全 文 ：第 15 期
第 51卷第 15期
2012 年 8 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.15
Aug．，2012
收稿日期：2011－05－27
作者简介：周艳菲（1984－），女，湖北汉川人，硕士，研究方向为菌根真菌学，（电话）15172518462（电子信箱）sanxiafeiyu＠163．com；
通讯作者，赵 斌，教授，主要从事微生物生物学相关研究工作，（电子信箱）binzhao＠mail．hzau．edu．cn。
目前全世界已有 8亿 hm2的土地出现盐渍化［1］，
严重影响了土地资源的利用， 盐胁迫造成的低水
势、Na＋毒害作用和营养元素分布不均衡， 可使植物
减产甚至不生长［2］。 菌根真菌（AMF）作为一类可以
与地球上 80％的陆生植物共生的古老微生物 ［3］，能
促进植物对土壤中 Fe、Zn、Cu、P 等矿质元素的吸
收，调节宿主植物的代谢活动［4］，提高宿主植物抗重
金属、抗旱和抗盐胁迫能力。 盐对菌根的影响主要
表现在减少孢子数量和抑制菌丝生长 ［5］，减少其再
次侵染宿主的机会，降低菌根侵染率。 尽管存在这
种抑制作用， 仍有大量研究结果表明 AMF 可以提
高宿主抗盐胁迫能力， 不同 AMF 抗盐胁迫的能力
不一样，对植物生长的促生效果也不同［6］。
在生态系统中，同一宿主植物能被多种 AMF同
时侵染，利用传统的 TB染色和形态学观察方法难以
对菌根中不同的 AMF 进行区分 ［7，8］。 而分子生物学
方法可用于检测混合侵染的菌根中 AMF 的组成［9］。
实时荧光定量 PCR 技术可以准确测定样品中特定
利用定量 PCR方法检测盐、磷对菌根真菌侵染
紫云英的影响
周艳菲，林 会，赵 斌
（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）
摘要：建立了菌根真菌（AMF）的 DNA 含量和 TB 染色所观察的侵染率之间的相关性曲线。 将荧光定量
PCR 技术运用到 AMF 对植物紫云英（Astragalus sinicus L．）的侵染率检测中，实现了混合侵染条件下对
菌根中 AMF 的种类和侵染率同时进行定性和定量检测。 在盆栽实验中，利用所建立的方法检测了不同
盐、磷浓度及交互作用对 AMF 侵染紫云英的影响，结果表明，不同磷浓度下，盐浓度的增加对 Glomus
mosseae 和 Glomus intraradices 侵染率的影响不同。 G． intraradices 在混合接种中占有绝对的优势。 从
AMF 对紫云英的促生效果上看，AMF 侵染率的增加提高了紫云英的抗盐胁迫能力，促进了植物生长。
关键词：定量 PCR；菌根真菌（AMF）；紫云英（Astragalus sinicus L．）；盐胁迫；磷
中图分类号：Q939．5 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）15－3193-05
Using Real－Time PCR to Detect the Effect of Phosphorus and Salt on the
Colonization of AM Fungus to Astragalus sinicus L.
