全 文 ：头花蓼对 H． pylori 感染大鼠模式识别分子 DC-SIGN、
TLＲ4 表达的影响*
＊
任艳君＊＊，莫 非＊＊＊，何 芸，赵书琴，江明礼，孙朝琴
(贵州医科大学 临床检验教研室，贵州 贵阳 550004)
［摘 要］目的:观察头花蓼对幽门螺杆菌(H． pylori)感染 SD 大鼠对免疫应答模式识别受体 DC-SIGN、TLＲ4
蛋白和 mＲNA表达的影响，探讨头花蓼抗 H． pylori可能的机制和调节作用。方法:SD大鼠分为空白组、模型组、
药物组及药物空白组，模型组及药物组用 1 × 1011 cfu /L H． pylori 菌液进行灌胃，空白组和药物空白组用脑心浸
液肉汤灌胃，8 周后，取大鼠胃黏膜显微镜观察组织学改变，鉴定造模是否成功;造模成功后，药物组和药物空白
组大鼠取头花蓼灌胃处理，空白组和模型组给予生理盐水灌胃;采用免疫组织化学法和实时荧光定量 PCＲ 法
(real-time PCＲ)测定大鼠胃黏膜中 DC-SIGN、TLＲ4 蛋白和 mＲNA 表达，观察各组大鼠胃黏不同部位的表达情
况。结果:大鼠感染 H． pylori后，胃黏膜腺体排列不规则，黏膜下层可见血管充血及大量淋巴细胞浸润，表明造
模成功;免疫组织化学和 real-time PCＲ结果显示 H． pylori 上调了 TLＲ4 、DC-SIGN 的表达(P ＜ 0． 05)，经头花蓼
处理后，表达明显下调(P ＜ 0． 05);TLＲ4、DC-SIGN 主要在胃黏膜上皮细胞胞浆中表达，H． pylori 感染大鼠后
TLＲ4 、DC-SIGN表达强阳性。结论:H． pylori 感染可上调大鼠胃黏膜上皮细胞 DC-SIGN、TLＲ4 的表达，头花蓼
处理后，其表达水平降低。
［关键词］螺杆菌，幽门;基因表达;免疫;Toll样受体;C型凝集素受体;头花蓼
［中图分类号］Ｒ961． 1 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-2707(2016)06-0640-05
DOI:10． 19367 / j． cnki． 1000-2707． 2016． 06． 005
Effect of Polygonum Capitatum on Pattern Ｒecognition
Molecules DC-SIGN，TLＲ4
ＲEN Yanjun，MO Fei，HE Yun，ZHAO Shuqin，JIANG Mingli，SUN Chaoqin
(Department of Clinical Laboratory，Guihzou Medical University，Guiyang 550004，Guihzou，China)
［Abstract］Objective:To observe the effect of Polygonum capitatum on protein and mＲNA expres-
sion of immune response pattern recognition receptor DC-SIGN，TLＲ4，and to investigate the possible
mechanism and regulation role of Polygonum capitatum anti H． pylori． Methods:SD rats were divided
into blank group，model group，drug group and drug blank group． Model group and drug group re-
ceived intragastric administration of 1 × 1011 cfu /L H． pylori bacteria solution while blank group and
drug blank group received intragastric administration of brain heart infusion broth． 8 weeks later，the
microscope was used to observe the histological changes of gastric mucosa of rats in order to identify
whether the model was successful to． After modeling was successful，drug group and drug blank group
were treated with Polygonum capitatum by intragastric administration while blank group and model
