全 文 ：文章编号:1001-4829(2010)06-1917-06
　　收稿日期:2010-04-09
　　基金项目:国家自然科学基金地区联合资助项目(30860163,
2008GAO28)
作者简介:王　玉(1982-),女 ,山东人 ,硕士研究生 ,主要从事
植物病毒学方面的研究 , ＊为通讯作者 , E-mail:zhongkai99@si-
na.com。
侵染番茄的中国番木瓜曲叶病毒基因组结构特征
王　玉 1 , 2 , 丁　铭 2 , 杨　莉2 ,杨长楷 3 ,杨向东 3 , 张仲凯2＊
(1.昆明理工大学生命科学与技术学院, 云南 昆明　 650224;2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 ,云南 昆明　
650223;3.云南省农业科学院热区生态农业研究所 ,云南元谋　651300)
摘　要:从云南元谋采集表现曲叶症状的番茄样品中分离粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitedgeminivirus, WTGs)分离物 YN678。
序列分析表明其 DNA-A为单链环状 ,全序列长度为 2739 bp,编码 6个ORFs。 BLAST比对发现 ,该分离物与双生病毒科菜豆金色
黄花叶病毒属的中国番木瓜曲叶病毒HeNZM1分离物(PaLCuCNV-[HeNZM1] )最为接近 ,相似性为 98.5 %,表明番茄中的分离物
YN678是 PaLCuCNV的 1个分离物。利用 WTGs卫星分子 DNAβ特异引物 Beta01/Beta02进行 PCR扩增 、克隆和测序 , 在 YN678
中扩增到 DNAβ分子 , 全长为 1357bp, 该序列与中国番茄黄曲叶病毒YN149分离物(TYLCCNV-[ YN149] )伴随的DNAβ相似性
最高 ,达到 99.1 %。这是首次从云南番茄中分离到中国番木瓜曲叶病毒。
关键词:中国番木瓜曲叶病毒;中国番茄黄曲叶病毒;番茄;DNA-A;DNAβ
中图分类号:S641.2　　　文献标识码:A
GenomicCharacterizationofIsolateofPapayaLeaf
CurlChinaVirusinSolanumlycopersicon
WANGYu1, 2 , DINGMing2 , YANGLi2 , YANGChang-kai3 , YANGXiang-dong3 , ZHANGZhong-kai2＊
(1.SchoolofLifeScienceandTechnology, KunmingUniversityofScienceandTechnology, YunnanKunming650224, China;2.Instituteof
BiotechnologyandGeneticResources, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650223, China;3.InstituteofTropical
ZoneEcologicalAgriculture, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanYuanmou651300, China)
Abstract:BegomovirusisolateYN678 wasobtainedfromSolanumlycopersiconplantsshowingleafcurlsymptomscolectedinYuanmou,
Yunnanprovince.CompletesequenceofthesinglecircularDNA-Amoleculecomprised2739 nucleotidesandcontainssixopenreading
frames.ComparisonandanalysisshowedthattotalDNA-AofYN678wasmostcloselyrelatedtoPapayaleafcurlChinavirus(PaLCuCNV)
with98.5 % nucleotidesequencesidentityisolatedfromHeNZM1.ItwasconcludedthatisolateYN678 infectingSolanumlycopersiconwas
oneofPaLCuCNVisolates.SateliteDNAmoleculeDNAβ wasfoundtobeassociatedwithYN678usingtheprimersbeta01 andbeta02.The
DNAβ ofYN678contained1357 nucleotideshavingthehightestnucleotidesequenceidentity(99.1%)withDNAβ associatedwithTYLCC-
NV-YN149.ThiswasthefirstreportofSolanumlycopersiconinfectedwithPaLCuCNVinYunnan.