ZHOU Yan－fei，LIN Hui，ZHAO Bin
（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract： The correlation curves between the amounts of fungal DNA and fungal colonization of the root system were estab-
lished by means of TB stain method. The PCR method was used to detect the AMF colonization rate under the condition of
mixture inoculation reliably． It could be used for simultaneous qualitative and quantitative investigations of special taxa of
AMF in roots and soils colonized by several taxa． This method was used to detect the effect of different level of salt and
phosphorus on colonization of AM fungal to Astragalus sinicus L， which was carried out with a greenhouse experiment． The
results showed that while the concentration of phosphorus was different， the increase of salt concentration had different effects
on the colonization of Glomus mosseae and G. intraradices to host plants． While inoculated with mix communities， plants were
usually dominated by G． intraradices．
Key words： qPCR； arbuscular mycorrhiza fungi； Astragalus sinicus L．； salt stress； phosphorus
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.15.060
湖 北 农 业 科 学 2012 年
基因的拷贝数。 Alkan 等［10，11］对 Glomus intraradices
设计特异性引物，使用荧光定量 PCR 方法第一次对
单接种条件下菌根中 rDNA 进行了绝对定量， 研究
表明菌根总侵染率（包含菌丝、丛枝、泡囊）和荧光
定量 PCR测得的结果之间具有相关性，相关性程度
大小与宿主植物联系紧密。 随后，进一步将该方法
应用在双接种研究中，分别检测 Glomus mosseae 和
G． intraradices 在不同处理时的侵染率变化，发现不
同处理下 G． intraradices 在苜蓿中都占绝对优势。
Gamper 等［12］运用实时荧光定量的方法对 5 种 AMF
进行定量分析，发现孢子数量和定量 PCR 检测的结
果之间有很强的相关性，定量 PCR 方法的可行性取
决于具体的实验内容，这种方法是研究生态系统中
特定的 AMF总核酸量的有效方法。
本研究探讨单接种条件下 G． mosseae 和 G．
intraradices用定量 PCR方法检测的结果与 TB 染色
观察结果之间的相关性，建立了定量 PCR 方法检测
混合接种条件下各种 AMF 侵染率的方法。 在此基
础上以紫云英为宿主植物 ，G． mosseae 和 G． in-
traradices 为试验菌种，设置盐和磷交互作用的盆栽
实验，定量 PCR 方法检测了盐、磷交互作用下两种
AMF 侵染紫云英的变化，比较单接种和双接种条件
下每种 AMF侵染的变化。
1 材料与方法
1．1 实验材料
供试植物：紫云英（Astragalus sinicus L．），种子
消毒、催芽方法参考 Peng等［8］的实验方法。
供试真菌：G． mosseae，G． intraradices。 原始菌
种由北京农林科学院提供，以此进行扩繁，将 AMF
侵染紫云英 6 个月的混合物作为接种剂，其中含有
被感染的植物根段、AMF 菌丝、 孢子和盆栽土壤混
合物。
供试土壤：采自华中农业大学实验田，土壤经
自然风干后磨碎并过 2 mm 的筛网， 将河沙洗净晒
干后与土 2∶1（V ／ V）混合均匀，121 ℃间歇灭菌 3次。
土壤理化性质：pH 6．59， 电导率为 73．6 μS ／ cm，速
效磷含量为 11．83 mg ／ kg。
1．2 实验方法
1．2．1 定量 PCR 方法的应用 用粗提法提取紫云
英 DNA ［8］，利用嵌套 PCR 方法获取紫云英 LR1－
NDL22 区段间的序列 ［4］。 将获得的序列在 NCBI 上
进行比对 （http： ／ ／ blast．ncbi．nlm．nih．gov ／ Blast．cgi），
分别设计上述 3 个物种的特异性引物并用普通
PCR进行验证，PCR反应程序参考 Peng等［8］的方法。
