全 文 ：华中农业大学学报 1 3 (魂) :5 3 2 ~331, 1 9 9魂
J o “ r 砚 a 1 of H
u a 之 h o 犯夕 A g , : e “ I t “ r a l 王厂二 i : ,户 ,战 t犷
紫云英根瘤菌天然抗药性和质粒研究 `
邹向宏 曹燕珍 李阜棣
( 华中农业大学微生物科 学技术 系 ,武汉 4 3 0 0 7 0)
摘要 从同 一稻田的紫云英根瘤 l飞共分离到 1 5动株紫云英根瘤菌 。 将来自该田块 10 株
紫云 英的 10 株根瘤菌列为分析组 A ; 来自同一植株不同根瘤的 40 株根瘤菌列为分析组 B ;
来 自植株两个根瘤的 4] 株根瘤菌列 为分析组 c 。 对所有菌株 10 种抗生素的抗药性测定表
明 , 分析组 A 分为 39 个不同抗药类群 ;分析组 B 分为 2 个抗药类群 。 同一根瘤的分离株其
抗药性也存在差异 。 质粒检测显示所有菌株都含有质粒 , 质粒数为 1一 5 条 ; 质粒分子量主要
在 83 M D 至 60 0 M D 。 质粒图谱分析表明 , 分析组 A 分为 8个质粒型 ,分析组 B 分为 6 个质粒
型 , 同 一根瘤分离株的质粒数并不完全 一致 。 在所有分离株中 , 第 2 质粒型的菌株为优势菌
群 。
关键词 紫云英 ; 根瘤菌 ; 质粒 ; 固有抗药性
中图法分类号 Q 9 3 . 3 31
种是细菌分类的基本单位 , 各种细 菌均以群体 ( p o p ul at i on )状态存在于 自然界中 , 每
种细菌的群体并不是由遗传型和表现型完全相同的个体细 胞组成 , 而是呈现多样性 ( id -
ve r s it y )
。 如各种根瘤菌都可分为一些不同的血清型仁’ 」。 分子生物学技术及其它新的研究
方法的发展大大地推动了根瘤菌种内群体多样性 的研究 。 近几年来 ,全细胞蛋 白电泳 , 同
工酶酶谱分析 , 质粒检测限制性酶切技术 , D N A 杂交技术等 2j[ , 广泛应用于多种根瘤菌群
体的研 究 ,揭示了根瘤菌群体丰富多样的特征 , 各特征之间的关系复杂闭 。 通过对根 瘤菌
群体的多样性分析 ,我们能掌握群体的遗传结构和变化规律 , 了解产生新的基因型变化过
程 ,为生物进化研究提供原始材料川 。 本文以紫云英根瘤菌 ( R h ` : 。 b 。。 m h 。 。 k 。 : : ) 为材料 ,
设计系统的根瘤菌分析群 : ①同一田间不同植株根瘤上的分离株 ; ②同一植株不同根瘤的
分离株 ;③来 自同一根瘤的多个分离菌株 。 研究分离菌株的天然抗药性和质粒型 , 以揭示
紫云英根瘤菌的多样性 。
1 材料和方法
1
.
1 实验菌株的来源
从华中农业大学农场一块多年种植紫云英的水稻 田中 , 对 角线 5点采样 , 选出 10 株
本文 19 9 3一 1 1一 2 7 收到
* 高校博士点基金资助课题
第 一作者 : 邹向宏 , 男 , 1 9 6 7 年生 ,博士 . 工作单位 : 华中农业大学微生物科学 技术系 , 武汉 4 3 0 0 7 0
326 华中农业大学学报 第 13卷
结瘤的紫云英 ;同时在该 田块采集多株紫云英 ,洗净根系后 ,从中选出 1 株结瘤数较多的
植株 。
1
.
2 根瘤菌的分离与纯化
将所选的根瘤放入培养皿中 , 先用 95 % 乙醇浸泡 5一 1 0 5 ,换用 0 . 1% H g cl Z 表 面灭
菌 5 m in , 然后 用无菌水洗涤 7 ~ 8 次 ,在灭菌的血清管中加 1滴水 , 放入 1 个表面灭菌的
根瘤 ,经灭菌的玻棒压碎后 , 用接种环取压碎汁在 Y M A 平板培养基上划线接种 ,在 28 ℃
条件下培养 。 待长出菌落 , 取单菌落转 Y M A 斜面 , 同时制片 、 革兰氏染色和镜检 , 淘汰不
纯菌株 。
1
.