Keywords:PapayaleafcurlChinavirus;TomatoyelowleafcurlChinavirus;Solanumlycopersicon;DNA-A;DNAβ
　　双生病毒是世界范围内广泛分布的一类具有双
生颗粒形态的植物单链 DNA病毒。根据基因组结
构 、寄主范围和昆虫介体的不同 ,双生病毒科被划分
为 4个不同的属:玉米线条病毒属(Masterevirus)、甜
菜曲顶病毒属(Curtovirus)、番茄伪曲顶病毒属(To-
pocuvirus)和菜豆金色花叶病毒属 (Begomovir-
us)[ 1 ～ 2] 。其中菜豆金色花叶病毒属病毒(Begomo-
viruses)是种类最多 、经济重要性最大的一类病毒。
Begomoviruses在自然条件下由烟粉虱 (Bemisia
tabaci)以持久方式传播 ,因此也称为粉虱传双生病
毒 (Whitefly-transmited geminivirus, WTGs)[ 3] 。
WTGs是一类危害严重的植物病毒 ,对全球热带 、亚
热带地区的多种作物造成了严重的损失 [ 4] 。目前
至少有 39个国家的棉花 、木薯 、番茄和烟草等作物
遭受此类病毒的毁灭性危害 [ 3] 。自 20世纪 90年代
起 , 在中国的云南 、广西 、广东和福建等南方各省
(区)该病毒病害危害日趋严重[ 5 ～ 10] 。
近年来 ,在中国广西 、广东表现曲叶症状的番木
瓜上分离到了中国番木瓜曲叶病毒 Papayaleafcurl
1917
2010年 23卷 6期
Vol.23　　No.6 　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
DOI :10.16213/j.cnki .scjas.2010.06.075
Chinavirus(PaLCuCNV),该病毒属于粉虱传双生病
毒 ,自然寄主是番木瓜 ,由 Wang等[ 11]首次在广西
的番木瓜上发现 。Zhang等 [ 12]在广西和河南表现曲
叶症状的番茄上分离到了 PaLCuCNV,证明该病毒
的寄主和分布范围正在进一步扩大 ,对番茄生产构
成了潜在的威胁 。
云南低纬度中低海拔河谷地区是 WTGs发生流
行的主要区域 ,对当地的烟草 、番茄 、西葫芦 、菜豆和
番木瓜等重要经济作物造成了严重危害。番茄是云
南中低海拔地区冬春季节主要的蔬菜作物之一 ,尤
其在金沙江干热河谷及红河河谷地区种植面积较
大 。通过近年来的调查发现 ,侵染该区域番茄等冬
季蔬菜的病毒病原主要是 WTGs,因此对田间番茄
等作物以及杂草等中间寄主植物中病毒病原的鉴定
和研究 ,可为该类病毒的防控提供理论依据 。本文
对引起云南省元谋县番茄曲叶病的分离物进行了分
子鉴定 ,并对其基因组结构特征进行了分析和比较 ,
首次从云南番茄曲叶病样中检测到中国番木瓜曲叶
病毒(PaLCuCNV)。
1　材料与方法
1.1　毒源
病株样品(编号 YN678)采集自云南省楚雄州
元谋县 ,表现曲叶症状的番茄植株。
1.2　DNA提取
按 Harrison等 [ 13]报道的方法提取总 DNA。
1.3　PCR扩增 、克隆和序列测定
参照 Deng[ 14]的方法 ,根据 WTGs的基因间隔区
和部分外壳蛋白的保守序列设计简并性引物 PA和
PB,进行 DNA-A部分序列的扩增 。根据测序结果
设计特异引物 CToF(5′-CGGCTGAACTTCGACAGC-
CC-3′)、 CToR(5′-TTAGCCGGCGACGCACCTT -3′)
扩增病毒 DNA-A全长基因组 。参照 Briddon等的方
法 [ 15] ,合成引物 Beta01和 Beta02扩增致病性卫星
分子 DNAβ全序列 。以上引物均由上海生工工程
技术服务有限公司合成。
PCR产物克隆到 pMD18-T载体 ,转化到大肠杆
菌 DH5α感受态细胞中 ,筛选阳性克隆 ,碱性裂解法
提取质粒。测序由北京六合华大基因科技股份有限
公司完成。
1.4　序列分析
利用 ChromasPro软件进行序列拼接 , BLASTn
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和 DNAMAN程
序 version5.2.2(LynnonBiosoft, QuebeCanada)对
获得的序列进行相似性比较与分析 ,利用 Mega程
序 version4.0.2(www.megasoftware.net)的邻近连
接法(Neighbor-Joining, NJ)构建病毒全基因组序列
的系统进化树 ,重组分析采用 RDP(Recombination
DetectionProgram)version3.41软件。所用比对序
列都来自 GenBank,用于 DNA-A序列比对和进化分
析的病毒有:中国番木瓜曲叶病毒 HeNZM1、G30、