分别提取 G． intraradice、G． mosseae 和紫云英
的 DNA，测定浓度后，利用荧光定量 PCR 技术分别
建立两种 AMF 孢子、 紫云英 DNA 浓度和 CT 值关
系的标准曲线。 为了进一步检验 AMF 引物的特异
性和敏感性， 将 AMF 的孢子 DNA 做梯度稀释，分
别与一定量的紫云英 DNA 混合， 建立混合体系中
AMF孢子 DNA的标准曲线。在此基础上，制备一系
列不同侵染率根样 ［10］，提取 DNA，用荧光定量 PCR
进行扩增，计算不同侵染率下 CDNA（AMF） ／ CDNA（plant）与 TB
染色显微观察的侵染率之间的相关性。
荧光定量 PCR 采 用 SYBR Green Realtime
PCR Master Mix（TOYOBO 公司）试剂，反应体系：
20 μL 体系中含有 10 μL SYBR Green kit， 0．5 μmol
上、下游引物，2．0 μL DNA 模板，补水至 20 μL。 反
应在 ABI7300 荧光定量 PCR 仪进行，PCR 反应程
序 ：95 ℃（20 s）、95 ℃（20 s）、60 ℃（20 s）、72 ℃（30
s），进行 40 个循环；然后进行溶解曲线分析。
1．2．2 盆栽实验 以 KH2PO4的方式加入磷， 盐胁
迫处理使用 NaCl。 实验设置 3 个磷水平（0、30、60
mg ／ kg）和 3 个盐水平（0、0．35、1．05 g ／ kg），共 9 种处
理，每种处理设置不接种、单接种 G intraradice、单
接种 G mosseae 和双接种（1∶1，V ／ V）4 种接种方式，
共 36 个处理，每个处理 3 次重复，共计 108 盆。 每
盆装土 500 g，接种处理每盆加 13％接种剂，对照组
加等量灭菌的接种剂。参照“1．1”的方法进行种子灭
菌和催芽。
1．2．3 侵染率测定 第 7 周收获时将植株取出、洗
净后， 取新鲜根 0．2 g 用于抽提 DNA， 用荧光定量
PCR方法检测 AMF侵染率。 实验数据用 SPSS 16．0
进行统计分析。
2 结果与分析
2．1 定量 PCR方法中特异性引物的设计及验证
分别以植物 、G． mosseae 孢子 、G． intraradices
孢子的 DNA 为模板，用各自的特异性引物对上述 3
种模板行进行验证（图 1，从左往右胶图顺序分别是
G． mosseae， G． intraradices 和紫云英特异性引物验
证结果，1－5 泳道的模板分别为负对照， 紫云英，G．
mosseae，G． intraradices，50 bp Ladder Marker）。 AMF
及植物的引物都具有特异性，通过在荧光定量 PCR
仪器上进行验证，各自的溶解曲线为单峰，说明这 3
对引物可以用于荧光定量 PCR 方法中，引物序列及
名称：LR1－NDL22［8］，Gi－R ／ RT－F：AATCAGCCTTTC
GGGT，TACCGTGAGGGAAAGATG；Mos－F／Mos－R［11］，
ASF6 ／ ASR6［13］。
2．2 AMF和紫云英 DNA标准曲线建立
分别用 G． mosseae、G． intraradices、紫云英的特
3194
第 15 期
异性引物进行 PCR，得到荧光定量 PCR 的 CT 值与
各自 DNA浓度之间的标准曲线（图 2）。 Gi－R ／ RT－F
扩增的 DNA 浓度范围为 3．2×10－3～32.0 ng， 线性方
程为 y＝－3．191x＋27．250，R2＝0．999 0（图 2a）；Mos－F ／
Mos－R 扩增的 DNA 浓度范围在 1．6×10－3～25.0 ng，
线性方程为 y＝－3．219x＋24．167，R2＝0．998 9（图 2b）；
ASF6 ／ ASR6 扩增的 DNA 浓度范围为 3．5×10－4～35.0
ng， 线性方程为 y＝－3．403x＋21．270，R2＝0．999 6 （图
2c）。 扩增效率分别是 105．4％、105．5％、98．8％。
2．3 定量 PCR检测 AMF特异引物的灵敏性
在 模 拟 实 验 条 件 下 ，G． intraradices DNA
（0．016，0．080，0．400，2．000，10．000，50．000 ng） 分别
与 35．0、11．7 和 3．5 ng（图 3a）紫云英 DNA 混合，扩
增的 logCDNA 与 CT 值之间的线性方程分别为，y＝
－3．303x＋28．237，R2＝0．996 8；y＝－3．526x＋28．731， R2＝
0．994 0；y＝－3．256x＋28．534，R2＝0．990 9；扩增效率分
别为 100．77％，96．31％，97．65％。 G． mosseae DNA
（0．080，0．400，2．000，10．000，50．000 ng） 分别与15．0、
5．0 和 1．0 ng （图 3b）紫云英 DNA 混合 ，扩增的
logCDNA与 CT 值之间的线性方程分别为 y＝－3．396x＋
25．555，R2＝0．997 5；y＝－3．429 1x＋25．602，R2＝0．997 8；
y＝－3．308x＋25．216，R2＝0．995 8， 扩增效率分别为
99．330％，97．996％，97．648％，106．808％。 当 AMF 的
DNA 模板浓度在 0．016～50．000 ng 范围内都能得到
良好的扩增， 这说明 AMF 的特异引物可以在混杂
DNA存在时准确、灵敏地检测出目的基因。