3 回接试验
选取优 良的紫云英种子 , 常规表面灭 菌后催 芽 Z d ,播种 J e sn e n 半固体培养基试管
中 , 放光照室内培养 (光照 12 h ,光强度 7 0 0 0 lx ,温度 20 ℃左右 ) ,待长出第 1 片真 叶后播
种于 0 . 5 m l 菌悬液 (约 1 05 个 · m l一 ’ ) ,继续光照培养 ,连续 6 周 内观察现瘤与否 ,确定纯
化的结瘤菌株 。
1
.
4 根瘤菌分析群设计
设计 3 个不同的分析类群 ,设计方案见表 1 。
飞. 5 根瘤菌天然抗药性测定
将溶化的 Y M A 培养基冷却至 50 ℃ ,定量加入新配制抗生素 ,混合均匀迅速制成平
板 ,各抗生素的使用浓度分别为 ( 。 g · m l 一 ’ ) : 庆大毒素 ( G e n) Z o , 卡那霉素 ( K a m ) 2 0 ,壮观
霉 素 ( s p e ) 1 0 , 青霉素 ( p e n ) 峨0 , 红霉素 ( E r y ) 2 0 ,氯霉素 ( e h 一) 1 0 , 链霉素 ( s t r ) 2 0 ,利福平
( iR f ) 5
, 四环素 ( T e t ) 1 0 ,蔡定酮酸 ( N al ) 20 , 将各菌株制成菌悬液 ,用多头接种器接种 , 每
个处理 5 次重复 。 28 ℃下培养 , 10 d 后观察结果 。
1
.
6 质粒的检测
参考 E 。 h h ar d sj[ 的质粒快速检测方法进行 。
2 实验结果
2
.
1 所获紫云英根瘤菌实验菌株
共得到 1 54 株紫云英根瘤菌 (表 1 ) 。
T a b l e
衰 1 从样本植株根 , 上所分离的萦云英根右 ,
R人亩别角 11. 冷 . 人 .翻山场云 i. o l . t e d f r o m t h e n do u l“ o n t h e 一口 P l e P I一。 .
分析类群
G r o u P
菌株数 菌株来源
N o
.
o f i s o l a t e s S o u r s e o f i s o l a t e s
分析组 A
G r u o P A
1 0株植株 , 1 株取 10 瘤 , 1 瘤 1 菌
10 h o s t p l a n t s
, 1 0 n o d u l e s fr o m e a e h p l a n t
, i s o l a t e f r o m e a e h n o d U l
e
分析组 B
G r o u P B
株植物 , 1 瘤 l 菌
A 一 15 0 一a t e s fr o m 4 0 n o d u l e s o n o n e p l a n t , 1 15 0 一a r e f r o m e a e h n o d u l e
分析组 C
G r o u P C
1 株植物取 2 个瘤 , 1 瘤 7 菌
A 11 is o l a t e s f r o m 2 n od
u le s o n o n e P l a n t , i s o l a t e S 斤 o m e a C h n o d u l e
第 4 期 邹向宏等: 紫云英根瘤菌天然抗药性和质粒研究 32 7
2
.