G22、 F25、 G8、 G12、 G10 分 离 物 (PaLCuCNV-[
HeNZM1] 、 [ G30] 、[ G22] 、[ F25] 、 [ G8] 、[ G12] 、
[ G10 ] , FN256260、 AJ558117 、 AJ704604 、
AM691552、AJ558124 、AJ558116、AJ558125),中国
胜红蓟黄脉病毒 G68、 G13 分离物 (AYVCNV-
[ G68] 、[ G13] , AJ849916、AJ558120), 云南烟草曲
径 病 毒 Y161 分 离 物 (TbLCYNV-[ Y161 ] ,
AJ566744),菲律宾番茄曲叶病毒 P20分离物(ToL-
CPhV-[ P20] , EU487028),海南番茄曲叶病毒 HaN-
HK7分离物(ToLCHNV-[ HaNHK7] , FN256261),台
湾番茄曲叶病毒 GT6-4分离物(ToLCTWV-[ GT6-
4] , DQ866123), 泰国烟草曲叶病毒 (TbLCThV,
DQ871221),中国番茄黄曲叶病毒 Y10、Y11、Y25分
离物 (Y25, TYLCCNV-[ Y10 ] 、 [ Y11 ] 、 [ Y25 ] ,
AJ319675、AJ319676、AJ457985),中国番茄黄曲叶
病毒(TYLCCNV, NC 004044),甜菜曲顶病毒 Cali-
fornia分离物(BCTV, M24597、NC 001412),赛葵黄
脉病毒 Y206分离物 (MYVV-[ Y206] , AJ744881),
红河赛葵黄 脉病毒 Y249 分 离物 (MYVHhV-
[ Y249] , FN552749),赛葵黄花叶病毒 Hn36分离物
(MYMV-[ Hn36] , AM236755),空心莲子草黄脉病
毒(AlYVV, DQ375456),空心莲子草黄脉病毒 Ecl
分离物 (AlYVV-[ Ecl] , DQ641704),泰国番茄黄曲
叶病毒 Y72分离物(TYLCThV-[ Y72] , AJ495812),
番茄金色花叶病毒(TGMV, NC 001507),秋葵黄脉
花叶病毒(BYVMV, FN645923),东非木薯花叶病毒
UG分离物(EACMV-[ UG] , FN668380), 非洲木薯
花叶 病 毒 DRC6 分 离 物 (ACMV-[ DRC6 ] ,
FN668378)。
用于 YN678 DNAβ序列比对的 DNAβ分子有:
中国番茄黄曲叶病毒 YN149、 YN164、 YN130、
YN526、Y25、Y253、Y277 G30、G32分离物(TYLCC-
NV-[ YN149 ] 、 [ YN164 ] 、 [ YN130 ] 、 [ YN526 ] 、
[ Y25 ] 、 [ Y253 ] 、 [ Y277、] 、 [ G30 ] 、 [ G32 ] ,
GU058280、 GU058284 、 GU058338、 GU058332、
AJ421619、 AJ704606、 AJ704607、 AJ971331、
AM980510)、番茄曲叶病毒(ToLCV, AJ542492)、中
国番茄曲叶病毒 (ToLCCNV-[ G61] , AJ704616)、棉
花曲叶病毒 (CoLCV, AY765255)、萝卜曲叶病毒
(RaLCV, EU431117)、烟草曲茎病毒 Y115分离物
(TbCSV-[ Y115] , AJ57822)云南辣椒曲叶病毒
1918 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
YN510分离物(PepLCYNV-[ YN510] , GU058328)。
2　结果与分析
2.1　病毒分离物 YN678 DNA-A基因组结构
对采集的番茄样品利用引物 CToF/CToR进行
PCR扩增 ,得到约 2.7 kb的片段 ,序列测定拼接后
发现 , YN678的 DNA-A全长 2739个核苷酸(nt)。
YN678的 DNA-A具有典型的 WTGs的基因组结构 ,
为闭合环状单链 DNA,共编码 6个 ORFs,分别是位
于病毒链上的 AV1基因(292 ～ 1065 nt)、AV2 基因
(132 ～ 482 nt)及位于互补链上的 AC1基因(1539 ～
2590 nt)、AC2 基因 (1207 ～ 1608 nt)、AC3 基因
(1062 ～ 1466 nt)和 AC4基因(2141 ～ 2434 nt)。在
AV2和 AC1 之间(对应于核苷酸 2591 ～ 131 nt)含
280 nt的基因间隔区(Intergenicregion, IR)。 IR含
有双生病毒转录和复制所必需的各种顺式元件(cis-
element):包括 9个核苷酸 TAATATTAC的茎环结构
和 TATAbox等 。
2.2　YN678 DNA-A与其它双生病毒的相似性比较
