全 文 ：紫穗槐根瘤菌的分离与回接鉴定
陈利云 , 张海林
(天水师范学院生命科学与化学学院 ,甘肃天水　 741000)
摘　要　采用 YMA培养基对新鲜的紫穗槐(AmorphafruticosaL.)根瘤提取物进行根瘤菌的分离培养 ,获得的
菌落为圆形乳白色 , 表面凸起 ,直径 0.4 ～ 0.5 cm,革兰反应阴性 ,显微观察显示为短杆状 ,分离菌株回接原宿
主植物 , 同时接种于经 60 ℃ 15 min水浴加热处理的紫穗槐种子 , 蛭石盆栽实验显示 , 接种此菌的紫穗槐植株
都有结瘤 , 并与对照在结瘤数 、瘤重 、植株鲜重与干重间都有显著差异 , 实验证明所分离的菌株均为紫穗槐根
瘤菌。
关键词　紫穗槐;根瘤菌;培养分离;接种
中图分类号　Q93-331　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2010)04-0013-04
IsolationandBackInoculationCharacterizationofRhizobiafrom
ShrubbyFalseindigo(Amorphafruticosa)
CHENLi-yun, ZHANGHai-lin
(Sch.ofLifeSci.＆Chem., TianshuiNormalUni., Tianshui, Gansu741000)
Abstract　ExtractofAmorphafruticosa(Af)freshnoduleswereisolatedandcultivatedonYMAmediumtocarryout
rhizobiaisolation.TheisolatedorganismswereGram-negativeshortrod.Theobtainedcoloniesonthemediumwas
roundandcreamy-whitehavingraisedsurface, 0.4 ～ 0.5 cmindiameter.Theisolatedstrainswereinoculatedback
ontothehostplantandAfseedsthatwastreatedin60 ℃waterbathfor15min.Theresultsofexperimentinvermicu-
liteflowerpotshowedthattheisolatedstrainswererhizobiaofAf.Alplantsthathadinoculatedwerenodulated.There
wereobviousdiferencesinquantityandweightofnodule, freshanddriedbetweentreatmentandcontrol;theexperi-
mentshadprovedthattheisolatedstrainswererhizobiaofAf.
Keywords　Amorphafruticosa;rhizobia;isolationandculture;inoculation
　　紫穗槐(AmorphafruticosaL.)属豆科(Legu-
minosae)蝶形花亚科(Papilionaceae)多年生落叶
灌木 ,全世界约 25种 ,原产北美 , 20世纪 20年代
引入我国 ,至今已有 80多年的栽培历史。它具有
很强的适应性与抗逆性 ,生长快且根系发达 ,能与
根瘤菌形成共生固氮体系固定大气中的 N2 ,为自
身生长和土壤环境提供大量氮素营养 ,是退化土
地恢复中良好的先锋树种 [ 1-2] ,对西北干旱地区受
损生态系统的治理具有极大的应用前景 [ 3] 。 20
世纪 70年代在我国曾有大面积种植 ,但一度又大
范围减少 ,近年来随着生态保护意识的加强和科
学技术的发展 ,紫穗槐的研究又被再度重视 ,主要
集中在防风固沙树种的种植 、种子药用成分的提
取 、饲料绿肥和造纸编织等加工方面 ,并取得了显
著的成效 ,对分离菌种的鉴定也主要集中在生理
生化方面 ,回接原宿主植物检验其结瘤与否也是
菌种鉴定的常用方法 [ 4] ,但由于种子内生根瘤菌
的大量存在 ,故以回接作为菌种鉴定的必须方法
还有待商榷。因此 , 寻找一种经济且准确的菌
种鉴定方法 ,以便甄别培养分离的紫穗槐根瘤提
　基金项目:国家科技支撑计划(2007BAD89B17)
　作者简介:陈利云　女 ,讲师 ,硕士。主要从事生物固氮的研究。 E-mail:chenliy06@sina.com
　收稿日期:2010-03-11;修回日期:2010-07-16
13微生物学杂志　 2010年 7月第 30卷 第 4期　JOURNALOFMICROBIOLOGYJuly2010 Vol.30No.4
取物 ,对紫穗槐根瘤菌接种菌剂的研制与其固氮
作用的进一步深入研究具有重要的意义。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　采样地概况　甘肃省天水市(东径 105°
41′,北纬 34°14′),海拔 1 085 ～ 1 100 m,年均日
照 2 010 h,年均气温 11 ℃,年均降水量 660 mm,
年均蒸发量 952mm,无霜期 180 d,土壤类型为黄