2 紫云英根瘤菌天然抗药性的多样性
对供试菌株采用了 0 1种抗生素 ,测定其天然抗性 ,结果表明菌群抗药性差别较大 ,所
供试的 1 54 个菌株可分为 51 个抗药类群 (表 2) 。
来 自不同植株的 A 组菌群可分为 39 个抗药类群 ,其 中第 4 、 1 1 、 2 0 、 2 7抗药类群菌数
较 多 ,来自同一植株的 B 组菌群可分为 2 个抗药类群 ,其 中第 4 和 24 抗药类群菌数量占
优势 。 对所有分离株而言 , 第 4 和 27 抗药类群为优势菌群 。
实验进一步表明 , 即使来 自同一根瘤的分离菌株其抗药性存在差异 。如来 自同一根瘤
5
3一 2 的 菌株 5 3 一 1 0 9 7 与其它菌株不一致 ,对利福平 ( R i f ) 敏感 ; 而 5 3 一 10 9 2 、 5 3 一 1 0 9 5 对氯霉
素 ( c h l) 敏感 ,其它分离菌株对氯霉素具有抗性 。
表 2 紫云英根泊菌天然抗药性类群 ”
T a b l e 2 I n s . r l n t l c 一 n咤i b i o t l e r ” i . t一 n e e p一 t t e r n s Of R h 谊以角谊咖 H比上该城l )
类群
G r o u P G e n S P e K a n
抗生素 ^ n t i b i o t i e s 菌株数 N o . o f is o l a t e s
P e n E r y C h l S t r T e r R i f N a 】 ^ 组 G r o u p ^ B 组 G r o u p B
+十
+一
+
+1 l
l 2
+
十+
+
l 3
1 4
+
+十l 5
] 6
l 7
l 8
l 9
2 0
328 华中农业大学学报 第 13卷
续表2
类群
Gr o uP Gn e
抗生 素 Ant b i i or se s菌株数 N o. of 55 0一 at e s
SP e Kn aP n e Er yl h C 5t fT et R if N sl A组 Gr o up B A组 0r o up B
n U自月. 11
工n勺乙. 1
+一 +
QJ八 11
002 113
十 +
+
+一
+十
+十一
+十一
+
l 仃乙 9曰J翎ù aōb 门 OCQ 0n乙 9一 qgó QOù勺é od
门n曰
`
1CUQ
+十十 +
0n
+
+
十 +
+
+十 +十l 乃ó勺d 悦月 5产 Cǎt OJ门八乃 OJ qU,门njO’ ]勺dJ翎
+十
+
nU曰月..
+
+十
+
+
十+十+
+
++
+
+十+十
+ + + + + +
lqú刁J,-匕ù卜é一了OQó八曰1Jq服几通j `l场汤`门月性门ū匀l勺
l) + 表示具有抗药性一 表示对抗生素敏感 l ) + i n d 一e a t sn g r e s ss t a n e e , 一 i n d i e a t盆n g s e n s j t i v i [ y
2
.
3 紫云英根瘤菌质粒型
菌株质粒检测结果表 明 ,紫云英根瘤菌的质粒数及大小存在较大差异 。 质粒数为 1一
3 2 8华中农业大学学报 第3 1 卷
续表 2
类群
G ro u PG e n
抗生 素 A n ti bi o rs s e菌株数 No .o f55 0一 a ts e
S PeK a n Pe nE ry C h l5 t f Te t Ri f Ns lA组 G ro u pA B组 0o u r p B
U n自月 .11
工 n勺乙1 .
+一 +
Q J八11
001 213
十 +
+
+一
+十
+十一
+十一
+
l仃乙 9曰 J翎ù aō b门OCQ 0n乙 9一 qgóQOù勺éo d
门 n曰
`
1CQ U
+十十 +
0n
+
+
十 +
+
+十 +十 l乃ó勺 d悦月5产Cǎ tO J门八乃O J qU,门njO’ ]勺dJ翎
+十
+
nU曰月..
+
+十
+
+
十+十+
+
++
+
+十+十
+ + + + + +
lqú刁J,-匕ù卜é一了OQó八曰1Jq服几通j `l场汤`门月性门ū匀l勺
l) + 表示具有抗药性一 表示对抗生素敏感 l ) + i n d 一e a t sn g r e s ss t a n e e , 一 i n d i e a t盆n g s e n s j t i v i [ y
2
.
