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榅桲叶抗高血压有效部位筛选及抗氧化作用的实验研究



全 文 :榅桲叶抗高血压有效部位筛选及抗氧化作用的实验研究
周文婷1,邬利娅·伊明1,阿不来提·阿不力孜1,田树革2,艾尼瓦尔·吾买尔1* ,Nicholas MOORE3
(1. 新疆医科大学基础医学院药理教研室,新疆 乌鲁木齐 830011;2. 新疆医科大学中医学院中药教研室,
新疆 乌鲁木齐 830011;3. 法国波尔多第二大学药理教研室,法国 波尔多)
摘要 目的:通过两肾一夹肾性高血压大鼠模型,筛选榅桲叶抗高血压有效部位,并测定其对大鼠血清抗氧化
水平的影响。方法:采用溶剂萃取法将榅桲叶 65%乙醇提取物分为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水 4 个部位,利用
两肾一夹法(2K1C)制造肾性高血压大鼠(RHR)模型,连续给药 8 w 观察并记录各组收缩压(SBP)和舒张压
(DBP)变化情况,进行榅桲叶抗高血压作用有效部位筛选,并通过测定几种血清抗氧化酶的活性,初步观察其抗氧
化作用。结果:乙酸乙酯部位组动物 SBP和 DBP下降最为显著,与模型组比较有显著性差异(P < 0. 05);榅桲叶不
同极性提取部位组均能不同程度地增强 T-AOC,增加 GSH-ST、NOS和 SOD活性,降低 MDA含量的作用。结论:榅
桲叶抗高血压作用的有效部位为乙酸乙酯部位,其抗高血压作用可能与增强机体抗氧化水平有关。
关键词 榅桲;抗高血压;有效部位;抗氧化
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)12-2004-04
收稿日期:2013-03-15
基金项目:新疆维吾尔自治区科技计划项目(201033126)
作者简介:周文婷(1983-),女,在读博士研究生,讲师,专业方向:心血管药理学;Tel:15899168882,E-mail:sherry_zwt@ 126. com。
* 通讯作者:艾尼瓦尔·吾买尔,Tel:0991-4365602,E-mail:anwar. umar@ 126. com。
榅桲 Cydonia oblonga Mill. 为蔷薇科榅桲属植
物〔1〕。榅桲含有多种生物活性成分,如黄酮类、糖
类、生物碱类、氨基酸及多肽、挥发油等〔2,3〕。根据
《维吾尔常用药材学》记载,榅桲叶具有降血压、调
血脂、补血、补肾、止泻、利尿、心脏病等功效〔1〕。还
有资料报道榅桲叶具有抗氧化、抗菌方面的作
用〔4,5〕。榅桲的活性成分和作用机制尚缺乏深入研
究。榅桲在新疆栽培范围非常广,研究其活性成分,
开发地产资源,发展民族药前景广阔。本课题组前
期研究结果显示,榅桲叶提取物可降低肾性高血压
大鼠收缩压和舒张压,且乙醇提取物效果优于水提
取物,表明榅桲叶具有一定的降血压作用且有效成
分在乙醇提取物中含量较高。因此,本实验将进一
步利用肾性高血压大鼠动物模型(2K1C),以收缩压
和舒张压为考察指标,对榅桲叶抗高血压有效部位
进行筛选研究,并通过测定大鼠血清抗氧化指标,初
步评价榅桲各提取部位对机体抗氧化水平的影响,
为进一步探讨其抗高血压作用的物质基础及作用机
制提供一定的研究基础及科学依据。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 雄性 Wistar 大鼠 70 只,体质量
(200 ±20)g,清洁级,由新疆医科大学实验动物中心
提供,动物生产许可证号:SCXK(新)2011-0004,动物
使用许可证号为:SYXK(新)2011-0004。每日饲以普
通颗粒饲料,饮用清洁自来水。
1. 2 药物和试剂 榅桲叶(于 2011 年 10 月采集
自新疆喀什地区叶城县,阴干粉碎后备用)经新疆
医科大学药学院天然药物化学 /生药学教研室帕丽
达·阿不力孜教授鉴定为蔷薇科植物榅桲 Cydonia
oblonga Mill. 的干燥叶。卡托普利片(Captopril,
CAP),25 mg /片,山西津华晖星制药有限公司,批
号:100803;75%医用乙醇(伟业实验材料公司,批
号:11030801);注射用青霉素钠,规格 80 万单位 /支
(中诺药业有限公司,批号:101003017);戊巴比妥钠
(Solar Bio,批号:6900183);石油醚、乙酸乙酯、正丁
