全 文 ：野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立
林丽英 ,湛文青 ,饶春意
(广东省药品检验所 ,广东广州 51080)
摘要 目的:通过对野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立和方法验证 , 为抗菌消炎类中成药微生物限度检
查法的建立提供有效的科学依据 ,为实施 2005版中国药典时 , 该类药品微生物限度检查法的方法验证提供原则性
指导;由此探索出野牡丹止痢片的抗菌谱 , 为该品种的临床用药研究提供实用的参考。方法:采用离心沉淀法与培
养基稀释法相结合 , 对各试验菌株作回收率试验 , 以验证所建立方法的科学性和可行性。结果:野牡丹止痢片对金
黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用 ,而对大肠埃希菌 、白色念球菌和黑曲霉菌几乎无抑制作用。证
明该品种的抗菌谱为革兰氏阳性菌。用离心沉淀法和培养基稀释法相结合 ,可消除野牡丹止痢片在试验条件下的
抑菌作用 , 从而顺利检出该品种所污染的各种微生物。
关键词 野牡丹止痢片;微生物限度检查法;方法建立及验证
中图分类号:R286.02 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2006)03-0299-04
2000年版药典收载的微生物限度检查法 〔1〕 ,其
检查结果只能较真实的反映一般药品污染微生物的
情况 ,而对具有抑菌作用的药品 ,由于受到抑菌成分
的干扰 ,所得结果并不能真实的反映出药品污染微
生物的情况 。因此 2005版药典规定 〔2〕:进行药品微
生物限度检查时 ,要求按已验证的方法进行检查 ,这
就需要为每个品种建立适宜的微生物限度检查法 。
对于有抑菌作用的品种 ,由于在试验条件下存在对
待检菌的干扰 ,使检查结果不能真实的反映出药品
中污染微生物的量 ,必须采取一定的措施 ,如培养基
稀释法 、薄膜过滤法 、离心沉淀法或中和法〔3〕等对
供试品进行处理 ,使药品的抑菌作用在检验条件下
消除或可忽略不计 ,从而顺利检出该类药品所污染
的各种微生物 ,提高微生物的检出率 ,更好的控制药
品的质量 ,保证人民的用药安全。野牡丹止痢片由
野牡丹提取物制成 ,具有清热利湿 ,收敛止血作用 。
用于腹泻 、腹痛 、痢疾 、便血 、消化不良等病症。本文
通过对其微生物限度检查法的建立 ,并对所建立的
方法进行验证 ,为抗菌消炎类中成药微生物限度检
查法的建立提供有效的科学依据。为实施 2005版
中国药典时 ,该类药品微生物生物限度检查法的方
法验证提供可行的原则性指导 。并由此得到野牡丹
止痢片的抗菌谱 ,可作为该品种临床用药研究的参
考 。
1 实验材料
1.1 菌种 大肠埃杀菌(CMCC(B)44 102);枯草
芽孢杆菌(CMCC(B)63 501);金黄色葡球菌(CM-
CC(B)26 003);乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50
094);白色念珠菌(CMCC(F)10123);均为国家菌
种保藏中心提供;黑曲霉(ATCC16404)为广东省微
生物研究所提供 。
1.2 培养基 营养肉汤培养基 、真菌培养基 、营养
琼脂培养基 、真菌琼脂培养基 、玫瑰红钠琼脂培养
基 、胆盐乳糖培养基 、MUG培养基 、曙红亚甲蓝琼脂
培养基等均由中国药品生物制品检定所监制的北京
三药科技开发公司生产 。
1.3 仪器及设备 均使用广东省药品检验所微生
物实验室的仪器及设备 。该实验室已通过国家实验
室认可委员会的认可。
1.4 样品 野牡丹止痢片 ,由广东南国制药有限
公司生产 。
2 菌液的制备 〔2〕
接种大肠埃杀菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆
菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中 ,置 30 ～ 35℃