3 紫云英根瘤菌质粒型
菌株质粒检测结果表 明 ,紫云英根瘤菌的质粒数及大小存在较大差异 。 质粒数为 1一
0 3 3华中农业大学学报 第 13卷
示根瘤菌结瘤行为 以及植株对根瘤菌遗传因素的影响 。
本实验表明 , 无论是来 自不同植株的菌株还是来 自同一植株的菌株 ,它们的抗药类群
非常广泛 ,甚至同一根瘤的分离株其抗药性也不完全相同 。 由于各类抗生素作用位点不
同 ; 同时菌体抵抗各类抗生素机理复杂 , 菌株的遗传背景及生理状态不同 , 所显示 出的抗
药类群也会不同 。
根瘤菌在 自然条件下通过长期的遗传变异形成复杂 的群体 。 无论是同一土壤的根瘤
菌 ,还是来自同一植株根瘤的菌株 , 它们的遗传及生物学特征丰富多样 ,甚至同一根瘤的
分离菌株也存在差异 。 深入考查群体特征及其相互关系 ,不仅能充实理论研究的内容 ,而
且对选育优 良菌株及其应用具有指导意义 。 许多研究者发现人们采用的高效 固氮根瘤菌
应用于生产实际 ,往往并不能显示增产效果 [’, ’ 。〕 , 表明接种的根瘤菌的竞争能力低于土著
根瘤菌 。 事实上 ,在土壤中土著根瘤菌与宿主间形成了密切的关系 , 并且通过长期的自然
选择在特殊的生态环境形成 了具有某些特征的优势菌群 。要选育优良的菌株 ,除考虑自身
的固氮能力外 , 还需要考虑菌株的生态背景 。 首先应分析菌株群体特征 , 找出各特征的优
势群 ,综合各优势特征 ,从中筛选竞争力强 (如具广谱抗药性 、 感染力强 、 结瘤早 、 生长速度
快等 ) , 固氮效率高的菌株 ,直接或加以遗传工程改造应用于生产实际 。
参 考 文 献
1 M e a n s U M
,
J o h n s o n H W
·
Q
u i c k s e r o l o g i c a l m e t h o d o f c las
s i fy `n g s t r a i n s o f R · J a 尹。砚 番门m · J B a e t e r i o l · 1 9 6 4 .
5 7
:
5 4 7 ~ 5 5 3
2 P e P P e r L L
,
J o s e P h s o n D P
.
S t r a i n 盛d e n t i f i c a t io n o f h i s h l y 一 c o m P e t i v e b e a n r h i z o b i a is o l a t e d 斤 o m r o o t n o d u l e s : u s e
o f n a o r e s e e n t a n t i b i o t i e s
,
P l a s m i d P r o f i l e s a n d s e n e P r o b e s
.
B i o B i o e h e m
,
1 9 8 9
.
2 1 : 7 4 9 ~ 7 5 3
3 T h u r m a n N P
,
L e w i s D M
,
J o h 月e D G · T h e r e l a t i o n s h i P o f p Ias m j d n u m b e r t o g r o w t h
,
a e i d t o l e r a n e e a n d s y m b i -
o t一e e f f i e i e n e y i n i s o l a t e s o f R h 名之 o b多u 协 t 尸汀 0 1 1卜 J G e n M i e r o b io l . 1 9 8 5 . 58 : l ~ 6
4 o v 一d ^ H . o e n e t i e o f b a e r e r ia 一d i v e r s i t y . In 2 0 : N e w t o n W E e d s . T h e p o p u l a t i o n G e n e t ie s o f B a e r e r i a . u n i v e r s i t y
P a r k P r e s s
.
19 8 9
.
4 1 7~ 4 3 9
5 E e h h a r d t T
.
A r a P i d m e t h o d f o r r h e i d e n t i f i e a t io n o f P l a s m id d e o x y r i b o n u l e i e a e i d i n b a e t e r i a
.
P l a s m i d
.
l 9 7 8
,
( l ) :
5 8 4~ 5 8 8
6 H
e r o n D S
,
P u r P P k e S G
.
M o d e o f i n f e e r io n n o d u l a t i o n s P e e l f i t y a n d i n d i g e r o u s P l a s m . d s o f a l l f a s t
一s r o w i n g R
.
, a 声。介 乞 e . 饥 5 t r a i n . J B a e t e r ia . 19 8 4 , 1 6 0 : 1 0 6 1~ 1 0 6 6
7 M a s t e r o n R V
,
P r a k a s h P K
.
A r h e r Iy A G
.
C o n s e r v a t i o n o f s y m b io t i e n i t r o g e n f l x a t j o n g e n e s e q u e n e e s l n R
.
7 a 尸。 刀 洛e u 仍 a n d B 尸a d 歹 R h t 之o b乞“ m 少口声。 ” 落e u 扭 · J B a e t e r i o l , 19 8 5 , 1 6 3 : 2 1一 2 6
8 D Jo r d j t v i e M A
.
l u r k o w s k i W
.