醇均为国产分析纯;总抗氧化能力(T-AOC)ELISA
检测试剂盒(批号:20120522)、谷胱甘肽-S 转移酶
(GSH-ST)ELISA检测试剂盒(批号:20120822)、超
氧化物歧化酶 (SOD)ELISA 检测试剂盒(批号:
20120617)、一氧化氮合成酶(NOS)ELISA 检测试
剂盒(批号:20120322)、丙二醛(MDA)ELISA 检测
试剂盒(批号:20120610)均购自美国 R&D公司。
1. 3 主要仪器 B-260 型恒温水浴锅(上海亚荣生
化仪器厂);AA520 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪
器厂);SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海亚荣生
化仪器厂);BP-6 型动物无创血压测试仪(成都泰盟
科技有限公司);U 型银夹(内径 0. 20 mm)上海奥
尔科特生物科技有限公司;LXJ-IIB型低速大容量多
管离心机(上海安亭科学仪器厂);Coda KM-00025-
00 型全自动酶标仪(法国 Bio-Rad 公司)。
2 方法
2. 1 受试样品的制备 榅桲叶用水洗净,55 ℃鼓
风干燥 48 h,冷却后粉碎,过 60 目筛,称取适量,分
别以 20 倍量 65%乙醇室温密闭浸泡 1 h 后回流提
·4002· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.12.041
取 3 次,合并滤液减压浓缩回收乙醇至浸膏状。加
适量水分散,依次用石油醚(60 ~ 90 ℃ )、乙酸乙
酯、正丁醇萃取,依次得到石油醚部位、乙酸乙酯部
位、正丁醇部位、水部位 4 个不同极性的提取部位。
减压浓缩各组分溶剂,挥干溶剂后冷冻干燥 24 h,备
用。给药前配成相当于生药 0. 1 g /mL的混悬液。
2. 2 2K1C肾性高血压大鼠模型的建立〔6,7〕 健康
Wistar 雄性大鼠若干,适应性饲养 1 w。大鼠用 1%
戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg /kg)后仰卧位固
定,腹部手术野备皮,消毒后于剑突下 1 ~ 2 cm处沿
腹中线剪开皮肤层和肌层,用镊子移开腹内组织,暴
露肾静脉。肾静脉上可见一分支通向肾上腺,此分
支和肾静脉形成一三角区域。在此区域暴露肾动
脉,小心地套上 U型银夹(内径为 0. 2 mm),最后分
层缝合手术切口。术后后肢肌肉注射青霉素 8 万单
位 /只,注射 3 d,以预防感染。术后动物清醒前注意
保温,清醒后置于干净笼内饲养。假手术组只分离
左肾动脉不套银夹。手术过程中不触及右侧肾脏。
2. 3 动物分组及给药 手术 4 w后测定血压,每次
测定 5 次取平均值,直至术后 6 w,以 SBP > 150 mm
Hg为筛选标准,连续 2 w 血压超过 150 mmHg 者进
入实验,低者剔除。术后 6 w 筛选出造模成功的 60
只大鼠按收缩压水平随机分为 6 组:肾性高血压模型
组、卡托普利组及榅桲叶提取物石油醚部位组、乙酸
乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组,另设假手术组
10只。术后第 6 周开始天灌胃给药,1 次 /d,连续给
药 8 w。榅桲叶提取各部位给药剂量为生药 2 g /kg;
卡托普利组给予卡托普利混悬液(25 mg /kg);假手术
组与模型组均灌胃等体积生理盐水。大鼠每周测 1
次体质量,根据体质量变化随时调整给药剂量。
2. 4 大鼠血压的测定 于给药前、给药后第 2、4、
6、8 周,把 6 组大鼠置于安静、干燥、通风的环境中,
用 BP-6 型大鼠无创血压测定仪测量血压的收缩压
(SBP)和舒张压(DBP)。给药后血压测定在末次给
药后 1 h开始进行。每次测 3 个值,取平均值做最
后的血压值。
2. 5 抗氧化指标测定 于末次给药 1 h 测定血压
之后,腹主动脉取血,分离血清,按试剂盒说明测定
谷胱甘肽-S-转移酶(GSH-ST)、总抗氧化能力(T-
AOC)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶
(SOD)及丙二醛(MDA)5 项指标的水平。
2. 6 统计学处理 所有数据均以 珋x ± s 表示,用
