全 文 ：Vol.20 No.5
CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
O8 Sep t.
野鸦椿对 HeLa细
胞的抗增殖作用
及其机制的初步
研究
左 敏 1/倪志宇 1/许 立 1/于 峰 1/
吕 飒 2/陈仕萍 2/广田满 3/
铃木信夫 2/董 玫 1 , ＊
(1.河北医科大学法医学系 ,河北 石家庄
050017 ;2.千叶大学医学部环境影响生物化学
教室 , 日本 千叶县千叶市;3.信州大学农学部
生理活性化学教室 ,日本 长野县伊那市)
· ·
Anti -proliferative Activity and
the Mechanisms of Euscaphis
Japonica Kanitz in HeLa
Cell Line
ZUO Min
1 , NI Zhi-yu1 , XU Li 1, YU Feng1 , LU Sa 2 ,
CHEN Shi-ping2 , Hitota Mituru3 , Suzuki Nobuo2 ,DONG Mei 1 , ＊
(1.Faculty of Forensic Medicine , the School of Basic Medical
Sciences , Hebei Medical Univercity , Shijiazhuang 050017 , China;
2.Department of Environmental Biochemistry , Graduate School of
Medicine , Chiba University , Inohana 1-8-1 , Chuoku , Chiba 260-
8670 , Japan;3.Department of Bioscience and Biotechnology , Faculty
of Agriculture , Shinshu University , Nagano 399 -4598 , Japan)
收稿日期:2007-11-28;修订日期:2008-01-08
基金项目:国家教育部归国留学基金(2000479)
作者简介:左 敏(1967- ), 女, 讲师 ,硕士 , 研究方向:中药抗肿瘤成分的
研究。
＊Correspondence to:DONG Mei , E-mail:meidong@hebmu.edu.cn0 3 5 0
【摘要】背景与目的:从野鸦椿(euscaphis japonica kanitz)枝叶的甲醇提取物分离纯化得到 3种酯类化合物 7-hydroxy-2-octen-
5-olide (1),methyl 5 , 7-dihydroxy-2 (Z)-octenoate (2)和 3 ,7-dihydroxy-5-octanolide (3),对这 3种酯类化合物的抗肿瘤细胞增
殖作用及其机制进行研究 。 材料与方法:利用四唑盐(MTT)比色法测定这 3种酯类化合物对 HeLa细胞增殖的抑制作用;采用流式细
胞术检测化合物 1对 HeLa细胞的凋亡和 P53蛋白表达的影响;利用电镜观察化合物 1引起 HeLa细胞的形态学改变 。 结果:化合物
1和化合物 2对体外培养的 HeLa细胞的增殖均具有明显地抑制作用 , 并有较好量效关系 , 对 HeLa细胞增殖的半数抑制浓度分别为
49.34 μmol/L和 24.53 μmol/L;流式细胞学检查发现化合物 1处理后的 HeLa细胞发生凋亡 ,且 P53蛋白表达增加 , 与对照组比较差
异有统计学意义 (P <0.01);电镜下可见化合物 1引起 HeLa细胞凋亡的形态学改变 。 结论:野鸦椿的提取物 7-hydroxy-2-
octen-5-olide(1)和methyl 5 , 7-dihydroxy-2 (Z)-octenoate(2)能抑制体外培养的 HeLa细胞的增殖 ,其作用机制可能与调节HeLa细
胞 P53蛋白表达及诱导 HeLa细胞的凋亡有关 。
【关键词】野鸦椿;酯类化合物;抗肿瘤细胞增殖活性;细胞凋亡;P53
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1004-616X(2008)05-0350-04
【ABSTRACT】 BACKGROUND AND AIM:In order to investigate the anti_proliferative activity against HeLa cell line and to
explore the possible mechanism of three natural compounds:7_hydroxy_ 2_octen_5_olide (1), methyl 5 , 7_dihydroxy_2 (Z)
_octenoate (2)and 3 , 7_dihydroxy_5_octanolide (3)isolated from leaves of Euscaphis japoneca Kantiz.MATERIALS AND
METHODS:The anti_proliferative effects of the three compounds on HeLa cells were tested by MTT assay in vitro.The
apoptosis induced by above three compounds was studied by FCM.The morphological changes of HeLa cells were
examined by transmission electron microscope.RESULTS:Compounds 1 and 2 exhibited dose_dependent anti_proliferative
activity on cultured HeLa cells.The concentrations of compounds 1 and 2 resulting in 50% survival rates (IC50)for
HeLa cells were 49.34 μmol/L and 24.53 μmol/L , respectively.Comparing with the control group , the apoptosis rate
and the expression of P53 in HeLa cells were markedly higher for compound 1 group (P<0.01).The morphological
changes of HeLa cells incubated with compound 1 showed chromatin condensation , marginal and nuclear fragmentation.
