌
7653R后 26 d，收集根瘤、去除根瘤的根和未接种植
株的根 ， 用 Trizol 试剂提取根瘤组织总 RNA，经
DNaseⅠ处理后， 用紫外分光光度计测定其纯度和
浓度，然后用 DEPC水将各样品 RNA浓度调整到一
致。 取 3 μL总 RNA，以 Oligo dT18为引物，反转录酶
Reverse Transcriptase M－MLV 反转录得到 cDNA，
以 5′－ATGCAGATCTTTTGTGAAGAC－3′和 5′－AC-
CACCACGGAAGACGGAG －3′为引物 ， 进行 PCR
扩增保守基因泛素序列， 以验证 cDNA合成是否有
效。
1．2．3 半定量 RT－PCR 分别以根瘤、 去除根瘤的
根和未接种植株的根的 cDNA为模板， 用基因特异
性引物扩增 AsG6、AsC2、AsB3、AsT6、AsD5 这 5 个
基因片段，扩增产物经 2％琼脂糖凝胶电泳，进行半
定量分析， 以 232 bp 的 18S rRNA 基因片段为内
参。 所用引物序列见表 1。
1．2．4 序列分析 目的基因氨基酸序列推测及比
对利用 BioEdit软件进行。 同源比对利用 BLAST 程
序 （http： ／ ／ www．ncbi．nlm．nih．gov ／ ，http： ／ ／ ca．expasy．
org ／ ） 进行。 氨基酸保守结构域采用 InterProScan
（http： ／ ／ www．ebi．ac．uk ／ ）和 Pfam（http： ／ ／ www．sanger．
ac．uk ／ Software ／ ）数据库进行分析。
2 结果和分析
2．1 文库序列的聚类分析
将下调文库进行全文库测序， 共获得 94 个有
效序列，插入片段的大小在 200～1 300 bp。将所有序
列利用 BLAST 程序进行同源序列比对（表 2），结果
发现有 90 个序列可以找到同源片段， 同时有 4 个
序列在数据库中找不到同源片段，推测这 4 个序列
可能代表新的基因。 以上 94个有效序列对应 81个
基因，按其编码蛋白的功能分为 10 个类群（图 1）：
核糖体蛋白 9 个，信号转导相关蛋白 7 个，基因表
达相关蛋白 12 个，代谢相关蛋白 20 个，膜及转运
相关蛋白 11 个，细胞应激防御相关蛋白 8 个，未知
蛋白 6 个， 假定蛋白 3 个， 无同源性蛋白 4 个和 1
个其他蛋白。
2．2 半定量 RT－PCR验证
在测序得到的 94 个基因片段中， 分别选取过
氧化物酶、热激蛋白、C3HC4 型锌指蛋白、假定蛋白
表 1 RT-PCR 引物序列及其产物大小
基因名称
18S rRNA
AsC2
AsB3
AsT6
AsG6
AsD5
RT－PCR引物
L： 5′－GTATGGTCGCAAGGCTGAAAC－3′
R： 5′－TTAGCAGGCTGAGGTCTCGT－3′
L： 5′－GAGGAAATGAGTGTTACCTCTTTGTTGA－3′
R： 5′－CTTGAGTTACACGATGTGGAGGATAG－3′
L： 5′－GTGCACCATATAGACCAGACCCAAT－3′
R： 5′－CATGTTGTTGAATGTTCCGTGTGTT－3′
L： 5′－TTAACTTCAGCAAGCTTAGTGTGTG－3′
R： 5′－CAGGTACCAAAAAACAGAGTTCAAC－3′
L： 5′－GAGGTACTGATCCATCACATCCATT－3′
R： 5′－TTTTCCTAATGGGGAGAATTATGTG－3′
L：5′－TGGGATGCTTCAACAGACTTTAAT－3′
R： 5′－TTCACAACATCTTTGCCACTACTT－3′
产物大小
bp
232
243
216
174
296
184
李一星等：紫云英根瘤中共生固氮下调表达基因的分离与初步分析 1685
湖 北 农 业 科 学 2014 年
表 2 差异表达 cDNA 克隆的 BLAST 分析结果
克隆编号
AsA1
AsE8
AsG3
