全 文 ：Box-Behnken响应面法优化紫穗槐根中总异黄酮提取工艺
赵昱玮1， 南敏伦1， 于 淼2， 司学玲3， 吕 娜4， 赫玉芳1*
(1． 吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012;2． 长春三德天晟科技有限公司，吉林 长春 130012;
3． 修正药业长春高新制药有限公司，吉林 长春 130012;4． 吉林农业大学，吉林 长春 130118)
收稿日期:2015-06-01
基金项目:吉林省中医药科技项目 (2014 － Q40)
作者简介:赵昱玮 (1983—)，男，硕士，从事植物化学研究与新药开发。Tel:(0431)86058683，E-mail:yuwei5208@ 163． com
* 通信作者:赫玉芳 (1973—)，女，博士，副研究员，从事植物化学研究与新药开发，Tel:(0431)86058683，E-mail:hyf_ 1992@
163． com
摘要:目的 优化紫穗槐根中总异黄酮的提取工艺。方法 以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷为指标，采用紫外分光光
度法测定总异黄酮含有量。在单因素试验的基础上，采用 Box-Behnken响应面法研究乙醇体积分数、料液比、提取时
间、提取次数对紫穗槐总异黄酮提取率的影响。结果 最优提取工艺为乙醇体积分数 70%，料液比 1 ∶ 13，提取时间
3 h，提取次数 3 次。在此条件下，紫穗槐根总异黄酮的提取率为 5. 59%。结论 该工艺简便可靠，提取率高，可为
紫穗槐根中总异黄酮的开发利用奠定基础。
关键词:紫穗槐;根;总异黄酮;提取工艺;Box-Behnken响应面法
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)05-1177-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 05. 048
紫穗槐 Amorpha fruticosa L． 为豆科紫穗槐属多年生落
叶灌木，别名棉槐、椒条、棉条、穗花槐［1］，在我国东北、
华北、西北地区及山东、安徽、江苏、河南、湖北、广西、
四川等地均有栽培，其花清热、凉血、止血［2］;叶微苦、
凉，具有祛湿消肿功效，主治痈肿、湿疹、烧烫伤［3］。紫
穗槐根系发达，可耐瘠、耐水湿，又有固氮、防风固沙等
作用［1］，其化学成分以黄酮为主，此外还含二苯乙烯苷、
甘油酯、挥发油及多糖等［4-5］，在抗肿瘤、抗病毒、保肝、
杀虫等方面显示出潜在的药用价值［6-7］。该资源比较丰富，
但尚无其总异黄酮提取工艺的报道。
本实验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、料
液比、提取时间、提取次数为自变量，总异黄酮提取率为
因变量，利用 Box-Behnken 响应面法优化提取工艺，以期
为紫穗槐根中总异黄酮的提取与开发提供实验依据。
1 仪器与试药
UV-759S型紫外可见分光光度计 (上海精密科学仪器
有限公司);BS2010S型电子天平 (北京赛多利斯天平有限
公司);ＲE52-98 型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂);
SHZ-D (Ⅲ)型循环式真空泵 (巩义市英峪予华仪器厂) ;
KQ-100 型超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司);恒温
水浴锅 (上海梅香仪器有限公司);ZK-82A 型电热真空干
燥箱 (上海市实验仪器总厂)。
毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 (自制，含有量 ＞
98%)。甲醇、无水乙醇、95%乙醇均为分析纯 (北京化
工厂);水为娃哈哈纯净水。
紫穗槐根采自长春净月开发区，经吉林省中医药科学
院赵全成研究员鉴定为豆科植物紫穗槐 Amorpha fruticosa L．
的根。
2 方法与结果
2. 1 总异黄酮的测定［8-9］
2. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的毛蕊异
黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品 5. 0 mg，置于 50 mL 量瓶
中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得 0. 1 mg /mL 对照
品溶液。
2. 1. 2 检测波长的选择 吸取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖
苷对照品溶液 1 mL，置于 25 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻
度，摇匀，在 200 ～ 400 nm 波长范围内扫描，发现在
260 nm处有最大吸收峰，故选择其作为检测波长。
2. 1. 3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液 0、0. 5、
1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，甲醇稀
释至刻度，于 260 nm波长处测定吸光度，空白溶液作为对
照。以各对照品的质量浓度为横坐标 (X)，吸光度为纵坐