SPSS 17. 0 统计软件处理。多组样本均数的比较采
用 One-Way ANOVA 方法。经方差齐性检验后,方
差不齐的采用 Dunnett-t 检验;方差齐同的则采用
LSD-t检验。检验水准 α = 0. 05。
3 结果
3. 1 榅桲叶不同提取部位对肾性高血压大鼠收缩
压的影响 结果如表 1 所示,与假手术组比较,模型
组收缩压显著升高(P < 0. 05),提示肾性高血压大鼠
模型已建立;与模型组比较,卡托普利组、榅桲叶提取
物乙酸乙酯部位组收缩压显著降低(P <0. 05)。
3. 2 榅桲叶不同提取部位对肾性高血压大鼠舒张
压的影响 结果如表 2 所示,与假手术组比较,模型
组舒张压显著升高(P < 0. 05);与模型组比较,卡托
普利组、榅桲叶提取物乙酸乙酯部位组舒张压显著
降低(P < 0. 05)。
表 1 榅桲叶不同提取部位对肾性高血压大鼠收缩压的影响(mmHg,珔x ± s,n =10)
组别 给药前 第 2 周 第 4 周 第 6 周 第 8 周
假手术组 128. 6 ± 4. 5 126. 4 ± 6. 3 128. 9 ± 5. 2 129. 7 ± 3. 5 122. 4 ± 6. 5
模型组 177. 5 ± 3. 4* 176. 2 ± 5. 8* 179. 0 ± 6. 4* 177. 0 ± 7. 4* 178. 1 ± 6. 3*
卡托普利组 175. 8 ± 4. 3 166. 2 ± 4. 8# 165. 4 ± 5. 7# 160. 4 ± 4. 9# 159. 1 ± 6. 0#
榅桲叶提取物石油醚部位组 172. 3 ± 4. 8 173. 2 ± 4. 3 177. 0 ± 5. 7 174. 6 ± 6. 1 178. 2 ± 5. 9
榅桲叶提取物乙酸乙酯部位组 173. 6 ± 3. 8 172. 3 ± 5. 1 170. 8 ± 3. 1# 168. 5 ± 4. 6# 166. 2 ± 4. 1#
榅桲叶提取物正丁醇部位组 178. 4 ± 4. 9 175. 7 ± 5. 8 174. 3 ± 6. 0 174. 8 ± 4. 6 173. 5 ± 4. 4
榅桲叶提取物水部位组 176. 3 ± 6. 5 175. 9 ± 5. 2 174. 6 ± 6. 5 174. 9 ± 8. 5 175. 3 ± 4. 8
注:与假手术组比较,* P < 0. 05;与模型组比较,#P < 0. 05
表 2 榅桲叶不同提取部位对肾性高血压大鼠舒张压的影响(mmHg,珔x ± s,n =10)
组别 给药前 第 2 周 第 4 周 第 6 周 第 8 周
假手术组 87. 3 ± 7. 5 86. 1 ± 4. 2 88. 6 ± 6. 8 87. 1 ± 4. 5 86. 3 ± 5. 5
模型组 113. 5 ± 6. 4* 114. 4 ± 5. 9* 113. 5 ± 4. 4* 112. 5 ± 7. 3* 110. 8 ± 6. 6*
卡托普利组 114. 7 ± 5. 2 106. 2 ± 4. 5# 103. 8 ± 6. 3# 99. 7 ± 5. 7# 96. 6 ± 6. 4#
榅桲叶提取物石油醚部位组 112. 5 ± 6. 7 111. 2 ± 5. 2 114. 6 ± 3. 1 109. 7 ± 4. 7 110. 8 ± 6. 4
榅桲叶提取物乙酸乙酯部位组 112. 3 ± 5. 9 109. 0 ± 4. 2 105. 8 ± 5. 8# 104. 2 ± 6. 4# 102. 1 ± 5. 5#
榅桲叶提取物正丁醇部位组 113. 5 ± 3. 3 110. 8 ± 6. 9 109. 4 ± 7. 6 109. 3 ± 5. 7 106. 2 ± 4. 9
榅桲叶提取物水部位组 110. 2 ± 7. 5 109. 2 ± 6. 6 115. 4 ± 5. 5 111. 9 ± 8. 5 113. 4 ± 5. 6
注:与假手术组比较,* P < 0. 05;与模型组比较,#P < 0. 05
·5002·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
3. 3 榅桲叶不同提取部位对肾性高血压大鼠血清
T-AOC、GSH-ST、SOD、NOS 活性及 MDA 含量的影响
结果如表 3 所示,给药 8 w 后,与假手术组比较,
模型组大鼠血清 T-AOC、GSH-ST、SOD、NOS 活性均