group received physiological saline by intragastric administration． Immunohistochemistry and real-time
PCＲ were adopted to detect the protein and mＲNA expression of in gastric mucosa of rats． The expres-
046
第 41 卷 第 6 期
2016 年 6 月
贵 州 医 科 大 学 学 报
JOUＲNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVEＲSITY
Vol． 41 No． 6
2016． 6
* *［基金项目］高等学校特色专业建设点［No(2010)15］;贵州省科技计划课题［黔科合 J字(20142027)号］;贵州省科技合作计划基金［黔科合 LH(2015)7417
号］;贵州省卫生计生委科学技术基金［gzwjkj2015 － 1 － 003］;贵阳市科技计划项目［筑科合同(20141001)号］
＊＊贵州医科大学 2013 级临床检验诊断学硕士研究生
＊＊＊通信作者 E-mail:354406804@ qq． com
网络出版时间:2016 － 06 － 16 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /52． 5012． Ｒ． 20160616． 1647． 022． html
sion of different parts of gastric mucosa of rats in each group was observed． Ｒesults:After rats were in-
fected with H． pylori，the gastric mucosal glands showed irregular arrangement，with visible vascular
congestion and a large number of lymphocytes infiltration in the submucosal layer，which proved that
model was established successfully． The results of Immunohistochemistry and real-time PCＲ showed
that H． pylori up-regulated TLＲ4，DC-SIGN expression level (P ＜ 0． 05)． After the treatment of Po-
lygonum capitatum，TLＲ4 and DC-SIGN expression level significantly down-regulated (P ＜ 0． 05)．
TLＲ4，DC-SIGN were mainly expressed in cytoplasm of gastric mucosal epithelial cells． After rats were
infected with H． pylori，TLＲ4，DC-SIGN showed strongly positive expression． Conclusion:H． pylori
infection can up-regulate DC-SIGN and TLＲ4 expression level in gastric mucosa epithelial cells，but
after treatment of Polygonum capitatum their expression levels significantly decrease．
［Key words］Helicobacter pylori;gene expression;immune;Toll like receptor;type C lectin recep-
tor;Polygonum capitatum
幽门螺杆菌是一种螺旋形、多鞭毛、微需氧的
革兰阴性细菌，可以引发 H． pylori 相关性胃炎、消
化性溃疡及胃癌等［1 － 4］。以 C 型凝集素受体
(CLＲ)及 Toll 样受体(TLＲ)为代表的固有免疫分
子，它们能识别相应抗原进而通过不同的方式进行
抗原呈递，CLＲ 中的 DC-SIGN(dendritic cell-specif-