CONCLUSION:7_Hydroxy_2_octen_5_olide and methyl 5 , 7_dihydroxy_2 (Z)_octenoate isolated from the leaves of Euscaphis
japoneca Kanitz could inhibit the proliferation of HeLa cells in vitro.Its anti_prolifrative activity might be associated with
upregulating the expression of P53 and inducing the occurrence of apoptosis.
【KEY WORDS】 euscaphis japoneca kanitz;esters compounds;anti_proliferative activity;apoptosis;P53
论 著
癌变 畸变 突变
第 20卷 第 5期
CARCINOGENESIS , TERATOGENESIS ＆ MUTAGENESIS
O8 9 月
野鸦椿 (euscaphis japoneca kanitz)为省沽油科野鸦
椿属植物 , 是一种落叶小乔木 , 分布于我国的暖温带地
区及日本的关东地区 [ 1]。我们从其枝叶的甲醇提取物分
离纯化得到 3种化合物 , 经各种波谱分析 , 3种酯类化
合物分别为 7_hydroxy_2_octen_5_olide(1) [ 2] , methyl 5 , 7_
dihydroxy_2(Z)_octenoate(2)[ 3]和 3 , 7_dihydroxy_5_octanolide
(3)[3](图 1),其中化合物 2为具有α和 β 不饱和共轭结
构的酯类化合物 , 化合物 1与化合物 2的区别为具有α
和 β 不饱和共轭结构的内酯类化合物 。本研究拟探讨 3
种酯类化合物对体外培养的 HeLa细胞增殖的抑制活性
及其抗肿瘤细胞增殖的机制 。
1 材料与方法
1.1 实验材料
野鸦椿新鲜枝叶于 1997年 9月采自日本和歌山县
京都大学亚热带植物研究所 ,留存样品由京都大学亚热
带植物研究所的梅本信也先生鉴定。HeLa细胞株由河
北医科大学第四医院科研中心提供 。
1.2 药品和试剂
MTT为美国 Sigma产品 , 批号:M_2128;顺铂为
Sigma产品:批号 034k3693。SDS为美国 Biotec公司产品;
胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;
RPMI 1640和胰蛋白酶为 GIBCO公司产品;P53抗鼠抗
体为美国 Sanata Cruz Bio 公司产品。
1.3 主要仪器设备
CO2恒温培养箱:美国 SHELDON ,型号:TC2323;搏
塞酶标仪:奥地利Anthos labtec Instruments公司生产 ,由
郑州搏塞生物工程有限公司共同开发 , 型号:Biocell ht2
型;倒置相差显微镜:日本 OLYMPUS 生产 , 型号 :
SCR20B型 。SW_CJ_IF净化工作台:苏静集团苏州安泰空
气技术有限公司;美国 BD公司生产的 FACS_420型流式
细胞仪;培养板:美国 Costar公司产品。
1.4 实验方法
1.4.1 提取分离 取新鲜的野鸦椿枝叶部分 5.6
kg ,用 95%甲醇室温浸泡 24个月。减压回收甲醇 ,获得
甲醇提取物 560 ml。依次用环己烷 、乙酸乙酯对甲醇提
取物萃取 , 回收溶剂 , 获得环己烷部分 14 g和乙酸乙酯
部分 99 g。乙酸乙酯部分经硅胶柱层析 ,用乙酸乙酯/环
己烷 10%梯度洗脱 , 70%乙酸乙酯/环己烷部分得油状
化合物 1 (149 mg);40%乙酸乙酯/环己烷部分得油状
化合物 2 (21mg);50%乙酸乙酯/环己烷部分得结晶化
合物 3(602 mg)。通过波谱分析 ,3个化合物分别鉴定为
7_hydroxy_2_octen_5_olide (1), methyl 5 , 7_ dihydroxy_2(Z)_
octenoate (2)和 3 , 7_dihydroxy_5_octanolide (3)。
1.4.2 体外抑瘤实验 参照文献[ 4]中的方法。
将 HeLa细胞悬浮接种于 96孔板 , 每孔 90 μl(含 1×104
个细胞),分别加入 PBS 、溶剂对照(终 0.5% DMSO)、阳
性对照顺铂(cisplatin ,含 0.5% DMSO)和浓度为 100、10
和 1 μmol/L的化合物 1 ～ 3各 10 μl , 每组均设 3个复
孔 ,置于饱和湿度 、37 ℃ 5% CO2培养箱中培养 72 h。