2．4 根样侵染率与 CDNA（AMF）/CDNA（plant）线性关系模拟
在模拟实验下确定了 AMF 引物在荧光定量
PCR 运用于 AMF DNA 检测具有特异性及灵敏性的
基础上，用盆栽实验的根样，建立 CDNA（AMF）/CDNA（plant）
与 TB 染色显微观察结果之间的关联性。 结果表明
CDNA （AMF）/CDNA （plant ）与侵染率有明显的相关性 （G．
mosseae，y＝0．106 7x－0．004 9，R2＝0．967 6）； G． in-
tradices，y＝0．121 2x＋0．002 3，R2＝0．961 8）（图 4）。 利
用 qPCR 方法检测出实际根样中的 CDNA（AMF）/CDNA（plant）
值随着侵染率的变化而呈现出相应的变化，表明本
方法可以用于直接检测实际侵染根样中各种 AMF
的侵染率。
2．5 不同处理对 AMF侵染紫云英的影响
定量 PCR 检测的结果得到不同 AMF 对植物的
图 1 G． intrarasices、G． mosseae、紫云英特异性引物验证图
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
500 bp
400 bp
350 bp
300 bp
250 bp
200 bp
150 bp
100 bp
50 bp
图 2 AMF 孢子及紫云英 DNA 与 CT 值的标准曲线
35
30
25
20
CT
-2 -1 0 1 2
logCDNA
31
29
27
25
23
21
19
17
15
CT
-2.0-1.5-1.0-0.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0
logCDNA
31
29
27
25
23
21
19
17
15
CT
-3 -2 -1 0 1 2
logCDNA
a
b
c
图 3 AMF 特异性引物灵敏性的检验曲线
40
35
30
25
20
CT
-2 -1 0 1 2
logCDNA
32
30
28
26
24
22
20
18
CT
-1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0
logCDNA
35 ng
11.7 ng
3.5 ng
1 ng
5 ng
15 ng
a
b
周艳菲等：利用定量 PCR 方法检测盐、磷对 AM真菌侵染紫云英的影响 3195
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图 4 侵染率与 CDNA（AMF） ／ CDNA（plant）线性关系
侵染率如图 5。 在低磷时 ， 盐浓度增加 ，G． in-
traradices 侵染率逐渐降低；中磷和高磷条件下随着
盐浓度的增加，其侵染率先升高后降低。 高盐浓度
处理时， 其 DNA含量分别减少了 61．58％、28．07％、
15．46％，说明 G． mosseae 的侵染率随着盐浓度的增
加而降低，在高盐浓度时，与正常盐浓度下相比，其
相 对 DNA 含 量 分 别 减 少 了 51．54％ 、66．20％ 、
67．71％，磷含量的增加进一步降低了 G． mosseae 的
侵染率，说明磷进一步抑制其侵染。 而双接种条件
下 ，G． intraradices 的侵染率都要高于 G． mosseae
的侵染率，同样处理下 G． mosseae 侵染率有时仅为
G． intraradices 的 58．67％， 表明混合接种促进了 G．
intraradices 侵染紫云英。
2．6 不同磷水平和盐水平下接种 AMF对紫云英生
物量的影响
从表 1 可以看出，在各种处理下，接种 AMF 的
紫云英干重要高于未接种的紫云英， 说明了 AMF
可以提高紫云英的抗盐性。 其中在中磷条件下显示
出最佳促生效果，而低磷条件下次之，高磷条件最
差。 中磷浓度（30 mg ／ kg）下，在低盐时，G． mosseae
促生效果介于 G． intraradices 和混合接种之间，在
高盐条件时单接种 G． intraradices 的促生效果最
好，G． mosseae 促生效果最差。
3 小结与讨论
TB 染色观察 G． intraradices 和 G． mosseae 这
表 1 不同处理下紫云英地上、地下部分生物量 （单位：g）
生物量
P0
P1
P2
CK
GI
GM
MIX
CK
GI
GM
MIX
CK
GI
GM
MIX
Shoot
0.130 6±0.001
0.232 4±0.069
0.352 9±0.055
0.257 9±0.026
0.280 8±0.003
0.352 6±0.030
0.377 8±0.071
0.447 2±0.094
0.641 2±0.048
0.774 4±0.048
0.784 0±0.060
0.739 0±0.049
Root
0.095 9±0.018
0.134 4±0.030
0.193 9±0.024
0.157 2±0.037
0.135 7±0.065
0.192 0±0.009
0.213 7±0.054
0.207 1±0.078
0.340 2±0.017
0.429 8±0.057
0.503 9±0.106
0.482 9±0.023
Shoot
0.114 2±0.010
0.200 2±0.031
0.205 6±0.033
0.196 3±0.044
0.255 4±0.026