标 (A)，得到线性回归方程为 A = 0. 052 68 X + 0. 081 43，
r = 0. 999 4，表明毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在 5 ～
25 μg /mL范围内线性关系良好。
2. 1. 4 含有量的测定方法 取供试品溶液适量，于 260 nm
波长处测定吸光度，标准曲线法计算紫穗槐根提取液中总
异黄酮的含有量，计算公式如下。
X = c × 250 × 10 × 10m × 1 000 × 1 000 × 100%
注:X为总异黄酮提取率 (%)，c 为总异黄酮质量浓度
(μg /mL) ，m为取样量 (g)
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2. 1. 5 供试品溶液的制备 将紫穗槐根药材粉碎，过 40
目筛，精密称取适量，乙醇回流提取，放冷，滤过，定容
于 250 mL量瓶中，再精密吸取 0. 1 mL，置于 10 mL 量瓶
中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
2. 1. 6 精密度试验 取同一供试品溶液适量，平行测定 6
次，测得 ＲSD为 1. 8%，表明仪器精密度良好。
2. 1. 7 重复性试验 取同一供试品溶液适量，制备 6 份样
品进行测定，测得 ＲSD为 1. 5%，表明该方法重复性良好。
2. 1. 8 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，在 0、1、2、
4、6、8、10 h进行测定，测得 ＲSD为 1. 4%，表明溶液在
10 h内稳定。
2. 1. 9 加样回收率试验 精密吸取含有量已知的供试品溶
液 6 份，分别加入对照品溶液，按“2. 1. 4”项下方法进行
测定，测得平均回收率为 99. 8%，ＲSD 为 1. 9%，表明该
方法回收率良好。
2. 2 提取条件的确定
2. 2. 1 乙醇体积分数 精密称取紫穗槐根粉末 5. 0 g，共 5
份，在料液比 1 ∶ 12，回流提取 2 次，每次 1 h，50%、
60%、70%、80%、90% 乙醇条件下提取，放冷，滤过，
定容于 250 mL量瓶中。再精密吸取 0. 1 mL，置于 10 mL量
瓶中，甲醇定容，按“2. 1. 4”项下方法在 260 nm 波长处
测定吸光度，测得总异黄酮提取率分别为 4. 27%、5. 12%、
5. 46%、5. 48%、5. 33%，故选择 70%乙醇作为提取溶剂。
2. 2. 2 料液比 精密称取紫穗槐根粉末 5. 0 g，共 5 份，
在 70% 乙醇，回流提取 2 次，每次 1 h，料液比 1 ∶ 8、
1 ∶ 10、1 ∶ 12、1 ∶ 14、1 ∶ 16 条件下提取，放冷，滤过，
定容于 250 mL量瓶中。再精密吸取 0. 1 mL，置于 10 mL量
瓶中，甲醇定容，按“2. 1. 4”项下方法在 260 nm 波长处
测定吸光度，测得总异黄酮提取率分别为 4. 38%、5. 02%、
5. 56%、5. 49%、5. 50%，故选择料液比为 1 ∶ 12。
2. 2. 3 提取时间 精密称取紫穗槐根粉末 5. 0 g，共 5 份，
在 70%乙醇，料液比 1 ∶ 12，回流提取 2 次，提取 0. 5、1、
2、3、4 h条件下提取，放冷，滤过，定容于 250 mL 量瓶
中。再精密吸取 0. 1 mL，置于 10 mL 量瓶中，甲醇定容，
按“2. 1. 4”项下方法在 260 nm 波长处测定吸光度，测得
总异黄酮提取率分别为 4. 21%、4. 85%、5. 51%、5. 55%、
5. 53%，故选择提取时间为 2 h。
2. 2. 4 提取次数 精密称取紫穗槐根粉末 5. 0 g，共 4 份，
在 70%乙醇，料液比 1 ∶ 12、提取 2 h，提取 1、2、3、4 次
条件下提取，放冷，滤过，定容于 250 mL量瓶中。再精密
吸取 0. 1 mL，置于 10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2. 1. 4”
项下方法在 260 nm波长处测定吸光度，测得总异黄酮提取
率分别为 4. 82%、5. 48%、5. 52%、5. 61%，故选择提取
次数为 2 次。
2. 3 响应面法优选最佳提取条件 结合单因素试验结果，
采用 Box-Behnken响应面法进行试验设计，以紫穗槐根总
异黄酮提取率为响应值 (X)，选择乙醇体积分数 (A)、
料液比 (B)、提取时间 (C)、提取次数 (D)这 4 个因
素，设计 4 因素 3 水平，并采用 Design-Expert 8. 0. 6 软件进
行设计与分析［10-11］。因素水平见表 1。结果见表 2。
表 1 因素水平
水平
因素
A乙醇 /% B料液比 C提取时间 /h D提取次数 /次
－ 1 60 1 ∶ 10 1 1
0 70 1 ∶ 12 2 2
1 80 1 ∶ 14 3 3
表 2 响应面试验结果
编号 A B C D 总异黄酮提取率 /%
1 － 1 － 1 0 0 4. 71
2 1 － 1 0 0 5. 18
3 － 1 1 0 0 5. 01
4 1 1 0 0 5. 37
5 0 0 － 1 － 1 4. 77
6 0 0 1 － 1 4. 81
7 0 0 － 1 1 4. 83
8 0 0 1 1 5. 47
9 － 1 0 0 － 1 4. 49
10 1 0 0 － 1 5. 07
11 － 1 0 0 1 5. 24
12 1 0 0 1 5. 38