将 YN678 DNA-A全序列利用 NCBI中的
BLAST进行检索发现 , 它与 PaLCuCNV分离物
HeNZM1和 G30的相似性最高 ,分别为 98.5 %和
98.4 %,而与其它不同种的双生病毒相似性均在 90
%以下 。将该病毒的 6个 ORFs编码的氨基酸序列
与部分双生病毒相应的 ORFs进行比较 ,也证明它
们与 PaLCuCNV的分离物 HeNZM1和 G30对应序
列的相似性最高(表 1)。从构建的系统进化树(图
1-A)得知 , YN678 DNA-A与 PaLCuCNV的 HeNZM1
和 G30分离物形成一独立分支 ,而与其它病毒的进
化关系均较远 。
2.3　YN678卫星分子 DNAβ 结构以及与其它
DNAβ的相似性比较
利用 DNAβ全长特异性引物 beta01和 beta02
进行 PCR扩增 ,得到 1条长约 1.4 kb的特异条带。
序列测定表明 , YN678DNAβ 全长为 1357 bp。
YN678DNAβ互补链(212 ～ 571 nt)上编码唯一的蛋
白 βC1,核苷酸长度 360 nt,共编码 119个氨基酸。
此外 ,该卫星分子的 780 ～ 1112 nt有 1个 A富含区。
PYN678DNAβ与其它的 WTGs卫星分子的 DNAβ
进行相似性比较。从核苷酸全序列和 βC1编码的
氨基酸序列来看 ,与 TYLCCNV各分离物伴随的卫
星分子相似性最高 。其中核苷酸序列与 TYLCCNV-
YN149、YN164、YN526的相似性最高 ,分别为 99.1
%、99 %、98.8 %,而与其它 WTGs的 DNAβ的相似
性较低 (表 2)。 YN678βC1编码的氨基酸序列与
TYLCCNV分离物 YN149的相似性最高 ,为 99.7
%。根据 DNAβ全序列构建的系统进化树可以看
出 , YN678DNAβ同 TYLCCNV分离物 YN149伴随
的 DNAβ 处于 1个分支 , 说明该病毒与分离物
YN149DNAβ的亲缘关系较近(图 1-B)。
表 1　YN678DNA-A全序列及各编码框氨基酸序列与其它双生病毒相似性比较(%)
Table1　PercentagesofnucleotideandaminoacidsequenceidentitiesbetweenYN678 DNA-Aandothergeminiviruses
Virus DNA-Aa AV2b AV1b AC1b AC2b AC3b AC4b
PaLCuCNV-HeNZM1 98.5 98.9 97.8 98.5 96.3 99.3 100.0
PaLCuCNV-G30 98.4 98.9 97.4 98.3 96.0 99.5 99.7
PaLCuCNV-G22 94.8 96.0 94.4 96.2 93.5 97.3 98.6
PaLCuCNV-F25 94.4 95.2 94.3 95.1 93.8 98 98.3
PaLCuCNV-G8 92.7 94.9 92.1 94.7 93.8 96.8 98.0
PaLCuCNV-G12 92.9 94.6 91.9 95.3 93.5 97.0 98.6
PaLCuCNV-G10 90.8 94.9 92.0 91.0 92.8 96.8 92.9
ToLCHNV-HaNHK7 88.7 94.3 94.6 84.3 80.2 91.6 92.9
ToLCTWV-GT6-4 82.3 83.9 84.8 85.5 78.3 78.5 91.8
ToLCPhV-P20 75.5 62.9 79.7 78.2 78.6 80.1 72.8
TbLCYNV-Y161 80.3 81.6 55.7 80.6 91.3 95.1 71.5
TbLCThV 85.3 83.3 75.7 90.6 90.3 95.1 98.3
AYVCNV-G68 84.2 79.5 80.1 83.7 93.3 97.5 72.2
AYVCNV-G13 84.1 52.4 80.2 83.7 93.0 37.7 71.5
　　注:a.核苷酸序列相似性 , a.Nucleotidesequenceidentity;b.氨基酸序列相似性 , b.Aminoacidsequenceidentity。
19196期 　　　　　　王　玉等:侵染番茄的中国番木瓜曲叶病毒基因组结构特征
表 2　YN678 DNAβ 、βC1核苷酸序列及 βC1编码的氨基酸序列与其它 DNAβ 相似性比较(%)
Table2　PercentagesofnucleotideandC1-encodedaminoacidsequenceidentitiesbetweenYN678 DNAβ andotherDNAβ molecules
Virus DNAβ βC1a βC1b
TYLCCNV-YN149 99.1 99.7 99.7
TYLCCNV-YN164 99.0 99.2 99.2
