全 文 ：祁彩虹 ,金则新 ,李钧敏 ,等.野芝麻 ISSR-PCR扩增条件优化 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(2):80-83.
野芝麻 ISSR-PCR扩增条件优化
祁彩虹 1, 2 , 金则新 2 , 李钧敏 2 , 彭礼琼 2, 3 , 王　强 2, 4
(1.西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室 ,重庆 400715;2.台州学院生态研究所 ,浙江临海 317000;
3.北京林业大学自然保护区学院 ,北京 100083;4.上海师范大学生命与环境科学学院 ,上海 200000)
　　摘要:以野芝麻(Lamiumbarbatum)DNA为模板 ,利用单因子试验分别对影响野芝麻 ISSR-PCR反应的 Mg2+浓
度 、BSA(小牛血清蛋白)、DNA、TaqDNA聚合酶 、4×dNTP和引物的浓度进行了优化 , 并通过梯度 PCR确定试验的退
火温度 , 最终确定野芝麻最佳的反应体系及 PCR扩增程序为:10 μL体系 , 其中包括 1×Buffer、Mg2+ 2.5mmol/L、BSA
10 mg/mL、模板 DNA15ng、TaqDNA聚合酶 1.5 U、4×dNTP0.4 mmol/L、引物 15 pmol;扩增程序:94 ℃变性 5 min;
94 ℃变性 30 s, 55.2 ℃退火 45 s, 72℃延伸 1.5 min, 共 35个循环;72℃再延伸 5 min反应终止。利用优化后的反应
条件筛选出 10个 ISSR引物 , 并对野芝麻居群进行了遗传多样性分析 , 多态位点百分率为 82.08%, Nei指数为
0.171 7, Shannon信息指数为 0.238 1,说明野芝麻遗传多样性水平较高。该体系建立了标记位点清晰 、反应系统稳
定 、检测多态性能力强 、重复性好的扩增条件。
　　关键词:野芝麻;ISSR分子标记;优化;引物筛选
　　中图分类号:S567.23+9　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0080-03
收稿日期:2010-05-27
基金项目:浙江省自然科学基金(编号:Y507660)。
作者简介:祁彩虹(1984—),女 , 内蒙古呼和浩特人 , 硕士研究生 ,主
要从事植物生态学研究。 E-mail:suzzan@sohu.com。
通信作者:金则新 ,男 , 教授 , 从事植物生态学研究。 E-mail:jzx@
tzc.edu.cn。
　　野芝麻 (Lamiumbarbatum)为唇形科野芝麻属多年生草
本植物 ,在我国东北 、华北 、及华东各省区均有分布 。主要成
分有黏液质 、挥发油 、鞣质 、黄酮苷和水苏碱等 [ 1 ] 。野芝麻是
重要的中药材 ,全草 、花或根都可入药 ,可治肺热咳血 、月经不
调 、小儿虚热 、跌打损伤等 。目前已对野芝麻的生药学进行了
研究 [ 2] ,但对其遗传多样性和遗传结构的研究还未见报道 。
ISSR(inter-simplesequencerepeat)称为简单重复序列
区间 ,是一种建立在 SSR标记和 PCR反应 (聚合酶链反应 )
基础上的第 2代 DNA分子标记技术 ,首先由 Zietkiewicz提出
的锚定 SSR的新策略 [ 3] 。 ISSR分子标记无需预知物种基因
组序列 ,应用的物种基本不受限制 ,具有试验操作简单 、稳定
性好 、多态性丰富等优点 ,近几年广泛应用于植物遗传多样性
分析 [ 4-5 ] 、构建遗传图谱 [ 6 -7 ]和品种鉴定 [8 -9]等领域 。 ISSR
-PCR扩增的不足之处在于稳定性容易受到反应体系中各
物质浓度、退火温度等因素的影响 ,由于不同物种具有差异
性 。因此 ,在利用 ISSR技术进行各项研究时 ,为保证结果清
晰 、可靠和准确 ,有必要对反应体系进行优化 。
目前 ISSR反应体系优化主要的方法有单因子试验和正
交设计 2种 。单因子试验是指分别研究影响因子对 ISSR反
应的影响情况 ,得到各自合适的条件 ,最终组合建立反应的最
佳体系 [ 10] 。试验统计学上的正交设计是综合考察各因子及