13 0 － 1 － 1 0 5. 01
14 0 1 － 1 0 5. 04
15 0 － 1 1 0 5. 51
16 0 1 1 0 5. 49
17 － 1 0 － 1 0 4. 67
18 1 0 － 1 0 5. 15
19 － 1 0 1 0 5. 04
20 1 0 1 0 5. 34
21 0 － 1 0 － 1 4. 53
22 0 1 0 － 1 5. 08
23 0 － 1 0 1 5. 18
24 0 1 0 1 5. 36
25 0 0 0 0 5. 42
26 0 0 0 0 5. 40
27 0 0 0 0 5. 44
28 0 0 0 0 5. 46
29 0 0 0 0 5. 44
然后，利用 Design-Expert 8. 0. 6 软件进行分析，得到
回归方程 X = 5. 43 + 0. 19A + 0. 10B + 0. 18C + 0. 23D －
0. 027AB － 0. 045AC － 0. 11AD － 0. 012BC － 0. 092BD +
0. 15CD － 0. 21A2 － 0. 10B2 － 0. 15C2 － 0. 26D2。方差分析见
表 3。
由表 3 可知，一次项中，乙醇体积分数、提取时间、
提取次数对总异黄酮提取率的影响最大，P 均 ＜ 0. 000 1;
二次项中，提取次数影响最显著，乙醇体积分数、提取时
间次之，P均 ＜ 0. 01。另外，模型的失拟项不显著 (P =
0. 001 8)，而模型显著 (P ＜ 0. 000 1)，表明方法可靠;信
噪比值为 13. 779，大于 4，表明该模型能如实反映试验结
果;相关系数 r = 0. 928 0，表明回归方程的拟合程度良好;
ＲSD低于 10% (2. 26%)，表明试验稳定性良好。
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表 3 方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 2. 42 14 0. 17 12. 90 ＜ 0. 000 1
A 0. 45 1 0. 45 33. 69 ＜ 0. 000 1
B 0. 13 1 0. 13 9. 39 0. 008 4
C 0. 40 1 0. 40 29. 76 ＜ 0. 000 1
D 0. 61 1 0. 61 45. 58 ＜ 0. 000 1
AB 3. 025 × 10 －3 1 3. 025 × 10 －3 0. 23 0. 642 4
AC 8. 100 × 10 －3 1 8. 100 × 10 －3 0. 60 0. 450 3
AD 0. 048 1 0. 048 3. 60 0. 078 4
BC 6. 250 × 10 －4 1 6. 250 × 10 －4 0. 047 0. 832 3
BD 0. 034 1 0. 034 2. 55 0. 132 7
CD 0. 090 1 0. 090 6. 70 0. 021 4
A2 0. 280 1 0. 280 20. 66 0. 000 5
B2 0. 071 1 0. 071 5. 26 0. 037 8
C2 0. 140 1 0. 140 10. 41 0. 006 1
D2 0. 440 1 0. 440 33. 12 ＜ 0. 000 1
残差 0. 190 14 0. 013 — —
失拟项 0. 190 10 0. 019 35. 75 0. 001 8
理论误差 2. 080 × 10 －3 4 5. 200 × 10 －4 — —
校正相 2. 61 28 — —
综上所述，紫穗槐根总异黄酮的最优提取工艺条件为
乙醇体积分数 71. 96%，料液比 1 ∶ 12. 27，提取时间
2. 90 h，提取次数 2. 62 次，理论提取率值 5. 61%。
2. 4 验证试验 考虑到实际可操作性，对上述条件进行了
修正，最终确定最优工艺为乙醇体积分数 70%，料液比
1 ∶ 13，提取时间 3 h，提取次数 3 次。然后，以其进行验
证试验，测得紫穗槐根总异黄酮的平均提取率为 5. 59%，
平均含有量为 20. 3%，与理论值 (5. 61%)相近，表明该
工艺参数准确可靠。
3 讨论
Box-Behnken响应面法可得到最优的考察因素和响应
值，避免传统数理统计存在的问题，最终精确找到最佳点，
并可灵敏地考察各因素间的交互作用［12］，弥补正交设计的
缺限，具有试验次数少、周期短、回归方程精度高、结果
直观等优点［13-14］。
本实验提取紫穗槐根总异黄酮后，先采用单因素试验
考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数对其
提取率的影响，然后进行 Box-Behnken 试验设计，最后以
Design-Expert 8. 0. 6 软件进行数据回归和方差分析，测得回
归方程的相关系数为 0. 928 0，表明方程拟合良好。根据响
应曲面及等高线图，得到了各因素间的相互作用，可知其
影响大小依次为提取次数 ＞乙醇体积分数 ＞提取时间 ＞料
液比。
验证试验表明，该方法真实可信，误差小。最终，确
定最优工艺为乙醇体积分数 70%，料液比 1 ∶ 13，提取时
间 3 h，提取次数 3 次，在此条件下紫穗槐根总异黄酮提取
率为 5. 59%，总异黄酮平均含有量为 20. 3%，高于单因素
试验结果，可为紫穗槐根中总异黄酮的开发利用奠定基础。
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