全 文 ：四川大学学报 (自然科学版)
Jo ur t la lo fSie hn u a Unie vs ti y t Natr u a lSe ie ne c E山 tio nV o 二 .26 No 。19 19 8
野花生豆 ( Co r t a lari am ucro n at a) 凝集案的
细胞表面受体的研究*
曾仲奎 黄维平 李 瑛 曾光耀
摘 要
研究了异硫氰基荧光素和 `名肚 标记的野花生豆凝集素 , 对 A 型细胞和牛精
细胞表面的凝集素受体的定位 、 分布和数是 。 结果表明这些细胞表面的凝集案
受体比较复杂 , 难以用一般动力学方法 加以 说 明。 D 一葡 萄箱 、 D 一甘 露 楷 、
D
一半乳糖和 坪乙酸半乳糖胺等糖类和 C o n A 、 P H A 、 B S A 对 标 记凝 集 素 与
A型细胞结合的影响各不相同 。 通过饱和曲线计算出A型细胞和牛精细胞表面的
凝集素受体数目 , 努别为 1 . 29 、 1价和 3 . 09 x 1.0 个 /细胞 .
关雄词 凝集素受体 , A 型血细胞表面受体 , 牛精细胞表面受体 .
引 言
近年来 , 凝集素用于精细胞表面膜的研究报道 日渐增多 , 所应用的凝集素有 C o n 人 、
w 0 A
、
BS A
、
R C A
、
P N 人等 [` 一 ` 了. 结果表明 , 不同种属动物的精细胞与各种凝集 素 的
作用各不相同 , 芡光标记的或同位素标记的各种凝集素 , 与不同种属动物的精细胞表面
受体结合后 , 一其受体的分布和数 目也 各不相同 . 前已报道纯化的 v B L测定兔红细胞和人 、
牛精细胞表面受体的分布和数目 I“ ` “ 〕 . 但应 用具有血型专一性的凝集素测定相应的血细
胞和精细胞表面受体的分布和数 目的研究甚少 . 本文应用纯化的具A 型血专一的C M L ,
进行 IF T C 和 ’ 25工标记 , 对 A 型血细胞和牛精细胞表面的 CM L受体性质进行了研究 .
材 料 和 方 法
C M L按本室报道的方法制备 7[] . A 型血细胞取 自中国医科院成都输血研究所 ; 牛精
细胸取自四川省家畜冻精液 中心站 . S e p h a d e x G 一 2 5 、 s e p h a r o s e 4 B为 P h a r m a e i a 产品 ,
D
一 G a l
、
G a 1N A e
、
C o n A为 s i g m a 产品 , N a ’ 2 51由2 9 1信箱馈赠 , 其余试剂为分析纯或化
学纯 。
竿 1材月 野 花生豆C ( rot a la ri a l二 、e o r l。 。t a )凝集素的细 月介表西 灸休的 不冷究 。 1
通 、 人A 型细胞和牛精细胞的凝集活性实验 取A 型 血 经P B S离心洗涤三次. 用
0
.
1弓M NoC I 液稀释 为 2 %的 f l陌凭悬液 , 挥冰箱各田 . 取牛悄细撇 置显微镜下检查细 胞
活力并计数 , }月无糖B ak e r域夜稀开 ; 弓· 气义 1(} “个 / m l精细脸浓心 , 置 3 ` ℃保温备明 .
在微 t 血清稀释版 _卜用无精 B a k er ,s 花又「 C M州容液 ( 1 0即 z` g / m均 进行系列稀释 , 分
别加入 A型拍! . 细咆方平精细伪井 i1/ 一 板坪后 一温温育 ( 2 5℃ 厂厂l二右 、 ?,J 、 ’寸 , 显微锐下检查
凝集结果 .
于载玻片 七分别滴加液休石蜡 .31, 1 , 系列稀 释灼 CM L溶浓 2叮 , 牛精细胞 2皿 , 迅速混
匀 , 3 6℃保温 10 分钟 , 在倒置显微镜下现察并照相记录 .