TYLCCNV-YN526 98.8 98.9 98.9
TYLCCNV-YN130 82.3 87.1 87.1
TYLCCNV-Y25 84.1 89.1 89.1
TYLCCNV-G30 82.4 88.5 88.5
TYLCCNV-G32 82.5 88.5 88.5
TYLCCNV-Y253 83.4 88.0 88.0
TYLCCNV-Y277 83.4 87.4 87.4
ToLCCNV-G61 58.4 62.2 62.2
ToLCV 62.5 68.3 68.3
TbCSV-Y115 64.1 73.7 73.7
PepLCYNV-YN510 83.5 88.0 88.0
CoLCV 63.5 72.5 72.5
RaLCV 63.6 69.2 69.2
　　　　注:a.核苷酸序列相似性 , a.Nucleotidesequenceidentity;b.氨基酸序列相似性 b.Aminoacidsequenceidentity。
图 1　基于 YN678 DNA-A(A)和 DNAβ (B)核苷酸全序列构建的系统进化树
Fig.1　RelationshipdendrogramsbasedonalignmentsofDNA-A(A)andDNAβ (B)sequencesofYN678 andothergeminiviruses
2.4　重组分析
应用 RDP(RecombinationDetectionProgram)
version3.41软件中的 RDP、MaxChi程序对所选的
双生病毒 DNA-A进行重组分析发现 , YN678分离物
是由 ToLCPhV-P20和 TYLCCNV-Y10重组产生的病
毒 ,其中 294 ～ 1295 nt区域(Positioninalignment
372-1576)来自 ToLCPhV-P20,与其同区域片段相似
性达到 81.5 %,该核苷酸区域包含整个 AV1以及
AC3的部分区域(图 2)。
1920 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
图 2　YN678的重组示意图(A-采用 RDP程序重组示意图;B-采用 MaxChi程序重组示意图)
Fig.2　GraphicrepresentationofrecombinationinYN678 (A)and(B)usingRDP, MaxChiprogram, respectively
3　讨　论
　　从云南省楚雄州元谋县采集的表现曲叶症状的
番茄中获得了 YN678分离物 ,利用病毒特异引物扩
增得到了它的全序列 。对 YN678 DNA-A序列分析
和比较发现与中国番木瓜曲叶病毒的 HeNZM1分
离物相似性最高 , 达到 98.5 %。重组分析发现 ,
YN678DNA-A是由 ToLCPhV-P20及 TYLCCNV-Y10
重组产生的 1个病毒分离物 。重组是导致病毒快速
变异的重要原因 ,由于双生病毒基因组较小 ,结构较
为简单 ,该类病毒的复制起始都集中于其相似性较
高的非编码区内 ,因此 ,不同种类 WTGs间发生重组
的可能性较大 ,这也为该类病毒对周边环境的适应
性进化提供了基础 。从 YN678样品中还检测到了
伴随性卫星分子 DNAβ ,该分子与 TYLCCNV分离
物 YN149的 DNAβ 相似性最高 , 达到 99.1 %。
DNAβ最早于 1999年被发现 ,这类卫星分子只存
在于旧世界 WTGs中 ,借助辅助分子 DNA-A进行复
制和运动 ,它增加了病毒的积累并扩大了寄主范
围 [ 16 ～ 17] 。先前报道的 PaLCuCNV为单组分无卫星
分子 DNAβ病毒 [ 18] ,本实验中的 YN678却检测到
伴随性卫星分子 DNAβ ,通过分析发现 ,这可能是
由于复合侵染而引起 WTGs病毒组分及卫星分子重
配 。但 PaLCuCNV是否能利用不同种类的卫星分子
进而加重病毒的危害 ,还需要进一步通过侵染性试
验来证明。
云南具有多海拔 、多气候类型特点 ,全年均可大
面积种植蔬菜 、烟草等经济作物 。番茄是云南中低
海拔地区冬春季节主要蔬菜作物之一 ,尤其在元谋
县 ,常年种植面积约 13 300 hm2左右。元谋县处于
干热河谷地区 ,常年气温较高 ,为粉虱的繁殖提供了
适宜的条件。通过调查发现 ,该地区番茄作物上主
要的病毒病害是由 WTGs引起的 ,并且由 WTGs引
起的番茄曲叶病在该地区尤为严重 ,其中 TYLCCNV
是优势种 。本研究首次在云南番茄上检测到 PaL-
CuCNV,说明该地区侵染番茄的 WTGs具有种类多
样性 。
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(责任编辑　王家银)
1922 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