S h i n e J
·
S y m P I a s m id t r a n f e r r o v a r i o u s s y m b io r i e m u t a n r s o f R h 乙之 o b z u 爪 t r 落f o l z i . J
B a e t e r i a l
.
1 9 8 3
,
1 5 6
: 1 0 3 5 ~ 10 4 5
9 J o h n s r o n A W B H
o w b r e e h e r G
.
c o o p e r M C
.
T w o r r a n s m i s s i b Ie 一P la s m i d s i n R h
艺之 o b 急“ m l户夕u 仍 之砚 。 胡尹 . 仍 s t r a i n
3 0 0
.
J G e n M i e r o b i o l
.
1 9 8 2
.
1 28
:
8 5 ~ 9 3
1 0 D o w l sn s D N
.
B r o u s h t o n W J
.
c o m P
e t i t i o n f o r n o d u l a r i o n o f l e s u m
e s
.
A n n e R e v M i
e r o b i o l
.
19 8 6
.
4 0
: 1 3 1 ~ 1 5 7
第 4期 邹向宏等 :紫云英根瘤菌天然抗药性和质粒研究
S TU DY O N
S I O LA TE D
IA RA N D P LAS MI D PA T TE R NS O F R HI ZO I BA
F RO M NO DUS E LO FAS T RAG A LUS S I NC I US
Zu o Xi a ng ho ngC a o Y a n z he n
( H
u a z ho 。 夕A 夕; `u c l tu ra l l厂 n z, , e 尹乳 t歹
L 1 F u d i
环 u h a n 4 3 0 0 7 0 )
A B S T R A C T I n t h e P r e s e n t s t u d y w e a d o P t e d a s y s t e m a t ie i s o l a t io n a P P r o a e h t o
o b t a in s r r a i n s b y i s o l a t i n g r h i z o b i a f r o m e v e r y n o d u l e o n t h e s a m P l e P l a n t s
.
o u t o f 1 5 4
5 t r a i n s s t u d i e d
,
1 0 0 w e r e f r o m 1 0 P la n t s e o l le e t e d i n t h e s a m e f i e ld ( d e s ig n a t e d a s g r o u P
A )
,
4 0 w e r e f r o m t h e s a m e s i n g l e P l a n r ( g r o u P B )
, a n d 1 4 w e r e f r o m 2 n o d u l e s o n o n e
p la n t ( g r o
u
P C )
,
I n t r i n s i e a n t i b i o r i e r e s i s t a n e e ( I A R ) o f a l l s t r a i n s w
e r e t e s t e d w i r h 1 0
a n t i b io t e s a n d t h e y e o u l d b
e e la s s i f i
e
d i n t o 5 1 IA R e l u s t e r s
.
G r o u p A s t r a i n s h a d 3 9 I A R
e l u s t e r s
, a n d g r o u P B h a d 2 2 IA R e l u s t e r s ; T h e s t r a i n s f r o m t h e s a m e n o d u le a ls o
s h o w e d s o m e d i f f e r e n e e i n I A R
.
T h e p l a s m i d P r o f i l e s o f 15 4 s t r a i n s w e r e e x a m i n e d b y
u s j n g a m o d i f i e d e e k h a r d p r o e e d u r e o f P l a s m i d v i s u a l i z a t i o n
.
T h e P l a s m i d n u m b e r o f
5 t r a i n s v a r ie d f r o m 1 t o s
, a n d t h
e i r m o le e u l a r w e i g h t s w e r e e s t im a t e d t o b e m a i n l y 3 5
r o 6 0 0 M D o r m o r
e i n e o m P a r i s o n w i t h t h e P l a s m i d s o f s t r a i n U S D A Zo s a s r e f e r e n e e
.
T h e r e w e r e 8 d i f f e r e n t P l a s m i d P a t t e r n s i n t h e g r o u P A s t r a i n s a n d 6 d i f f e r e n t p l a s m i d
P a t t
e r n s i n g r o u P B
.
T h e S t r a i n s e v e n f r o m t h e s a m e n o d u le s h o w e d s o m e d i f f e r e n e e i n
P l a s m i d e o n t e n t
·
K E Y W O R D S A st
子 a g a l u s is n 之c u s ; R h 乙之 o b乙u 矶 ; P l a s m i d ; IA R