棕壤 ,属大陆性温带半湿润型气候。
1.1.2　采样　于 2008年 6月紫穗槐初花期在甘
肃天水采样 ,选择不同干旱环境中紫穗槐随机采
样 ,取红褐色饱满的根瘤装入自封袋内编号标记
带回实验室入 4℃冰箱待用 。
1.2　方法
1.2.1　菌种分离纯化　选表面红褐色饱满的根
瘤置入已灭过菌的培养皿中 ,用 95%酒精浸泡 5
min,转入 0.1%的砷汞溶液中 1 min,再用无菌水
清洗至少 6次 ,洗去表面残留的消毒液 ,用无菌刀
片将根瘤切口 ,压碎使浆液流出 ,加少许无菌水 ,
取 1环菌液 , 在 YMA(酵母粉甘露醇培养基:
K2HPO4 0.5 g/L, 酵母粉 1 g/L, MgSO4 · 7H2O
0.2g/L,甘露醇 10 g/L, NaCl0.1 g/L,琼脂 15
g/L,蒸馏水 1 000mL)平板上划线 , 28 ℃培养分
离 ,单菌落纯化培养 ,进行革兰染色 ,镜检无杂菌
时继续进行转接纯化 ,纯化后的菌种 4 ℃保存
备用。
1.2.2　蛭石灭菌　取适量的紫穗槐种子先用
95%乙醇处理 5 min, 再用 0.1%砷汞处理 5
min,无菌水冲洗 7 ～ 8次后 , 40 ℃无菌水浸种
24 h后分 2份 , 1份置水浴 60℃加热 15min,以
去除种子内生根瘤菌 (本实验室前期试验结果
证明此温度与时间处理可去除种子内生根瘤菌
且种子萌发率达 86.25%);另 1份种子不做加
热处理 ,置入有无菌纱布和无菌水的灭菌培养
皿中 , 26 ℃催芽 ,待幼根长至 2 cm左右接种 。
蛭石包入牛皮纸中扎好高压灭菌 (121 ℃)3 h
备用 。
1.2.3　接种与培养　将备用的菌种活化后接于
YMA液体培养基(培养基内无琼脂), 28 ℃震荡
培养 7 d后测定菌液的 OD值(λ=600 nm),用
镊子将发芽的 A、B(A表示水浴 60℃加热 15min
处理的种子 , B表示未做加热处理的种子)种子置
培养皿中用菌液浸泡 15 min,然后栽植于 10 cm
×13 cm的盆中 ,每盆栽植 5株 ,吸取菌液接种于
种子周围 ,以不接种为对照(ACK, BCK),每处理设
5个重复 。培养温室温度为 (22 ±3)℃、光强
7 000 ～ 8 000lx、光照时间 12 h,根据盆中失水情
况适时加入 , 25 d后间苗 ,每盆留 3株苗。
1.2.4　测定方法　盆栽温室培养至 65天时开始
观测结果 ,测定项目包括每盆(3株苗)总瘤数 ,有
效瘤重(根瘤饱满且表面呈红褐色),株高(从子
叶痕处至离生长点最近的展开叶顶端)、鲜重(在
收获时称重),干重(先在烘箱中 120 ℃杀青 40
min,然后在 60 ℃烘干 48 h, 称重)[ 5] 。
1.2.5　数据处理　采用 SPSS11.5软件进行统计
分析 ,均值显著性检验采用单因素方差(AVONA)
检验分析。
2　结　果
2.1　根瘤及根瘤菌的形态特征
紫穗槐根瘤主要存在于土层 10cm以上的侧
根上 ,除了多数为棒状外还有球状和 Y状 ,新鲜
的根瘤表面红褐色 。一般直径为 0.2 ～ 0.4 cm,
根瘤横切面外缘部分呈淡红色 ,内缘红褐色较根
瘤表面颜色浅 。根瘤提取物在 YMA培养基上 7
d可形成直径 0.4 ～ 0.5 cm的圆形菌落 ,在刚果
红 YMA培养基上不吸色 ,乳白色表面凸起光滑 ,
边缘整齐 ,属于中慢生型根瘤菌 ,见图 1。光学显
微镜观察为短杆状的革兰阴性菌。紫穗槐根瘤数
目的多少与植株所在的环境有关 ,水肥良好的土
壤环境 ,根瘤数目多 ,个体大且饱满 。干旱贫瘠的
土壤中 ,根瘤数目少 ,形状多样大小不一 ,且表面
灰白色中空的无效根瘤增多。
2.2　水浴处理 60 ℃ 15 min对紫穗槐种子发芽
率 、休眠率和死亡率的影响
紫穗槐种子经适宜温度时间水浴加热处理
后 ,不仅不会影响种子正常萌发 ,还会打破其休
眠 ,增加种子萌发率 ,这是生产中常用的破除豆科
种子休眠方法。 60℃ 15 min水浴处理后无菌检
测显示已除去其内生根瘤菌(见表 1),种子发芽
率为 88.35%,与对照间无显著差异 ,而休眠率减
14 　　　　　　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　30卷
少为 3.02%,与对照间有显著差异 ,但种子死亡 率增加 ,与前期实验结果一致。
图 1　根瘤及根瘤菌的外部形态
Fig.1　TheExternalMorphologyofNodulesandRhizobia
Ⅰ :新鲜根瘤;Ⅱ:根瘤横切面;Ⅲ:YMA培养基上单菌落;Ⅳ:YMA刚果红培养基上单菌落
Ⅰ :freshnodules;Ⅱ:noduletransversesection;Ⅲ:singlecolonyonYMAmedium;Ⅳ:singlecolonyonYMAmediumCongo-red
表 1　60 ℃ 15 min水浴处理对紫穗槐种子
发芽率 、休眠率和死亡率的影响
Table1　Effectsof60℃ and15mintreatmentsonpercentagesof
germination, dormantanddeadseedinAmorphafruticosaL.