显著降低(P < 0. 05),MDA 含量显著升高(P <
0. 05);与模型组比较,榅桲叶提取物乙酸乙酯、正丁
醇部位组 T-AOC活性显著升高(P <0. 05);榅桲叶提
取物各部位组 GSH-ST、NOS 活性均显著升高(P <
0. 05);榅桲叶提取物石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位
组 SOD活性显著升高(P < 0. 05),MDA 含量显著降
低(P <0. 05)。
表 3 榅桲叶不同提取部位对肾性高血压大鼠血清 T-AOC、GSH-ST、SOD、NOS活性及MDA含量的影响(珔x ± s,n =10)
组别 T-AOC /(U/mL)GSH-ST /(U/mL) SOD /(U/mL) NOS /(U/mL) MDA/(nmol /mL)
假手术组 10. 37 ± 1. 21 45. 77 ± 6. 27 209. 3 ± 22. 5 26. 27 ± 3. 26 8. 61 ± 2. 81
模型组 6. 81 ± 1. 93* 28. 24 ± 4. 42* 125. 8 ± 17. 3* 15. 79 ± 4. 37* 16. 32 ± 1. 49*
卡托普利组 7. 67 ± 1. 52# 30. 42 ± 5. 31 134. 6 ± 15. 7 16. 51 ± 2. 52 14. 82 ± 2. 30#
榅桲叶提取物石油醚部位组 7. 33 ± 1. 74 36. 85 ± 3. 17# 149. 7 ± 14. 7# 19. 62 ± 3. 14# 13. 13 ± 1. 87#
榅桲叶提取物乙酸乙酯部位组 8. 81 ± 2. 40# 37. 23 ± 5. 86# 178. 3 ± 16. 4# 22. 86 ± 4. 83# 12. 65 ± 1. 58#
榅桲叶提取物正丁醇部位组 8. 68 ± 1. 94# 39. 40 ± 3. 65# 162. 8 ± 15. 7# 22. 47 ± 2. 90# 10. 48 ± 2. 63#
榅桲叶提取物水部位组 7. 02 ± 2. 65 33. 61 ± 4. 59# 131. 9 ± 18. 5 17. 28 ± 2. 66# 15. 40 ± 1. 55
注:与假手术组比较,* P < 0. 05;与模型组比较,#P < 0. 05
4 讨论
肾性高血压是一种常见的继发性高血压,其主
要病因是肾动脉狭窄。由于肾血流量的减少,异常
激活 RAS,导致钠、水潴留,引起血压升高〔8〕。肾性
高血压大鼠是筛选降压药常用的动物模型之一,其
病理生理过程与人类高血压具有很多相似之处,对
降压药物的选择也与高血压病人相似,此外该模型
动物来源广泛、价格便宜、饲养容易、模型复制方法
简单、术后存活率高等特点,常用来评价抗高血压药
的药效。
本课题组前期研究结果表明,榅桲果和叶提取
物均具有一定的抗高血压作用,且作用程度相当,而
对同一药用部位而言,65%乙醇提取物的抗高血压
作用比水提取物显著,且榅桲叶和果提取物中主要
成份为黄酮类化合物,在叶中的含量高于果中的含
量〔9〕。榅桲果实可以直接食用,且在国外也常被用
来制作果汁、果酱等食品,而榅桲叶往往被抛弃,故
本研究选用榅桲叶作为其抗高血压作用的研究对
象,目的是充分利用榅桲叶,变废为宝,对榅桲叶
65%乙醇提取物用不同溶剂萃取得到不同极性部
位,结合药效学筛选确定其抗高血压作用的有效部
位。本实验结果显示,榅桲叶不同极性提取部位中,
乙酸乙酯部位表现出显著的降低两肾一夹肾性高血
压大鼠收缩压和舒张压的作用,提示榅桲叶抗高血
压有效部位是乙酸乙酯部位。
正常机体中,组织细胞的某些代谢环节能产生
氧自由基,氧自由基可以引发脂质过氧化作用。高
血压发展的某些病理过程与脂质过氧化损伤有关,
而脂质过氧化损伤与清除自由基的多种抗氧化酶类
活性降低有密切关系。谷胱甘肽-S-转移酶(GSH-
ST)是一组具有多种生理功能的蛋白质,主要存在
细胞液中,具有谷胱甘肽过氧化物酶活性,能防止脂
质的过氧化损伤。GSH-ST 与其他抗氧化酶在细胞
内共同起到清除活性氧,保护细胞免受氧化损伤的
作用。T-AOC 是衡量机体抗氧化系统功能状况的
综合性指标,可反映机体抗氧化酶系统和非酶促系
统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状