其交互作用对扩增结果的影响 ,并找到影响因子的最佳水平
组合 [ 11 ] 。本研究采用单因子试验方法 ,建立最佳的 ISSR-
PCR扩增体系和扩增程序 ,为野芝麻种群遗传多样性和遗传
结构的研究奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
样地位于浙江省临海市北固山 ,海拔 35 m。随机选取
30株野芝麻个体 ,个体间距离至少 20 m,采集植株的幼嫩叶
片置于保鲜袋 ,封口并编号 ,放在冰袋中暂时保存 。带回实验
室 ,清洗干净 ,晾干 ,储存在 -70 ℃超低温冰箱中保存备用 。
1.2　方法
1.2.1　野芝麻 DNA提取与定量　采用改进的 SDS法 [ 12 ]提
取野芝麻总 DNA。提取产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分析 ,
用 GelDocXR凝胶成像分析系统(美国 Bio-Rad公司)拍
照 ,利用 Quantityone1 -D分析软件 , 以 λDNA/EcoRⅠ +
HindⅢ Marker(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)为标准量 ,
按荧光条带相对密度对 DNA条带定量 。用无菌水将每一植
株定量后的 DNA稀释成 10ng/μL,贮存于 -20 ℃冰箱备用 。
1.2.2　总 DNA的 ISSR初始扩增　PCR扩增体系为:10 μL
反应体 积中 , 包含 1 ×Bufer, 2.0 mmol/L的 MgCl2 ,
0.3 mmol/L4×dNTP(dATP、dCTP、dGTP和 dDTP), 1 UTaq
酶(北京鼎国昌盛生物技术有限公司), 10 pmol引物(南京金
思特科技有限公司 ), 20 mg/mLBSA(小牛血清蛋白), 10 ng
DNA模板。 PCR扩增反应在美国 Bio-Rad公司生产的 PCT
-220PCR仪中进行 ,运行程序如下:94 ℃变性 5min;94℃变
性 30 s, 53.1 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 1.5 min,共 35个循环;
72℃再延伸 5 min。扩增产物 4 ℃保存后 ,在 1.6%的琼脂糖
凝胶(1.6g琼脂糖 , 100 mL0.5×TBE, 3.5 mg/mLEB)上电
泳 ,电泳缓冲液为 0.5×TBE,电压 100 V,功率 6W,电泳时间
为 1 ～ 1.5h。电泳产物在 GelDocXR凝胶成像系统 (美国
Bio-Rad公司)中拍照分析 。根据初始 PCR反应条件 ,筛选
出扩增条带较多且较清晰的 UBC864作为优化引物 。
1.2.3　ISSR扩增反应体系优化 　按常规扩增方法 ,采用单
因子试验 ,共检测了 6个影响 PCR扩增的因子 ,各 4个梯度
(表 1)。 PCR扩增程序同 “1.2.2”。
—80— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.02.099
表 1　ISSR-PCR优化体系参数及梯度
浓度
梯度
Mg2+浓度
(mmol/L)
dNTP
(mmol/L)
TaqDNA
聚合酶(U)
BSA
(mg/mL)
DNA
(ng)
引物
(pmol)
1 2.0 0.2 0.5 0.0 5.0 5.0
2 2.5 0.3 1.0 10.0 10.0 10.0
3 3.0 0.4 1.5 20.0 15.0 15.0
4 3.5 0.5 2.0 30.0 20.0 20.0
1.2.4　ISSR-PCR扩增退火温度优化　退火温度的优化在
美国 Bio-Rad公司生产的 PCT-220PCR仪中进行 ,采用梯
度 PCR模式 ,自动设定温度从 48 ～ 60 ℃分为 12个梯度 ,分
别为 48.0、48.3、49.0、50.0、51.4、53.1、55.2、56.9、58.2、
59.1、59.8、60.0℃。
1.3　数据统计与分析
1.3.1　ISSR多样性表型条带计数　用 PCRDNALadder(南
京金思特生物科技有限公司)做标准分子量参照物 ,用 Quan-