ic inter-cellular adhesion molecule-3-grabbing non-in-
tegrin，CD209)属Ⅱ型跨膜蛋白，具有模式识别受
体功能，在针对病原微生物的免疫反应中，可通过
协同 Toll样受体参与免疫反应;TLＲ4 作为 TLＲ 家
族主要成员，是机体激活固有免疫和适应性免疫对
抗病原微生物的重要因素［5 － 6］。本研究通过检测
H． pylori感染 SD 大鼠及经头花蓼处理后大鼠胃
黏膜中 TLＲ4、DC-SIGN 蛋白和 mＲNA 表达变化，
探讨 H． pylori引起的固有免疫平衡调节机制。
1 材料与方法
1． 1 试剂及仪器
苗药头花蓼浸膏，批号 14196 ，由浙江众益药
业有限公司提供。SPF级 SD 大鼠，6 ～ 8 周龄，150
～ 180 g，购买于第三军医大学实验动物中心，批号
SCXK(军)2012 － 0011。H． pylori 国际标准测序株
SS2000，由中国疾病控制中心传染病所张建中教授
惠赠。哥伦比亚血琼脂(购于 OXOID 公司)、万古
霉素、两性霉素、多粘菌素 B、TMP(购于上海生工
生物)、兔抗 DC-SIGN 抗体(Bioss 公司)、TLＲ4 单
克隆抗体(abcam 公司)、二抗试剂盒(中杉)、PBS
缓冲、柠檬酸缓冲液(C6H8O7·H2)、DAB 显色剂、
二甲苯、中性树胶、无水乙醇、苏木素、DAB 显色
液、Omega ＲNA 提取试剂盒、ＲOCHE LightCy-
cler480 荧光定量 PCＲ仪。
1． 2 方法
1． 2． 1 H． pylori 培养 按照文献［7］，从 － 80 ℃
冰箱中取出 H． pylori SS2000，待室温溶解后，倾倒
于哥伦比亚血琼脂平皿内涂抹均匀，三气培养箱内
培养 72 h(37 ℃、5% O2、10% CO2、85% N2，相对
湿度 ＞ 95%)，观察细菌生长情况，稳定传代 3 次
后进行 H． pylori鉴定(尿素酶、触酶、氧化酶阳性)。
1． 2． 2 动物模型复制及头花蓼处理 将 52 只 SD
大鼠随机分为造模组和对照组，造模组分为模型组
(16 只)和药物组(10 只)，对照组分为空白组(16
只)和药物空白组(10 只)。各种大鼠禁食不禁水
12 h，用 5 g /L的 NaHCO3 和消炎痛混合液按体质
量给雄鼠 1. 0 mL /只，雌鼠 0. 5 mL /只进行灌胃预
处理 1 次;预处理后继续禁食不禁水，6 h后模型组
及药物组给予 1 × 1011 cfu /L H． pylori 标准菌株
SS2000 菌液 1. 5 mL灌胃，灌胃后需禁食禁水 4 h，
隔天 1 次，共 5 次;空白组及药物空白组以等量的
无菌脑心浸液肉汤灌胃。末次灌胃 8 周后，模型
组、空白组随机抽取 6 只大鼠，鉴定其造模是否成
功，大鼠胃黏膜有 H． pylori定植且胃黏膜出现慢性
炎症病理学改变判断为造模成功［8 － 9］。造模成功
后，药物组及药物空白组大鼠参考文献［7］每天给
予头花蓼灌胃处理(1. 58 g 生药 /d)，空白组和模
型组给予等量无菌生理盐水灌胃，1 次 /d，连续给
药 2 周。末次灌胃结束后，正常饲养 4 周，处死大
鼠，取胃黏膜组织进行石包埋或 － 80 ℃冻存备用。
1． 2． 3 DC-SIGN、TLＲ4 蛋白表达 采用免疫组织
化学 (S-P )法检测，石蜡切片常规脱蜡，柠檬酸盐
缓冲液微波修复，3% H2O2 溶液孵育 37 ℃孵育
10 min，PBS液冲洗，分别滴加 DC-SIGN(Bioss 公
146
6 期 任艳君等 头花蓼对 H． pylori感染大鼠模式识别分子 DC-SIGN、TLＲ4 表达的影响
司)、TLＲ4(abcam公司)一抗 ，4 ℃孵育过夜;次日
取出至室温，PBS 液冲洗，滴加二抗，室温孵育
30 min，PBS液冲洗，应用 DAB 溶液(现配)显色，
PBS冲洗，苏木素轻度复染 20 s，自来水冲洗，脱
水，透明，中性树脂封片。DC-SIGN、TLＲ4 蛋白的
阳性表达为细胞质内出现棕黄色颗粒，选取 5 个高
倍镜视野，Image pro- Plus 6． 0 软件测量各组阳性
产物的平均光密度值作为 DC-SIGN、TLＲ4 蛋白的
阳性表达量。
1． 2． 4 DC-SIGN、TLＲ4 mＲNA 表达 采用 Ｒeal-
Time PCＲ检测，Omega试剂盒提取样品的总 ＲNA，
将 ＲNA逆转录为 cDNA，以 β-actin作为内参基因，
采用 Ｒeal-Time PCＲ 检测 DC-SIGN、TLＲ4 mＲNA
表达水平。采用 primer 5 设计 DC-SIGN、TLＲ4 扩
增引物(见表 1)。反应条件为:95 ℃ 3 min，95 ℃