2
、
c M L的 IF T c 标记 IF T C 一 C M L按文献「8〕灼透析法标 记 最后对 P B S充分透析 以
除尽游离的荧光素 。
3
, 牛精细饱和 A 型血细胞膜上受体的分布实验 于载玻片上分别涂布 已稀 释 :至 适
当浓赏的 A 型细胞和牛精细袍 干后再涂布 FI T C 一 C M L 加盖 玉划人r 荧光显微镜下观察
并照相记录 。
4
、
CM L的 ’ ” 51标记 落木按文献口〕的方法 . 在反应终止后加入 1% KI 至总体积 5 0 0刃 ,
取娜 l 测标记率 , 其余溶液经 eS p h ad Xe G 一 2弓柱分离 p H 7 . 4 , 。 . I M P B 液洗脱 . 分 部
收集 。 对 F H 一 4哪 自动定标 器 井 型 探头测定 , 向第一峰放射性晨高的收集管 中 加 入
0
.
6m以 % 的B S A , 再取 出少量加三氯醋酸沉淀离心 , 测放 化纯度 . 其 余 ` 2 51一 C M L 溶液
置冰箱保存备用 .
5
、 细胞浓度对` 25 1一 CM L与其受体结合的影响 L” l 取不同浓度的 A 型细胞 0 · 2m l , 加
入 ` 2 5 1一 e M L 0 . 0 5m l , 无糖H a 、: k ’ s液 ( P l l o . 5 ) 0 . 1 5m l , 总体积为O · 4m l , 2 6℃温育1小时 ,
测总脉冲数及过滤 (用乙酸纤维薄膜抽滤 ) 的沉淀经无糖H an k, s液洗涤三次后的脉冲数 ,
二者之比求得结合率 , 再以细胞浓度为横坐标 , 结合率为纵坐标 作图 .
礼、 单糖和外源凝集素对 ’ 2狂 - CM L与 A型细胞结合的影响川 于反应管 ` l ,加 A 型烟 ’·恤
U
.
Zm l、 2 、 1 0 ,个 / m l ) , 再向 各管分别加入不同、浓度的 D 一 G l e 、 D 一M a ,飞、 D 一 G a } 、 G o 1N A e
或 e o n A 、 P H A 、 B s A 各0 . l m l , ` 2 51 一 CM L O · l m l ( 3 · 3林g ) , 2 6℃温不厂 。分钟 · 测总、脉冲
数及过滤经洗涤 临沉淀的脉冲数 . 求得结台率 , 再 以空自结合率为 1 。。% , 求得州 一川去合
率 . 以相对结合率为纵坐标 , 不同浓度的糖或外源凝集素为横 篮标作日 .
7
、 饱和实验 ; 5 1 于各反应管中分别加入 A 型细胞 ( 3 · 05 x 1 0 6个加 1) 或 牛 精 细 胞
( 3
. “ , 5 x 1 0 5个 /m l ) 0 · Zm l , 再分别向各管加不同量灼山 I 一 CM L , 并以 p H ` 弓的 D 一 I l a , I k ’ s
液补加至各管使总体积为 0 · 4 m l , 乳 、 C 温育1小时 卜 测总脉冲数和过滤洗涤后沉淀的脉 : !`
数 . 求得结合率 (B ) . 以 B为纵坐标 加必、 、沙’ 2 , I 一 C M L从为横坐标 半对数 作图 得饱
和曲线 , 据此 曲线进行 s c a t e h a r d作图 : ’门 : .
8
、 竟争性结合实验 `“ 向各反应怜中分别加 A 型细饱 ( .4 1 义 1护个 /叫 ) 或牛精圳把
( ,
· “ “ 1 0 5个 /m l )各 .0 2 m l . 不同浓度术标记 匀 C M L .0 O 5m l , Z O c 保温 1小时 , 侧总脉冲
及过滤洗涤后沉淀沟脉冲数 · 以沉淀脉冲数 为纵坐标 , 加入未标记 C M L量为横坐标 · 半
对数作图 . 得竟争性结合曲线 .