于培养结束前 4 h , 各培养孔加入 5 mg/ml四氮唑盐
(MTT)10 μl。培养结束后 , 弃去培养上清 , 每孔加入
15% SDS 100 μl ,过夜。次日用酶联免疫检测仪测定各
孔吸光度值 (OD值), 测定波长λ=570 nm , 参考波长
λ=630 nm ,并计算生存率:
生存率(%)=(实验组 OD值/对照组 OD值)×100%
1.4.3 流式细胞术实验 按左连富等 [ 5] 的方法
制备单细胞悬液进行细胞 DNA染色 ,主要步骤如下:将
单细胞悬液离心 , 弃上清 , 重悬浮于 5 ml生理盐水中 ,
缓慢加入-20 ℃预冷的 95%乙醇 15 ml , 使终浓度为
70%, 溴化乙啶一步法进行 DNA染色 ,利用流式细胞仪
进行测定 , 以凋亡率表示化合物 1对 HeLa细胞凋亡的
影响。
1.4.4 化合物 1对 HeLa细胞 P53表达的测定
参照文献 [ 5] , 仪器光源为 2 W氩离子激光器 , 激发波
长 480 nm , 工作功率 300 W , 所获数据输入 HP_
300Consort 计算机 , 应用美国 Beckman Coulter公司提供
的相应软件进行处理 。取 0.1 ml分散的单细胞悬液
(1×106细胞/ml)加入 0.1 ml浓度为 1∶100的 P53单
克隆抗体 ,混匀 , 37 ℃水浴 30 min。加入 PBS缓冲液 5.0
ml混匀 ,离心 1 000 r/min ,3 min后弃上清液 。加入 0.1
ml浓度为 1∶50的羊抗鼠 FITC_IgG进行荧光染色 , 37
℃水浴 30 min , 重复 PBS冲洗 2次。加入 1 ml PBS混
匀 ,经 400目铜网过滤后上机检测。同时设空白对照 ,以
0 3 5 1
图 1 化合物 1～ 3的结构
Figure 1 The structures of compounds 1-3
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Group
Dose
(μmol/L)
Apoptosis rate(%) FI of p53
24 h 48 h 24 h 48 h
Control
Compound1
-
100.0
10.0
1.0
0.31±0.17
11.17±1.07＊
6.23±0.68＊
4.51±0.22＊
0.52±0.09
20.46±3.15＊
14.29±0.49＊
8.91±0.48＊
1.00±0.04
1.36±0.05＊
1.27±0.31＊
1.19±0.02＊
1.00±0.21
1.59±0.03＊
1.29±0.20＊
1.23±0.09＊
表 1 化合物1对HeLa细胞凋亡率的影响 (x-±s , n=6)
Table 1 The effect of compound 1 on apoptosis rate and fluorescence index of p53 gene of HeLa tumor cells
Compared with control , ＊P<0.01.
图 2 化合物 1～ 3对 HeLa细胞增殖的影响
Figure 2 The effect of compounds on the proliferation of HeLa tumor
cells.Compared with blank control, ＊P<0.05 , ＊ ＊P<0.01
0 3 5 2
HeLa细胞出现核染色质浓缩 ,边集 ,核固缩 ,如图 3A所
示 , 并且出现线粒体肿胀 , 空泡样变 , 胞浆出现大量空
泡 ,如图 3B所示。
3 讨 论
恶性肿瘤是危害人类健康的一类疾病 ,当今世界上
治疗恶性肿瘤的方法以手术 、放化疗为主 , 而从天然动
植物中筛选抗恶性肿瘤的新药 ,日益引起世界各国学者
的关注 。
野鸦椿为省沽油科野鸦椿属植物 ,本实验室曾报道
野鸦椿酯类化合物显示较明显的抗炎作用 [ 6] , 而对野鸦
椿酯类化合物抗肿瘤活性的研究未见报道 ,本实验利用
体外细胞培养方法观察了野鸦椿酯类化合物对 HeLa细
胞增殖的抑制作用 , 实验结果显示存在α和 β 共轭结
构的野鸦椿酯类化合物对 HeLa细胞的增殖有显著的抑
制作用 , 并且在 10 μmol/L的浓度下 , 也能显著地抑制
PBS替代一抗。
1.4.5 化合物 1对 HeLa细胞株超微结构的观察
取 HeLa细胞(1×105/ml)5 ml , 接种到 50 ml培养瓶
中 ,加入浓度为 100 μmol/L和 10 μmol/L的化合物 1。
收集与化合物 1共同温育 24 h和 48 h的 HeLa细胞 ,