7 s、57 ℃ 10 s、75 ℃ 15 s，40 个循环。每组做 3
个生物重复，采用 2 － ΔΔCT法对目标基因的表达差异
进行分析。
表 1 PCＲ扩增引物序列
Tab． 1 The primers of PCＲ
基因 基因序列号 引物序列(方向 5 － 3) 产物
β-actin NM_031144． 3 F:TGTCACCAACTGGGACGATA
Ｒ:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA
165 bp
TLＲ4 NM_019178 F:TGGCATCATCTTCATTGTCC
Ｒ:CAGAGCATTGTCCTCCCACT
115 bp
DC-SIGN NM_001192005 F:TGTGACTCCAAAGGAATGAGG
108 bp
Ｒ:TCCAGCAAAGAGAATGAGGAA
1． 3 统计学方法
采用 SPSS 17． 0 软件进行统计学分析，计量资
料用均数 ±标准差(x ± s)表示，两两比较采用 t检
验(Independent-Sample T test)，多组比较采用单因
素方差(One-way ANOVA)分析，方差齐采用 LSD
检验，方差不齐采用 Dunnett-t 进行方差分析，P ＜
0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 H． pylori及动物模型
H． pylori经培养后，在哥伦比亚血平板上呈半
透明，针尖状细小菌落。触酶、尿素酶、氧化酶鉴定
呈阳性反应，革兰染色呈弧形、螺旋状、S 形的革兰
阴性杆菌(图 1A)。H． pylori感染 SD大鼠 8 周后，
取大鼠胃黏膜进行细菌微需氧培养结果显示 H．
pylori定植密度约为 105 cfu /g;空白对照组大鼠胃
黏膜完整，腺体排列规则，无异常黏膜肌层(图
1B)，模型组 H． pylori 感染后的胃黏膜腺体排列不
规则，胃黏膜下层可见血管内充血及大量淋巴细胞
浸润(图 1C)。
2． 2 DC-SIGN、TLＲ4 蛋白表达
在胃黏膜上皮细胞胞浆可见 DC-SIGN、TLＲ4
蛋白表达，免疫组织化学染色见棕黄或棕褐色颗
粒。在空白组中，上皮细胞构成规则的腺体，基本
未见 DC-SIGN、TLＲ4 蛋白表达。模型组中，DC-
SIGN及 TLＲ4 表达强阳性，胃腺松散，排列不规
则，药物组经头花蓼处理后，表达减弱，其平均光密
度值比较，模型组高于空白组和药物组(P ＜
0. 05)，药物空白组与空白组比较，差异无统计学
意义(P ＞ 0. 05)，见图 2。
表 2 各组大鼠 DC-SIGN、TLＲ4 蛋白表达平均
光密度值(x ± s，n = 10)
Tab． 2 Comparison of DC-SIGN and TLＲ4 Optical
density value in each group
组别
平均光密度值
DC-SIGN TLＲ4
空白组 0． 045 1 ± 0． 008 50 0． 045 4 ± 0． 003 85
模型组 0． 144 1 ± 0． 005 89(1) 0． 072 9 ± 0． 004 31(1)
药物组 0． 055 2 ± 0． 002 66(2) 0． 054 7 ± 0． 001 77(2)
药物空白组 0． 059 2 ± 0． 003 02 0． 054 7 ± 0． 004 29
(1)与空白组比较，P ＜ 0． 05;(2)与模型组比较，P ＜ 0． 05
2． 3 DC-SIGN、TLＲ4 mＲNA表达
结果显示，H． pylori 刺激后，模型组的 TLＲ4、
DC-SIGN mＲNA明显高于空白组 (P ＜ 0. 05)，药
物组经头花蓼处理后，TLＲ4 、DC-SIGN mＲNA的表
达水平下降 (P ＜ 0. 05)，而药物空白组与空白组
TLＲ4 、DC-SIGN mＲNA的表达水平比较，差异无统
计学意义(P ＞ 0. 05)，见图 3。
3 讨论
H． pylori作为一种模式致病菌，其细胞壁主要
成分为脂多糖，含有病原体相关模式分子，而胃上
皮细胞表面具有的模式识别受体可调控前者识别
H． pylori，行使抗原提呈细胞功能，募集的炎症细胞
相互作用和协调，形成固有免疫局部防御乃至调节
后续的适应性免疫反应［10 － 12］。林凯等［12］研究表
明，在 H． pylori 感染下，胃黏膜上皮细胞表达树突
状细胞表型 DC-SIGN，系 CLＲ的重要成员，在针对
病原微生物的免疫反应中，具有模式识别受体的功
246
贵 州 医 科 大 学 学 报 41 卷