9 2 四 川 大 学 学 报 1 9 8 9 年
结 果 和 讨 论
1
.
C M L 分别对 A 型细胞和牛精细胞的凝集洁果见附表 . 信细胞的 凝 集 类 型 见
图 1 . 从图中可见 C M L 对牛精细饱的凝集类型为头对头的凝集 . 当 C M L 的浓度分别为
。 . 97 阳 /m l或。 · 4 9拼g / m l时 就能 才这两 仲细胞友二, 「 _凝集反 应 . 实验结果表明这些细胞 表
面存在 C M L 的受体 .
2
. 牛精细胞和 人A 型红细胞膜 上C M L受沐为分市 标记后的 IF T C 一 CM L 凝集活性
仍保持不变 . IF T C 一 C M L与 A 型或牛精细胞作用后 , 在荧光显微镜下 (酉德 o p ot “ ) , A型
细胞的周围呈现荧光圈 , 丧明该细胞膜上 CM L 受体是均匀分布 ( 图 2 ) . 而精细胞则在
顶体区及核后区呈现荧光亮区 (图 3 ) . 结果表明 , 牛精细胞膜上 C M L 受沐的分布是不
均一的 呈区域性分布 .
3
、
C M L 的 `2 51标记物经 se 曲 。 d ex G 一 2弓夯一离 , 得两个放射性峰 第一 降为 ’ 2 51一 C M L ,
具有强烈的凝集活性 . 经计算其标记率达 三。 . 3% , 其放 化纯度为 9丁· 4% , 比放射性 为
`
2
,
8胆 i/ 件g 。 实验表明 · 在上述标记条件下 , ’ “ 51一 CM L的标记率 、 放化纯度和生物活性都
·能满足实验需要 , 故 ’坷 一 CM L可供实验用 .
附表 c M L对 A型血细胞和牛精细胞的凝集作用
B l o o d t y P e一 A
S P e r m a t o z o a
十 + + + + 十
+ + + + + +
+ +
+ +
十 十 一 一 一
+ + 十 一 一
图 1 牛精细胞的凝集类型 ( >< 5 00)
图 Z A型血细 胞表面 IF T C 一 C M L
受体的分布 ( K 8 0o )
图 3 牛精细 胞表面 F IT C 一 C M L
受体的分布 ( X 7 50 )
第z 期 野花生 豆(e ro t al ari am e r uo n at a)凝集素的细胞表面受体的研完 今全
4
.细胞浓度对飞5 2 1一 CM L与其受体结合的影响 实验结果见图4 .从图中可见 , 其结
合丰随细袍浓度的增加而升高 但当细胞浓度达 1 06 个细胞 /m l时 , 其结 合率不再变化 .
,
. 单糖和外原凝集素讨 12 气 I 一 C M i 与 A型细胞结合的影响 实验 结果 泛 “ 别 见 图 三和
图 6 . 从单糖的实验结果看出 G cl 、 M a n 、 G al 和 G al N A C对 ’ 2“ 1一 C M L 与 A 型细胞的结合 ,
均有不同程度的影 响 而以 G a 1N 八 c 和G al 表现较
细脸 浓度 ( ,小 r ” 加肠
图 4 红细胞 浓度时受体络
合率的影响
反应 系统 : O。 Zm 1 A型红细胞 + 0 . 主 m l
l吕. 1一C M L + 0
。
15 m l D一 H a n k , s溶液 ,
2 6
O
C保温 6 0m i n 。
强灼抑制作用 当 G o 1N 人“ 浓度由 1 。~ 3增至 1 。 , ’ M
时 . 其相对结合率 由幼 · 3% 念、剧下降 至 4 % , 而
G o l 则表现总的下降趋势 .