种子 处理 发芽率 / % 休眠率 / % 死亡率 / %
ACK 未加热 90.76a 9.24a 0
BCK 60℃ 15min 88.35a 3.02b 8.63a
　注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。字母 “A”表示未
进行水浴加热处理的紫穗槐种子接种 , “ACK”表示 A种子未接种
对照 , “B”表示 60 ℃ 15min水浴加热处理的紫穗槐接种种子 ,
“BCK”表示 B种子未接种对照 ,下同
表 2　接种菌对紫穗槐(A、B植株)结瘤与生长的影响
Table2　EfectedNodulationandGrowthofAmorpha
fruticosa(AandBplants)afterinoculatedstrains
处理 结瘤数 鲜瘤重 株高 鲜重 干重
/(个·株 -1)/(g·株 -1) /cm /(g·株 -1)/(g·株 -1)
ACK 3.52b 0.012b 10.32a 0.069 1b 0.033b
A 8.47a 0.031a 11.57a 0.084a 0.045a
BCK 0 0 7.42b 0.053c 0.024c
B 4.37b 0.027a 10.86a 0.071a 0.038a
2.3　接种菌对紫穗槐植株生长的影响
盆栽试验中 A植株接种与对照除株高外在
结瘤数 、鲜瘤重 、植株鲜重和干重间都具有显著差
异 , BCK植株温室盆栽 65 d检测无结瘤现象(与
本实验室前期试验结果一致),接种后 B植株出
现了结瘤现象 ,并与对照在株高 、植株鲜重与干重
间具显著差异 ,见表 2。ACK、A与 B植株的结瘤数
间有显著差异 ,而三者在株高上并无显著差异 ,
A、B植株鲜重及干重间都无显著差 ,但与 ACK、
BCK间有显著差异 。
3　讨　论
根瘤菌是存在于豆科植物各组织器官中的一
种内生细菌 ,不仅能与宿主植物形成共生固氮体
系固定大气中的 N2 ,为植物自身生长和土壤环境
提供大量氮素营养 ,同时还能促进植株快速生长 ,
提高其抗逆性 、抗病害等能力 [ 6] ,根瘤菌主要存
在于成熟种子的种皮内 ,在子叶和胚中也有少量
的分布 [ 7] 。紫穗槐是一种豆科灌木 ,其种子内存
在的大量根瘤菌 ,能加快植株的生长繁殖 、增强其
适应性和抗逆性 ,对充分发挥紫穗槐防风固沙的
作用有重要的意义。根瘤菌的分离 ,可从土壤 、种
子和新鲜根瘤中获得 ,根据实验研究的不同目的
选择不同的分离方法 。分离所得菌种的鉴定一般
采用回接宿主植物的方法[ 8] 。大多数根瘤菌对
高温比较敏感 ,紫穗槐根瘤菌耐 60 ℃高温和 4 ～
10℃低温的能力均强于刺槐根瘤菌 [ 9] ,它对温度
的抗性主要受宿主植物的影响 ,在一定程度上还
受海拔高度和土壤类型的影响 [ 10] ,紫穗槐根瘤菌
在高温处理下是否成活要在一定的时间限定下 ,
154期　　　　　　　　　　　　　　　陈利云等:紫穗槐根瘤菌的分离与回接鉴定　　　　　　　　　
本实验采用新鲜根瘤分离紫穗槐根瘤菌 ,回接经
60 ℃ 15 min水浴加热处理后紫穗槐种子 ,对紫
穗槐根瘤菌的分离与鉴定提供了可靠科学的研究
方法。
参考文献:
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