AsI3
AsJ4
AsL1
AsL3
AsL6
AsT5
AsJ7
AsN1
AsG2
AsJ7
AsC5
AsF4
AsG4
AsA7
AsG5
AsD2
AsB1
AsB4
AsQ1
AsB3
AsF6
AsI1
AsM3
AsU2
AsQ4
AsJ2
AsG8
AsM7
AsH7
AsX1
AsN8
AsI2
AsJ1
AsR2
AsP3
AsP6
AsQ3
AsW2
AsO2
AsD5
AsH5
AsJ8
AsH1
AsA8
AsO8
AsD4
AsU5
AsB7
同源性较高的蛋白
苜蓿核糖体蛋白 S9
苜蓿核糖体蛋白 S10
细胞质核糖体蛋白
苜蓿核糖体蛋白 L24E
辣椒 40S 核糖体蛋白 S5
辣椒 60S 核糖体蛋白 L37a
苜蓿核糖体蛋白 L10E
苜蓿核糖体蛋白 L32
苜蓿核糖体蛋白 S24e
苜蓿磷诱导蛋白 1
苜蓿钙调素蛋白 4
拟南芥泛素家族蛋白
苜蓿锚定蛋白
鹰嘴豆蛋白磷酸酶
苜蓿蛋白激酶
苜蓿磷诱导蛋白 1
苜蓿转录因子、翻译延伸因子 G
苜蓿延伸因子 1 的 γ 链；谷胱甘肽 S-转移酶 C 端
苜蓿 RNA 结合蛋白 RNP-1
苜蓿核糖体结合因子 A
拟南芥翻译起始因子
拟南芥真核翻译起始因子 SUI1
拟南芥 C3HC4 型锌指家族蛋白
拉瑞尔 WRKY 转录因子 21
大豆 NAC2 蛋白
拟南芥 GCN5 相关的 N 乙酰转移酶家族蛋白
GTP 结合蛋白
苜蓿脱氧核糖二嘧啶光解酶 1
苜蓿氨甲酰磷酸合酶；谷氨酰胺氨基转移酶
拟南芥 UDP-葡萄糖醛酸酯-4-异构酶
水稻亲环素
大豆分支酸合酶
UDP-葡萄糖-4-差向异构酶
苯丙氨酸解氨酶
苜蓿酮脂酰合酶；SAM 依赖的羧甲基转移酶
拟南芥长链脂肪酸-辅酶 A 连接酶家族蛋白
苜蓿反式肉桂酸 4 -单加氧酶
苜蓿 S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶
苜蓿唾液酸转移酶样蛋白
苜蓿 NAD 依赖型异柠檬酸脱氢酶
水稻 ATP-NAD 激酶家族蛋白
豌豆蔗糖合成酶异构体 3
苜蓿质体蓝素
胡黄连乙酰乙酰 CoA 硫解酶
苜蓿硫解酶
大豆抗坏血酸氧化酶前体
豌豆 12-氧代植二烯酸-10，11-还原酶
马铃薯转醛醇酶
苜蓿硫氧还蛋白 h
三叶草预测的细胞溶质因子
蔗糖转运蛋白
克隆数
2
1
1
1
1
1
1
1
2
2
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
E 值
3e-71
3e-33
5e-57
4e-55
3e-46
3e-46
3e-119
1e-59
5e-45
4e-95
5e-79
2e-8
7e-14
1e-47
8e-104
7e-93
1e-99
6e-67
1e-70
2e-82
1e-48
1e-48
3e-67
2e-34
9e-31
7e-70
6e-35
1e-94
4e-38
2e-38
1e-73
3e-137
2e-93
4e-76
5e-77
1e-121
2e-60
1e-83
6e-96
2e-142
7e-58
1e-145
1e-75
1e-53
5e-64
1e-100
8e-126
5e-149
2e-44
2e-23
3e-68
类群
核糖体蛋白
信号转导
基因表达
初生和次生代谢
1686
第 7 期
和质体蓝素蛋白 5 个基因片段 AsG6、AsC2、AsB3、
AsT6、AsD5（表 2）对其下调表达进行验证。 提取接
种后 26 d 的紫云英根瘤、 感染根和未接种对照根
的总 RNA，进行半定量 RT－PCR分析。以 232 bp的
18S rRNA 基因片段为内参， 检测 5 个目标基因的
半定量结果。 由图 2 可知，与未接种的根相比，这 5
个基因在根瘤中的表达量大大降低，呈明显的下调
表达特征，这说明文库的结果是可靠的。
3 结论与讨论
3．1 基因表达相关蛋白
El Yahyaoui 等 ［2］在蒺藜苜蓿根瘤中发现了 13
各分类后数字表示蛋白个数占总蛋白数的比例