图 ` ·中 , P H A 不日B s A 表现不同 性度的抑制 ,
当 P H A 由 1林g /m l增至 10 m幻m l 时 相对结合率由
;f0
一
70 %下降至 3 0 一 1 5% . 而 C on A 则能促进 A 型
细胞与 ’ 251一 C M fL’ 心结合 .
6
. 泡 沁实验 不同量沟 `2 51 一C M L 与 A型细胞
的结合曲线见图 7 . 为 “ S ” 型曲线 . 此 曲线 表 明
此 I 一 c M I 与 A 型 细 胞 膜 上 受 体 的 结 合 , 对
C M L而言是一个饱和过程 。 据此曲线 , 按 sc at he ar d
法作图 得一不规则 的 图 8 .
谧洲 ( 一 / 奋
.一 ,
’气 丫 … ` 、 、
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…le.!卜 JI.30撇渐城姗拼跳
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1 1、 一 5 ! 。 一 心 一。 一 , 一门一 少 1〔)
恢 犷 互 彻
L
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_
1 1 0 J 0 2 1 0 , 1〔
凝集贵饭 ( / g / 二! )
耳 几 咯糖 对 ’ 2 51 一 C M I习与 A 型
血细饱结 合的影响
图 6 外源凝集素时 ’ “ 5 1一 C M L与 A型
血细胞 结合 的影响
反应系统 : o . Zm J A型血细胞 一 { 0 . l m l
单楷 干一 。 . l m l l” 1 一C M I一
对照用公 I J o n k ’ s液代替糖溶液 .
① ( ; le ②入丁a n ③ G “ IN A 、士 ④「 f、 ; `, !
反应系统: 0 。 Zm l A型血细胞十 0 . lm l
外源袭集案十 0 . 1创 1 ` , 叮一 _ CM L .
对照用 D一 H a n k’ s液代替饭集素溶液 .
① C ol l A ② P H A ⑨ B S A
根据图 了, ’ z江 C M I 与 A 型细袍 的饱
算全占含书于滋 :
结 得出饱和结合量为 3 , 2拼g , 按下 式 i 一 }
蚕 4四 川 大 学 学 嗜良9 9 1 8 年
结合容量 二 B(环g) 只10
一 6x 6
。
02 x0 123
面几犷丈亡众 L j又~ 细面不蔽-
=鱼卫 (塑丝三些
49s 0 0 0 X
一 6x 6
。
2 0 义0 13 2
3
.
05 x10 6
=1
·
9 2 X0 1 了分子/ 每个细胞
B(结合量) 为3 ·2 拜g , 4 9 , 0 0 0为 c M L分子量 3 · 0 5 “ 1 0 6为细胞浓度 ( m l )
若用不同量的 ’ 2 51一 C M L 与牛精细胞结合 , 也得到 “ S ”形 勺饱和曲线 (图 9 ) , 也表明
,
szI
一
C M L 与牛精细胞的结合对 C M L 来说是一个饱和过程 . 据图 9 可作出 cS a t ch ar d 图
(图 1 0 ) , 并按上法亦能初步计算其结合容量 ,
姑合文量 二 i丝亘旦2竺四三竺兰些,旦全竺丝旦11
- 曰 ~ 卜 J 一 M 。附 ( C M L ) 义 细胞个数
O
。
1 4 2 x 1 0
一 6 又 6 。 0 2 又 1 0 2 3
4 9一 0 0 0 又 5 . 6 5 x 1 0 5
二 3 · 。 9 x 1 0 6分子 /每个细胞
从两种细胞的 cS at he “ dr 图 (图 乙和 1 0) 可能提示 , C M L 在 A 型纲胞和牛精细胞 膜
上的受体是不均一的 阳复杂的 , 似不能用简单的动力学方式表达 .