态。T-AOC主要通过消除自由基、活性氧及分解过
氧化物、阻断过氧化链,以免引发组织细胞脂质过氧
化。NOS是催化左旋精氨酸与分子氧生成 NO的关
键酶,同时也是 NO 生成的限速酶。NOS 可分为内
皮型(eNOS)、神经型(nNOs)和诱导型(iNOS)。NO
的释放增多可以防止缺血、缺氧,使血管扩张,显著
增加冠脉血流量,改善心肌的血液供应,提高心肌耐
缺氧能力。SOD是机体清除自由基的重要酶系统,
能清除超氧阴离子,而超氧阴离子是氧自由基的启
动自由基,还能降低脂质过氧化物(LPO)的生成,减
少自由基的形成。MDA是脂质过氧化的重要产物,
MDA的毒性作用在脂质过氧化中具有一定的代表
性。机体内 MDA的水平可反映机体脂质过氧化的
水平,也可以间接反映氧自由基生成和清除之间的
关系〔10-12〕。通过本实验研究发现,与模型组比较,
榅桲不同极性提取部位可不同程度地提高肾性高血
压大鼠 T-AOC、GSH-ST 和 SOD 水平,提高 NOS 活
性,并减少 MDA 的生成。提示榅桲提取物可能通
过增强机体抗氧化水平,降低脂质过氧化损伤,而发
挥抗高血压作用。但是本实验又提示榅桲的抗高血
压有效部位为乙酸乙酯部位,而石油醚部位、乙酸乙
·6002· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
酯部位、正丁醇部位和水部位均表现不同程度的抗
氧化作用。故笔者推测榅桲虽然具有一定提高机体
抗氧化水平的作用,但该作用并非榅桲发挥抗高血
压作用最主要的机制,仅起到一定的辅助作用,而抗
高血压最关键的作用靶点和作用机制究竟是怎样,
还有待进一步的研究。下一步研究应对该有效部位
进行化学成分的含量测定,确定其有效成分,并对最
佳提取分离工艺路线进行筛选,以期从榅桲叶中分
离得到一系列活性成分并确定其作用靶点及作用机
制,这对于探讨榅桲叶抗高血压活性的物质基础具
有重要意义,也为该植物的开发利用提供了研究基
础和科学依据。
参 考 文 献
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灵芝逆转 SGC7901 /ADR多药耐药性的活性部位研究
汤 燕,高巧慧,许文婷,吴 臻,李发荣*
(药用资源与天然药物化学教育部重点实验室 /西北濒危药材资源开发国家工程实验室 /陕西师范大学生命
科学学院,陕西 西安 710062)
摘要 目的:筛选灵芝逆转胃癌耐药细胞系 SGC7901 /ADR多药耐药性的活性部位并探讨其可能的作用机制。
方法:以药物对 Caco-2 细胞中 Rho-123 蓄积的影响为筛选模型,筛选灵芝具有肿瘤多药耐药逆转作用的潜在活性
部位;以 SGC7901 和 SGC7901 /ADR为细胞模型,检测了灵芝活性提取部位与化疗药物联用后,对 SGC7901 /ADR耐
药性的逆转效应;检测了灵芝活性提取部位处理后,耐药细胞 P-gp 的表达水平、mdr1 基因的表达变化及细胞内阿
霉素的蓄积变化。结果:灵芝乙酸乙酯部位和正丁醇部位能有效提高化疗药物阿霉素在 SGC7901 /ADR 细胞内的
蓄积,降低 mdr1 基因的转录,降低 P-gp的表达。结论:灵芝逆转胃癌耐药细胞 SGC7901 /ADR的多药耐药性的活性
部位是乙酸乙酯部位和正丁醇部位,其逆转作用与抑制 P-gp的表达相关。
关键词 灵芝;SGC7901 /ADR细胞系;多药耐药;P-糖蛋白
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)12-2007-04
收稿日期:2013-07-09
基金项目:陕西省自然科学基金(2012JM4010);中央高校基本科研费项目(GK261001001)
作者简介:汤燕(1988-),女,在读硕士研究生,专业方向:生物化学与分子生物学;Tel:13022886772,E-mail:13022886772@ 163. com。
* 通讯作者:李发荣,Tel:13772053415,E-mail:lifarong@ snnu. edu. cn。
肿瘤细胞的多药耐药(Multidrug Resistance,
MDR)是指肿瘤细胞对一种抗癌药物产生耐药的同
时,会对其他结构不同、作用机制不一样的抗癌药物
产生交叉耐药的现象〔1〕。肿瘤的多药耐药性是化
·7002·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月