图 1 文库序列测序结果分布
无同源性蛋白，5%
未知蛋白，7%
其他蛋白，1%
核糖体蛋白，11%
信 号 转 导 相
关蛋白，9%
基因表达相关
蛋白，15%
假定蛋白，4%
细胞应激防御相
关蛋白，10%
膜及转运相关
蛋白，13%
代谢相关蛋白，25%
AsG6
AsC2
AsD5
AsT6
AsB3
18S rRNA
Q R N
Q．接种 26 d 后去除根瘤的根；N． 接种 26 d 后的根瘤；R．未接种
的根；以 18S rRNA基因片段为内参。
图 2 5 个基因的半定量 RT－PCR 电泳结果
AsK4
AsF3
AsK8
AsI2
AsE7
AsF2
AsE5
AsU8
AsG6
AsQ8
AsO1
AsN4
AsF5
AsC2
AsW3
AsV1
AsP2
AsS7
AsU7
AsX7
AsM2
AsV3
AsT7
AsU3
AsT6
AsA2
AsJ6
AsQ2
AsW7
AsX8
水稻移位内膜样蛋白
马铃薯 G 蛋白偶联受体
苜蓿异戊烯 RAB 受体 PRA1
苜蓿钠钙交换体蛋白
大豆 Syringolide 诱导蛋白
拟南芥液泡储藏蛋白 55 家族蛋白
大豆包含 VHS 和 GAT 结构域的蛋白
拟南芥带 7 家族蛋白
拟南芥过氧化物酶
苜蓿蛋白酶体组件的 PCI 区域
苜蓿脂肪酸酰基辅酶 A 脱氢酶
苜蓿生存蛋白 SurE
苜蓿 4Fe-4S 铁氧还蛋白；热激蛋白 DnaJ
紫茎泽兰热激蛋白 Hsp70
水稻 DnaJ 类伴侣蛋白
菘蓝管腔结合蛋白
拟南芥未知蛋白
苜蓿未知蛋白 DUF538
拟南芥未知蛋白
苜蓿未知蛋白
葡萄未知蛋白
苜蓿未知蛋白
拟南芥假定蛋白
苜蓿假定蛋白 MtrDRAFT
毛果杨假定蛋白
烟草 PS60 蛋白
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3e-27
2e-56
1e-83
5e-132
4e-59
4e-51
4e-59
1e-4
1e-43
3e-102
1e-18
7e-79
2e-42
2e-64
1e-40
7e-104
2e-14
2e-54
8e-58
1e-83
4e-29
2e-49
8e-46
6e-5
3e-51
5e-113
膜和转运
防御和应激
未知蛋白
假定蛋白
其他
无同源性蛋白
类群 克隆编号 同源性较高的蛋白 克隆数 E 值
续表 2
李一星等：紫云英根瘤中共生固氮下调表达基因的分离与初步分析 1687
湖 北 农 业 科 学 2014 年
个上调表达的转录因子和 11 个下调表达的转录因
子，基因芯片结果显示，其中一些转录因子可能与
结瘤素基因的表达相关，在下调基因中包括一个与
DNA结合的 WRKY蛋白。 Lohar 等［3］对苜蓿早期共
生阶段的转录组进行测序，发现了许多 WRKY家族
基因的下调表达。 本研究也发现一个 WRKY家族基
因 AsF6的下调表达。WRKY家族基因在植物抵抗病
原菌侵染和其他非生物胁迫的过程中发挥重要的调
节作用，其靶蛋白可能是病程相关蛋白，因此 WRKY
与防御相关蛋白的表达有关［11］。 除 WRKY 外，本研
究还发现了 1 个 NAC 家族基因AsI1 的下调表达。
NAC家族是植物转录因子中最大的家族之一， 在植
物抵抗不同的生物和非生物胁迫中发挥重要的调节
作用 ［12］，如 NAC 家族成员参与植物对干旱、低温、
盐等胁迫的反应 ［13］，在植物应对病原菌的防御反应
中发挥作用［14］。 另外，一些 NAC家族成员在植物发
育的过程中发挥调节作用，如种子萌发 ［15］、细胞分
裂 ［16］、叶的衰老［17］等。
近年来，对苜蓿 MtNAC969 研究发现，其在根
应对盐胁迫的过程中发挥负调控作用， 而在苜蓿与
根瘤菌的共生过程中可以刺激侧根的形成， 但不影
响根瘤数量， 同时在根瘤中的下调表达导致根瘤提
前衰老［18］。 因此，本研究中发现的 NAC 蛋白在共生
过程中可能也发挥重要的调节作用，值得深入研究。
3．2 信号转导和膜转运相关基因