7
. 竟争性结合实验 结果见图 n 和图 1 2 . 从图巾的竟争性结合曲线看 . 两种细胞
均呈现不规则曲线 , 这一结果与饱和实验相符 , 都提示这两类细胞表面的受体是比较复
杂的 , 对其 s ca ct h ar d作图的结果都难予解释 .
CM .I 是一种对人类 A型血细胞专一 凝集的凝集素 , 具性质 已 经 报 道 7[] 二虽 然 巳
有某些凝集素受体的研 究报道 〔川 , 但对有关 血型专一性凝集素的红细胞表面受体或牛精
细胞表面受体的研究甚少 . 本文用 F IT C标记 、 实验结果表明 C M L在人 A型细胞表面的
. 二刀g
B / F
’
0
。
2
.lwe三卜,.
!刀、J
、二州弋圳
1 O
1 0 ’ z了左 ) / 0 . 碑二 l 1 25 1一 C材 L
.尸广写一亨 - 梦- 叫
归汽了 召
图 7 125 卜犷砰L和A型血细胞的 ’ 吉合曲 线
反应系统 : 一 0 . 2瓜 I A型血细胞+ 不同量
1盆. 1一 C前 L 一卜 D一 H a n k , s 液加至总体积为
0
。
4m l
。
B , 结合量
图 8 S e a t e h a a d 图
B : 结合量 (林M )
I
了: 游离量 (一乙M )
第 1吴月 纤花生豆 (Cr o tl a ai j amu cr on a比) 凝集素的细 胞表 面受体的研 究 朽
O
。
1气
()
.
1砚2 之活g
一几二尸乡 -
/
/于 {/少 。· 。 5匕二一 1 O
(丫 工 O诊了g) “ 0. 诗护一了,
} 。自
1 2 工_ 〔
图。 ’ “ 51一 C M L和牛精细胞 的 结 合肉线
反应系统 : 0 . 2m l 精细胞十不同长的
12 `卜C M L + D 一H a n k’ s 液至总体积为
0
.
4 ml
. 召 : 结合母
图 1 0 S e a t e h a r d 图
B : 结量合 (拜M )
F , 游离量 (井M )
10.80喇幼
韶之几菊户·。叫x、
、 / 尸 \ \ 一
律找竞钻(。6Txà
1 0 0 1 0
1 I t
C 乃f L显` 笋`公、
1 0 0 1 { 勺 1 0 0 00
|
匀
||||匕州儿幼F`42
图且 C M L和 ’ 2 5 1一 C M I 时A 型血 细
胞的 竟争性结 合曲线
反应系统 : A型细胞 o . Zm j ,
C M L O
。
0 5m 王, 1 2 . 1一 C M I
o
.
0 5m l ( 1
。
63拜g )
受休分布是均匀的 , 但在牛精细胞表面的 C M L受体 ,
订盯 I 里 ` 。 尸 `
图 1 2 e M L和 ’ 2 5 1一 CM L时牛精
细胞 的竞争性结 合曲线
反应系统 : 精细胞 o . Zm卜
C M L o
.
o s m l
, 1 2 5 1
一C M L
0
。
0 5m l ( 1
。
63并g )
则以不均匀的区域性分布存在 , 这
与已报道的 v B L等的结果一 致 [ ’ , c 1 . 卜上述结果 也能提示 , 血型专一性凝集素 , 在其相 应
均血型细胞和牛精细胞表面受体的分布 , 与非血到专一性的凝集素 , 在红细胞和牛精细
胞受体的分布比较 , 并无特异之处 , 但这些受体 性质和结构 , 则有待 深入地工作才能
阐明 。
参 考 文 献
t 1 1 K o
e h l e r
,
J
.
K
.
I n t e r n a t i o n a l R e v i o w o f C y t o l o g y , 5 4 ( 1 9 7 8 )
,
7 3一 108
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四 川 大 学 学 报 19 8Q年( 9 )
1
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护.` r压Lr..口
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[ 10
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C
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A n n
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N
.