0.427 9±0.063
0.325 3±0.030
0.361 4±0.037
0.609 0±0.050
0.796 5±0.097
0.685 7±0.078
0.784 9±0.001
Root
0.072 6±0.004
0.079 9±0.021
0.088 4±0.028
0.102 1±0.034
0.157 3±0.007
0.190 0±0.036
0.170 3±0.023
0.185 9±0.004
0.343 1±0.046
0.422 1±0.101
0.369 0±0.078
0.395 5±0.048
Shoot
0.056 6±0.001
0.161 7±0.048
0.079 2±0.026
0.105 4±0.026
0.106 3±0.082
0.287 0±0.040
0.125 1±0.082
0.311 4±0.057
0.458 7±0.059
0.556 4±0.064
0.446 4±0.096
0.485 7±0.074
Root
0.053 2±0.001
0.060 8±0.020
0.057 6±0.009
0.055 0±0.004
0.070 4±0.019
0.107 9±0.015
0.103 8±0.020
0.152 5±0.034
0.206 7±0.005
0.276 9±0.042
0.215 7±0.047
0.281 1±0.020
S0 S1 S2
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
C D
NA
（ G
i）
/C
DN
A
（ p
lan
t）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
侵染率//%
a
b
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
C D
NA
（ G
m）
/C
DN
A（
pla
nt
）
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
侵染率//%
注：S0，S1，S2分别表示低盐、中盐、高盐（0，0．35，1．05 g ／ kg NaCl）；
P0，P1，P2 分别表示低磷、中磷、高磷（0，30，60 mg ／ kg）。 表 1 同。
图 5 不同处理对 G． intraradices（a）和 G． mosseae（b）
侵染水平的影响
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
C D
NA
（ G
i）/C
DN
A（
pla
nt
）
P0S0 P0S1 P0S2 P1S1 P1S2 P2S0 P2S1 P2S2
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
C D
NA
（ G
m）
/C
DN
A（
pla
nt
）
P0S0 P0S1 P0S2 P1S1 P1S2 P2S0 P2S1 P2S2
Gi
MIX-Gi
a
b Gm
MIX-Gm
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第 15 期
（责任编辑 胡西洲）
两种 AMF 对紫云英的侵染率和定量 PCR 检测的相
关系数分别为 0．980 7 和 0．951 3， 说明直接用定量
PCR 方法检测 AMF 的侵染率与 TB 染色检测的浸
染率之间的线性关系良好 。 定量 PCR 方法检测
AMF 的侵染率可以用来研究不同 AMF 对不同宿主
的偏好性、在宿主植物中的分布状态，还可以运用
于分子生态学研究中， 通过检测土样中 AMF 的
DNA 含量，筛选出抗环境胁迫的高效菌种，可以加
大这类 AMF 的利用。 本研究利用定量 PCR 方法检
测 AMF 的侵染率的研究结果与 Alkan 等 ［11］的研究
结果相似，G． intraradices 在混合接种中对宿主植物
的侵染率最高。 而 Jansa 等［14］在运用实时荧光定量
PCR 技术研究 G． mosseae，G． intraradices，Glomus
claroideum 单接种或者混合接种侵染苜蓿时， 发现
G． mosseae 对宿主植物的侵染率最高，说明 AMF 对
宿主植物具有一定的偏好性。 目前对利用实时荧光
定量 PCR 检测不同 AMF 侵染率的可行性还存在争
议。
在不同磷浓度下，随着盐浓度的增加，紫云英
的生物量都减少， 但接种 AMF 的紫云英生物量都
要高于未接种的紫云英， 表明 AMF 促进了紫云英
在盐渍环境中的生长。高磷（60 mg ／ kg）浓度下，随着
盐浓度的增加，菌根紫云英生物量变化不大，可能
是紫云英吸收了大量磷减少了对盐的吸收，这与之
前利用施加营养元素缓解盐胁迫的结论是一致
的 ［15］。 可能是植物吸收磷抑制了对盐的吸收，植物
对盐和磷的吸收存在竞争性关系 ［16］。 在中磷（30
mg ／ kg）浓度下，低盐时 G． mosseae 促生效果介于 G．
intraradices 和混合接种之间； 高盐时单接种 G． in-
traradices 的促生效果最好，G． mosseae 促生效果最
差，不同的接种方式促生效应不一样，而盐和磷对
AMF间的相互作用关系也产生影响。
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