目前发现在根瘤菌和宿主共生的过程中，植物
中有很多信号传导相关基因是上调表达的。 同时，
El Yahyaoui 等 ［2］发现在苜蓿中有些信号转导相关
基因是下调表达的，如钙调素－GTP 结合蛋白、锌指
蛋白 、 蛋白激酶以及与 CLAVATA1、Lj HAR 和
GmNARK 同源的受体激酶，可能与结瘤的自主调节
有关。 本研究也发现了许多紫云英根瘤中下调表达
的信号转导相关基因，包括编码磷酸诱导蛋白 1、钙
调蛋白 4、泛素家族蛋白、蛋白磷酸酶、蛋白激酶等
的基因。
膜转运相关蛋白在类菌体与植物细胞物质交换
的过程中发挥重要作用， 根瘤的固氮会增加根瘤和
根部的氨基酸、己糖、硫酸盐等的转运，同时有一些
转运基因被下调表达， 如某些磷酸盐和硝酸盐转运
基因在苜蓿的根瘤中下调表达［19］。 本研究中下调的
相关基因有 11个（膜及转运相关蛋白对应基因），编
码蛋白包括硫氧还蛋白 h、细胞溶质因子、蔗糖转运
蛋白、G 蛋白偶联受体、钠钙交换体蛋白、液泡储藏
蛋白 55 家族蛋白等。
3．3 代谢相关蛋白
在下调表达的基因中，初级和次级代谢相关基
因较多，包括 UDP－葡糖醛酸酯－4－异构酶、分支酸
合成酶、SAM 依赖的羧甲基转移酶、长链脂肪酸-辅
酶 A连接酶家族蛋白、S－腺苷-L-甲硫氨酸合成酶、
NAD 依赖型异柠檬酸脱氢酶、质体蓝素、12－氧代植
二烯酸－10，11－还原酶等 22个基因。 El Yahyaoui等
［2］也研究发现与根中相比，大量与初级和次级代谢
相关的基因在苜蓿根瘤中被下调表达。 这可能反映
了根瘤与根在代谢水平上的差异，如在根瘤中很多
代谢途径受到了抑制，另一些与固氮相关的代谢途
径却被激活。
3．4 防御和应激相关基因
一般认为， 根瘤菌与植物共生的过程中需要抑
制宿主的防御机制，从而保证其成功入侵 ［20］。 事实
上， 确实有很多与病程和防御相关的基因表达在共
生过程中受到抑制，如在苜蓿中编码过氧化物酶、多
数非特异性转脂蛋白、脂肪氧化酶、PR10 ／ Betv1、Ku-
nitz 型胰蛋白酶抑制剂等的基因均被下调表达。 本
研究中发现 1 个过氧化物酶编码基因 AsG6的下调
表达，除此之外下调的基因还包括脂肪酸酰基辅酶
A 脱氢酶、生存蛋白、过氧化物酶、热激蛋白 Hsp70、
铁氧化还蛋白、dnaJ 伴侣蛋白等。 豆科植物通过抑
制防御基因的表达允许根瘤菌的侵入，然而某些防
御和抗病相关基因的上调表达又说明豆科植物同
时还要限制根瘤菌的侵入，或保护根瘤不受病原菌
和昆虫的侵害［21］。
3．5 未知基因、假设蛋白基因和无同源性基因
在下调基因中，未知蛋白编码基因有 6 个，假定
蛋白基因有 3 个，无任何同源性的基因有 4 个，这些
基因都有可能是一些尚未被发现的新基因， 特别是
无任何同源性的 4个基因，有待进一步研究。
参考文献：
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（1）：322－331．
1688
第 7 期
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（上接第 1636页）
3 小结与讨论
本试验运用了响应面法中的 Plackett－Burman
试验设计、最陡爬坡试验、Box－Behnken 试验设计来
优化放线菌 G5 的发酵条件。 利用 Plackett－Burman
试验设计来确定主效应因子为淀粉含量、 培养温
度、培养天数。 利用最陡爬坡试验来确定 3 个主效
因子的变化方向和步长，Box－Behnken 试验则用于
确定最优值，得出其最优条件为淀粉含量 21．66 g/L、
培养温度 27．70 ℃、培养时间 7．75 d。 模型预测的 D
值为 22．67 mm，经验证结果为 23．00 mm。 结果表明
模型预测与试验验证结果基本一致，用该模型可以
合理、有效地预测 D值。
参考文献：
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