Y
。
A
c日 d . S c i 。 5 1 ( 19 4 9 )
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H i g g i n s
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D
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A
.
, D e v
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C o ln p
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S T U O Y O N C E L L S U R F A C E R E C E P T O R O F T H E C R O T A L A R IA
M U C R O N A T A L E C T IN
z e , : 9 2孔o n g 无u i 厅 : a ,: 9 w e ; Pi ,: g 乙 i 丫 i n g z e o g 七 : a n g万a o
人 B S T R人 C T
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e C r o t a l a r i a m u e r o n a t a L e e tl n ( C M L ) n o t o
n l y a g g l u t i n a t es h u m a n ty P e A eyt t h or
e y t e s
s p ce i f i c a l互为 b u t a l s o a朗 l u t i n a t es e a t t l e s p e mr s v e r y s t r o n g l y 。 W h e n t h e c o n c e n t r a ti o n o f C M L
15 0
。
4 9拼g /m l , e a t t l e s p e mr s a r o a g g l u t l n a t e d i n a h e a d t o h e a d aw y
.
B y s t u d外 n g t h e d i s t r l b u t lo n o f
t h e s u r f a e e er e印 t o r s o n t ” e A e即 t h or e yt es a n d e a t t l e s p e r n n s w i t h FI T C 一C M L , i t s h o w s t h a t
t h e bl dn i
n g s i t es o n t ” e A e e l l s a r e we l l d i s t r ib ut e d w h l l e t ho s e o n t h e c at t l e S p et ln s m a i n l y
e x l s t 土n a cr o s o m e a ” d r o s t n t一e l e a r e a p . B i n d i 几 9 o f 1 1 . 1一C M L t o t yP e A e e l l s w i t h d i f e r e n t
c o n e en t班 t ot n s o f t h e e e l l s s t、 o ws t h a t th e r c l a t i v e ib n d i n 吕 r at e s t r e n d t o b e c o m e s at u r a t e d
a s t h e e o n e e n t r a t i o n o f t yP e A e e l l s i n e r e a s o s
.
T h e e o m p e ti t i v e b i n d i n g s o f e e rt a i n a m o u n t
o f l名. 1一 C M L a t d i f f e r e n t e o n e e n t ir o sn o f C M L t o t y p e A e e l l s o r e a t t l e s p e皿 5 w e r e s t u d i ed 。
hT
e S e a t e h a r d P l o t s i 几 d i e a t e t h a t t h e C M L一 r e e e p t o r s o n t h es e e e l工5 m a y b e s o e o协 p l i e a t e d
t h a t t h o y a r e h a r d l y b e e a s i l y e x p ] a i n e d b y o r d i n a r y k i n e t i e m e th o d s
.
D
一
G l e
,
D
一
M a n
,
D
一
G a l
,
6 a 1N A e
,
C o n A
,
P H A a n d B S A a f f e e t l盆. 1一M L , 5 b l n d i n g to i t s r e e e p t o 招 o n
t yP e A e e l l s b u t th er e a r e d i f f e r e n e e s i n i
n f l u e n e i n g
.
B a s e d o n t h e s a t u ar t
e e u vr es
,
th e
n u m b e招 o f C M L r e e eP t o r s p er e e l l o f h u m a n b】o o d g r o u p A a n d e a 川 e , 5 s p e r m h a v e b e e n
e a l e u la t e d a s fo l lo w s
.
R s P e n .
:
3
。
0 9 x 1 0 . n u m b e r o f m o l e e u l e s / P er e e l l
R er y t h句 e尹 e : 1 . 2 9 x l 0 , n u m b c r o f m o l e e u l es / p er e e l Z
K e y W
o r d s L e e t i n r e e e p to r
,
T y P e A e介 t h r o e y t e s u r f a e e r e e e P t o r , C a t t l e s P e n 力 s ur f a e e
r eC印 to r 。
哈