注:A为 H． pylori培养(100 ×)，B为空白组大鼠胃黏膜(HE，× 400) ，C为模型组大鼠胃黏膜(HE，× 400)
图 1 H． pylori培养及各组大鼠胃黏膜
Fig． 1 H． pylori culture and rats＇ gastric mucosa
注:A、B、C及 D分别为空白组、模型组、药物组及药物空白组的 DC-SIGN表达
E、F、G及 H分别为空白组、模型组、药物组及药物空白组的 TLＲ4 表达
图 2 各组大鼠胃黏膜 DC-SIGN及 TLＲ4 蛋白表达(SP，× 40)
Fig． 2 Immunohistochemical staining of G cells gastric antrum(SP，× 40)
(1)与空白组比较，P ＜ 0． 05;(2)与模型组比较 P ＜ 0． 05
图 3 头花蓼对 H． pylori感染 SD大鼠胃黏膜 TLＲ4
和 DC-SIGN mＲNA表达的影响
Fig． 3 Effect of Polygonum Capitatum on TLＲ4
mＲNA and DC-SIGN mＲNA expression of
gastric mucosa of Hp infected rats
能，可通过协同 Toll样受体参与免疫反应，TLＲ4 可
在人类胃上皮细胞上表达，TLＲ4 作为 LPS 的优先
受体，H． Pylori 及其菌体成分 LPS 等刺激均可使
TLＲ4 的表达上调，进而激活 NF-κB，促进细胞因子
的合成与释放，引发炎症免疫反应。DC-SIGN、
TLＲ4 作为重要的识别模式受体，通过激活一系列
的信号转到途径，调控着诸多细胞生物学行为，在
H． pylori感染后的免疫反应中，发挥着重要的调节
作用，SD大鼠在受到 H． pylori刺激时，模式识别受
体发挥着关键的作用，识别模式受体 TLＲ4、DC-
SIGN通过识别病原菌相关分子脂多糖，引起炎性
因子的分泌，诱导机体免疫应答反应清除外来抗
原，构成了机体免疫反应的天然屏障。但是，H． py-
lori的持续作用，引起过度的炎症反应，会对组织、
器官造成严重的损害或导致其他相关疾病，如重症
细菌感染导致 TLＲ4 通路持续活化，引起过度的炎
症反应，造成败血症、TLＲ4 信号通路过度激活从而
介导激素性股骨头坏死的发生［13 － 14］。因此，免疫
平衡的调节在免疫反应中及其重要。林凯［12］研究
认为 H． pylori可刺激 TLＲ4、DC-SIGN的表达，产生
346
6 期 任艳君等 头花蓼对 H． pylori感染大鼠模式识别分子 DC-SIGN、TLＲ4 表达的影响
炎症和免疫反应。本次研究与 Castano-Ｒodriguez
和林凯结果一致，免疫组化结果发现，感染 H． pylo-
ri后，上皮细胞 DC-SIGN、TLＲ4 表达明显上调，头
花蓼可能通过转录和翻译水平调节着免疫平衡。
多数研究表明，中药对 LPS 介导的 TLＲ4 信号通路
的抗炎作用，是通过影响 TLＲ4 /NF-κB 的信号转
导，调控释放相关炎性因子来完成的。谢毅等［15］
研究发现 TLＲ4 在肝组织的表达量在加味大柴胡
汤的作用下有所减少。李卿姬等［16］研究发现，人
类脐静脉内皮细胞受 LPS 刺激后，TLＲ4 表达升
高，补阳还五汤治疗后，TLＲ4 明显下降;本研究中
在药物头花蓼作用后，DC-SIGN、TLＲ4 的表达下
调，转录和翻译水平下调一致，头花蓼的主要成分
之一为黄酮，黄酮能抑制 NF-κB 的核转位，它的单
体黄芪皂苷可以抑制 LPS 的核转位，头花蓼可能
通过相同的作用抑制 TLＲ4、DC-SIGN的表达，也推
测头花蓼可能形成稳定的黏膜屏障，通过改变胃黏
膜周围的微环境，抑制了 TLＲ、CLＲ 的表达，进而
减少 TNF-α、IL-6 等炎性因子的产生以及切断了部
分信号转导通路［17］。在感染 H． pylori 引起的固有
免疫中，TLＲ4、DC-SIGN一方面促进免疫细胞膜表
面有关免疫分子的表达和促进免疫细胞的成熟，另
一方面可促进细胞因子的合成和释放，引发一系列
的炎症反应，头花蓼可能通过调节 TLＲ4 和 DC-
SIGN的表达水平来平衡机体的反应，TLＲ 与 CLＲ
的识别与 LPS介导的信号通路以及基因多态性以
及收到岩藻糖基转移酶等诸多因素影响，因此，头
花蓼在模式识别过程中具体如何调控，该机制有待
深入研究。
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(2016－03－28 收稿，2016－05－27 修回)
中文编辑:吴昌学;英文编辑:刘 华
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