tityone1-D分析软件对凝胶照片分析统计 ,有扩增条带记
为 “1” ,无扩增条带记为 “0” ,得到 1 /0二元数据矩阵 。
1.3.2　遗传多样性分析 　用 POPGENE32软件计算多态位
点(%)、Nei指数 、Shannon信息指数等遗传多样性指数 。
2　结果与分析
2.1　Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2+浓度梯度试验结果见图 1 ,所设 4个 Mg2 +浓度梯度
均扩增出条带 。当 Mg2 +浓度为 2.0 mmol/L时 ,条带有缺失 ,
说明这一浓度的 Mg2 +不能有效激活 Taq酶活性 ,可能由于模
板 、引物 、dNTP竞争 Mg2 + ,最终导致游离 Mg2 +不足 ,酶活力
有所下降 [ 13] , PCR扩增失败 。 Mg2 +浓度为 2.5 mmol/L扩增
效果最佳 ,条清晰且稳定。之后 ,随着 Mg2+浓度增加 ,条带亮
度逐渐降低 。虽然各浓度梯度的条带数量没有明显减少或增
加 ,但是不同 Mg2+浓度对条带清晰度有显著影响 。综上所
述 ,用于本试验 ISSR分析的 Mg2 +浓度最适为 2.5mmol/L。
2.2　BSA浓度对 ISSR扩增的影响
在 ISSR扩增反应中 ,植物 DNA中含内源多酚类化合物
会与蛋白质结合 ,导致酶活性降低 , BSA中的赖氨酸阳离子可
阻止多酚类化合物与 Taq酶结合 ,使酶活性得以保证 ,提高
PCR扩增产物的质量 [ 14] 。但也有研究表明添加 BSA会使分
子量小的条带亮度明显下降甚至丢失 [ 15 ] 。图 1显示本试验
中如不添加 BSA, 1 720 bp处有条带缺失 , 当 BSA浓度为
10mg/mL时 ,条带清晰且明亮 。随着 BSA浓度的增加 ,条带
缺失变暗 ,逐渐模糊 。因此 ,适合野芝麻 ISSR扩增的 BSA浓
度为 10mg/mL。
2.3　DNA的量对 ISSR扩增的影响
模板 DNA浓度对扩增谱带数量的影响一般不是很大 ,主
要影响谱带的明暗程度 ,不过 DNA用量过低扩增产物可能不
稳定 ,而过高可能会增加非特异性产物 。野芝麻 ISSR反应体
系对模板 DNA浓度变化不敏感 ,所选择的浓度范围均可扩增
出谱带 ,在 15 ng时 ,谱带稳定 ,清晰可辨(图 1)。考虑到结
果的稳定性 ,选用 15 ng作为 ISSR扩增的最适 DNA用量 。
2.4　TaqDNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
PCR反应体系中 , Taq酶用量直接关系扩增结果的质量 ,
浓度太高扩增容易受影响 ,可能产生非特异性扩增 ,还会增加
成本;太低则不能有效扩增 [ 16] 。本试验 4个梯度均有扩增条
带 ,但是在 0.5U时谱带较弱 ,且条带有所减少 。酶用量增到
1.5 U时 ,扩增效果明显优于 0.5、1.0 U,而酶量继续增加谱
带又会变得模糊(图 1)。故确定 Taq酶用量为 1.5 U。
2.5　dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
dNTP作为 ISSR扩增的原料 ,对其浓度的要求也较严格 ,
浓度过高会导致 PCR错配 ,出现非特异性扩增;过低同样会
降低扩增效率和质量 。对 4个 dNTP浓度的扩增结果进行比
较发现(图 1), dNTP浓度在 0.4、0.5 mmol/L时 ,条带清晰 ,
二者扩增效果相当 ,因此综合经济因素 ,该试验中 4 ×dNTP
的浓度用 0.4 mmol/L。
2.6　引物用量对 ISSR扩增的影响
在本研究中 ,引物浓度变化对 ISSR扩增的谱带数量及强
弱都有较明显的影响(图 1),当引物用量为 5pmol时 ,条带有
明显的丢失 ,扩增失败;用量增加为 10 pmol时 ,条带数量稳
定 ,但比较模糊;用量达到 15 pmol,条带清晰度最大且稳定;
如果继续增加引物的用量 ,条带又会略微变暗 。所以 ,确定该
试验中最佳引物用量为 15 pmol。
2.7　退火温度对 ISSR扩增的影响
由图 2可见 ,退火温度极大地影响着 ISSR-PCR反应的