1 000 r/min离心 ,弃上清 ,收集 HeLa细胞 ,戊二醛固定
制备电镜标本 ,透射电镜下观察细胞超微结构的变化。
1.5 统计学处理
数据用 x-±s表示;两组间数据用 t检验 , 多组间
数据用单因素方差分析。应用 SAS统计软件分析。
2 结 果
2.1 化合物 1～ 3对 HeLa细胞增殖的抑制作用
结果如图 1所示 , 化合物 1和 2显示较强的抑制
HeLa细胞增殖活性的作用 , 化合物 1和 2的 10 μmol/L
和 100 μmol/L剂量处理HeLa细胞后 ,其生存率与空白
对照组相比较差别均有统计学意义(见图 2), 提示化合
物 1和 2有较强的抑制肿瘤细胞增殖的作用 。通过生存
率对化合物 1和 2浓度的对数回归方程分别为:Y=-
9.5762 ln(X)+87.55和 Y=-13.029 ln(X)+91.693 ,
得到化合物 1和 2对 HeLa细胞增殖的半数抑制浓度分
别为 49.34 μmol/L和 24.53 μmol/L。化合物 3对 HeLa
细胞的增殖未显示明显抑制活性。
2.2 化合物 1对 HeLa细胞凋亡的影响
流式细胞定量检测表明 ,不同浓度的化合物 1处理
24 h 、48 h的 HeLa细胞 ,随着作用时间的延长 ,HeLa细
胞的凋亡率也增加;HeLa细胞在各剂量组的细胞凋亡
率均明显高于对照组 ,见表 1。
2.3 化合物 1对 HeLa细胞 P53表达的测定
对照组及各不同浓度化合物 1组的 P53蛋白表达
的荧光指数(FI)结果见表 1。P53蛋白表达的荧光指数
与空白对照组相比差异显著 ,且各剂量组与 P53蛋白表
达 的 荧光 指 数之 间 存在 着 良好 的 量效 关 系
(P<0.05)。
2.4 化合物对 HeLa细胞超微结构的影响 电镜
观察进一步证实化合物 1对体外培养的 HeLa 细胞的增
殖有抑制和诱导凋亡的作用 。用化合物 1处理后的
图 3 化合物 1处理后的 HeLa细胞的超微结构
Figure 3 The morphological change of HeLa tumor_cells after incubation
with compound 1
论 著
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第 20卷 第 5期
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(上接第 349页)
0 3 5 3
HeLa细胞的增殖 。
细胞凋亡是机体在生长发育和受到外来刺激时清
除多余衰老和受损伤的细胞以保持内环境平衡的一种
自我调节机制 ,细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调
节和控制 [ 7]。抑癌基因 p53作为转录因子 , 能够特异性
地与靶细胞 DNA结合 , 使 DNA受损的细胞停止于 G 1
期 ,并启动细胞修复系统 。不能得到及时修复的损伤细
胞在 p53介导下进入凋亡程序 , 以达到清除损伤细胞 ,
抑制肿瘤发生 , 并促进细胞发生成熟分化的目的 [ 8]。本
实验结果发现:野鸦椿酯类化合物能够提高 HeLa细胞
p53基因蛋白的表达水平 , 进而促进瘤细胞凋亡 , 抑制
细胞增殖和恶性演化 。
经电子显微镜超微结构的观察 ,从形态学上进一步
证实了野鸦椿酯类化合物对体外培养的 HeLa细胞诱导
凋亡的作用 。用野鸦椿酯类化合物处理后的 HeLa细胞
出现核染色质浓缩 、边集 、核固缩 、线粒体肿胀 、空泡样
变 、胞浆出现大量空泡。以上形态学改变 ,同时结合流式
细胞学检查的结果 , 表明存在α和 β 共轭结构的野鸦
椿酯类化合物能够通过提高 HeLa细胞 p53基因蛋白的
表达水平 , 促进肿瘤细胞凋亡 , 抑制细胞增殖和恶性演
化。但 p53基因抑制肿瘤生长的机制比较复杂 ,因此存
在α和 β 共轭结构的野鸦椿酯类化合物激活 p53基因
促进其表达是通过促进细胞凋亡 ,还是抑制肿瘤细胞增
殖有待进一步研究。
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论 著
癌变 畸变 突变
能通过减少胃癌血管生成 , 影响肿瘤的营养供应 , 抑制
胃癌细胞增殖进而实现抗胃癌效应 。
综上所述 ,抑制细胞增殖 、诱导凋亡 、减少血管生成
可能是舒林酸抗胃癌生长的作用机制。在本研究中舒林
酸的剂量按体表面积折算 ,其等效剂量均在临床常用剂
量范围内。且小鼠的代谢较人类高 ,用药剂量偏大 ,若将
舒林酸应用于临床胃癌防治 ,应适当减少剂量 。
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