结果 ,因而确定合适的退火温度非常必要 。根据试验结果 ,选
—81—祁彩虹等:野芝麻 ISSR-PCR扩增条件优化
择 55.2℃为野芝麻的最适退火温度 。不同的引物退火温度
不尽相同 ,所以对具有相似退火温度的引物采用 55.2℃进行
筛选 ,选择清晰 、不弥散的引物进行下一步研究 ,而对退火温
度差距较大的 ,则采用梯度 PCR进行退火温度的再次筛选 。
2.8　野芝麻 ISSR稳定扩增及遗传多样性
通过体系优化 ,用确定的最优试验体系及 PCR程序从
100个引物中筛选出 10个扩增条带清晰 、重复性好的随机引
物(表 2)作为遗传多样性分析的扩增引物 。用 10个引物对
30株野芝麻个体进行 ISSR-PCR扩增(图 3),总共扩增出
106个 DNA片段 ,分子量范围 253 ～ 2 192 bp。在检测到的位
点中 ,多态位点有 87个 , 多态位点百分率为 82.08%。经
POPGENE32软件分析得知 , 该野芝麻种群 Nei指数为
0.171 7 , Shannon信息指数为 0.238 1 ,说明野芝麻遗传多样
性水平较高 。
表 2　野芝麻 ISSR分析引物序列
引物名称 5′※3′序列 引物名称 5′※3′序列
UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC UBC857 ACACACACACACACACYG
UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG UBC864 ATGATGATGATGATGATG
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT UBC866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC
UBC815 CTCTCTCTCTCTCTCTG UBC888 BDBCACACACACACACA
UBC826 ACACACACACACACACC UBC890 VHVGTGTGTGTGTGTGT
3　结论与讨论
总体来看 ,本研究中对扩增结果具明显影响的因子为
BSA、TaqDNA聚合酶和引物 3种 。 BSA中的赖氨酸浓度导
致其与多酚类化合物结合能力不同 ,因此对酶活力影响不同 ,
故而对扩增产生较大影响 。而 Taq酶本身作为反应的催化
剂 ,用量必然会对反应产生较大影响 。引物的用量在扩增反
应中一般也较严格 ,浓度太高会引起非特异性扩增 ,并可能形
成引物二聚体;而浓度太低则不能产生多态性条带 [ 17 ] 。所
以 ,这 3个因子会对 PCR产物有明显的影响 。综合所有因
素 ,得到野芝麻 ISSR-PCR反应的最佳体系为:10 μL体系 ,
其中包括 1×Buffer、Mg2 + 2.5 mmol/L、BSA10 mg/mL、模板
DNA15 ng、TaqDNA聚合酶 1.5 U、4×dNTP0.4 mmol/L、引
物 15 pmol;扩增程序:94 ℃变性 5 min;94 ℃变性 30 s,
55.2℃退火 45s, 72℃延伸 1.5min,共 35个循环;72℃再延
伸 5min反应终止 。经重复的引物扩增验证 ,在此优化条件
下可以得到重复 、稳定 、多态性好的 ISSR扩增结果。用 10个
引物检测结果多态位点百分率为 82.08%, Nei指数为
0.171 7 , Shannon信息指数为 0.238 1 ,这说明该野芝麻种群
具有较高的遗传多样性 ,这为进一步研究野芝麻的种群遗传
多样性及遗传结构奠定了基础 。
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(下转第 83页)
—82— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
李　松 ,余坤兴 ,刘丽敏 ,等.甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术研究 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(2):83-87.
甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术研究
李　松 1, 2 , 余坤兴 1, 2 , 刘丽敏 1, 2 , 淡　明 1, 2 , 刘红坚 1, 2 , 杨　柳 3 , 谭　芳 1, 2 , 游建华 1, 2 , 戴友铭 1, 2
(1.中国农业科学院甘蔗研究中心 ,广西南宁 530007;2.广西壮族自治区甘蔗研究所 ,广西南宁 530007;
3.广西大学 ,广西南宁 530005)
　　摘要:以茎尖为供体诱导胚状体分化成苗 , 完善与改进甘蔗脱毒健康种苗生产技术。以甘蔗新台糖 22号为材
料 , 比较茎尖胚状体 、茎尖与腋芽 3种分化成苗繁育方法在不同时期接种 、不同激素水平下的组培苗增殖速度 、苗素质
及脱毒效果。 结果表明 , 组培苗繁殖速度以茎尖胚状体分化苗最快 , 增殖 5代后扩繁 2 589倍 , 茎尖 297倍 , 腋芽
104倍 ,培养基以 6-BA1.5mg/L+NAA0.01 ～ 0.1 mg/L增殖效果最好;组培苗质量与繁殖速度相反。本试验中出
现不正常生长的苗有白化苗 、细弱小苗 、玻璃化苗 、疯长苗等 4种 , 茎尖胚状体苗发生率 1.77%,茎尖苗 1.56%, 腋芽
苗 0.31%;不同处理间组培苗生根及移栽成活率差异不显著 , 生根率茎尖胚状体苗 75.3%、茎尖苗 76.9%、腋芽苗
76.6%,移栽成活率茎尖胚状体苗 94.8%、茎尖苗 95.4%、腋芽苗 95.1%, 生根培养基以 NAA 7.5 mg/L+ABA
2.5mg/L最好;去除甘蕉宿根矮化病(RSD)、花叶病方面 , 以茎尖胚状体苗最好 , RSD去除率 95%、花叶病去除率
100%, 茎尖苗 RSD去除率 70%、花叶病去除率 75%, 腋芽苗未能去除 RSD、花叶病。 说明应用茎尖胚性细胞再生植
株 , 脱毒效果好 ,繁殖速度快 , 可克服目前脱毒苗生产中试管苗扩繁量小 、成本高的难题。
　　关键词:甘蔗;茎尖;胚状体;脱毒
　　中图分类号:S566.104　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0083-05
(上接第 82页)
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　　甘蔗是中国最主要的糖料作物 ,其种植面积占糖料总面
积的 85%左右 ,蔗糖产量占食糖产量的 90%以上 。甘蔗由于
长期连作 ,各种病害易积累且传播快 ,尤其是目前应用化学药
物无法防治甘蔗宿根矮化病 (RSD)和花叶病等病害 ,导致种
性退化 ,产量 、质量急剧下降 。茎尖培养去除甘蔗宿根矮化病
和花叶病 ,生产脱毒健康种苗是恢复甘蔗优良种性 、提高甘蔗
收稿日期:2010-06-22
基金项目:国家科技支撑计划(编号:2007BAD30B03);广西科技计划
(编号:桂科攻 0782004-3);广西甘蔗研究所专项课题(编号:
G2010006、G2010013)。
作者简介:李　松(1964—),男 , 硕士 ,副研究员 ,主要从事甘蔗生物
技术和理化诱变育种工作。 E-mail:ls19009@ 163.com。
工农效益最有效的技术措施 [ 1] 。甘蔗迅速大量繁殖试管苗 ,
可通过 2种方式:一种是诱导嫩叶外植体产生愈伤组织 ,由愈
伤组织分化植株 [ 2 -4] ;另一种是培养茎顶生长点附近的芽(顶
芽 、腋芽),使之大量分蘖繁殖 。繁殖一定数量后 ,诱导芽长
出根 ,形成完整植株 [ 5 -7 ] 。我国利用甘蔗外植体进行良种快
繁的研究工作较早 , 20世纪 70年代通过愈伤组织 [8 ] 、腋芽 [ 9]
等进行甘蔗良种快繁 ,并大面积应用于生产;1994年许莉萍
等报道了茎尖培养去除甘蔗花叶病毒 [ 10] 。对甘蔗茎尖培养
去除甘蔗宿根矮化病的研究工作开展得比较晚 ,但进展较快 ,
并已进入推广应用阶段 [ 11 ] 。但是甘蔗茎尖培养扩繁量小 ,成
本高 ,不利于在生产上大面积推广应用 。本研究着重于以茎
尖细胞培养及体细胞胚胎发生途径 ,实现深度去病 、去毒和大
—83—江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期