培养 20 ～ 24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至真
菌培养基中 , 23 ～ 28℃培养 24 h,然后用 0.9%无菌
氯化钠溶液 10倍递增稀释 ,制成每 1 ml含菌数为
50 ～ 100 cfu的悬菌液 。接种黑曲霉的新鲜培养物
至真菌琼脂斜面培养基中培养 5 ～ 7天 ,加入 3 ～ 5
ml0.9%无菌氯化钠溶液 ,将孢子洗脱 。然后吸出
孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤
菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管中 ,用 0.9%无菌
氯化钠溶液 10倍递增稀释 ,制成每 1 ml含孢子数
50 ～ 100 cfu以下的孢子悬液。
3 供试液的制备
称取野牡丹止痢片样品 10 g,加 0.9%无菌氯
化钠 -蛋白胨缓冲液至 100 ml,用匀浆仪混匀 ,制成
1∶10均匀的供试液。
4 预实验〔4〕
对野牡丹止痢片进行预试验 ,以确定其抗菌谱
及抑菌程度。结果如表 1。
从表 1可知:野牡丹止痢片对金黄色葡萄球菌
·299·中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
表 1 常规法(1∶10供试液)各试验菌株的回收率
实验菌株 试验组 对照组 菌液组 回收率
大肠埃希菌 90 0 88 100%
金黄色葡萄球菌 22 0 141 16%
枯草芽孢杆菌 4 0 151 <1%
白色念株菌 96 0 95 100%
黑曲霉 80 0 98 82%
及枯草芽孢杆菌的抑制作用很强 ,而对大肠埃希菌 、
白色念珠菌及黑曲霉几乎无抑制作用 。由此可知野
牡丹止痢片对革兰氏阳性菌敏感。需要选择适合的
方法使其抑菌作用在检验条件下消除或可忽略不
计 ,从而提高各种污染微生物的检出率。
5 方法验证 〔2〕
5.1 细菌数 、霉菌和酵母菌数检查的方法验证
验证试验至少应进行 3次独立的平行实验 ,并分别
计算各实验菌株每次实验的回收率。
从预实验中可知 ,使最敏感的枯草芽孢杆菌的
回收率达到要求 ,基本上可以建立本品的微生物限
度检查法。所以 ,只要通过对样品进行处理后 ,使枯
草芽孢杆菌的回收率能达到 70%以上。对此 ,我们
首选培养基稀释法。
实验组:取实验可能用的最低稀释级供试液 1
ml至一定数量的平皿中 ,使单位体积内的供试品含
量减少(用培养基稀释供试品),同稀释级需做 2 ml
的供试液。然后每皿加已配制好的每 1 ml含菌数
约为 50 ～ 100cfu的悬菌液 1ml,立即倾注琼脂培养
基 ,待凝 ,按规定培养(细菌在 30 ～ 50℃培养箱中培
养 48 h,霉菌在 23 ～ 28℃培养箱中培养 72 h),点计
菌落数;菌液组:测定所加的实验菌数。吸各菌液 1
ml,注入平皿中 ,每个菌株平行制备 2个平皿 ,加相
应的培养基 ,按规定培养 ,点计菌落数;供试品对照
组:按试验组的方法 ,不加菌液 ,测定供试品的本底
菌;稀释剂对照组:考察供试液制备过程中微生物受
影响的程度 。
结果判断:在 3次独立的平行试验中 ,稀释剂对
照组的菌回收(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液
组的平均菌落数的百分率)应均不低于 70%。当实
验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品
对照组的平均菌落数的值点菌液组的平均菌落数的
百分率)不低于 70%时 ,则所建立方法成立 ,否则应
重新建立方法 ,重新验证。
5.1.1 大肠埃希菌的回收率实验:取均匀的 1∶10
供试液 ,按常规法实验 ,结果与预实验相符 ,回收率
均接近 100%。见表 2。
表 2 大肠埃希菌的回收率
试验次数 试验组 对照组 菌液组 回收率
1 90 0 88 100%
2 94 0 96 98%
3 67 0 70 96%
5.1.2 金黄色葡葡球菌的回收率实验:取均匀的
1∶10供试液 1ml,分注入 5个平皿中 ,做 2 ml供试
液。回收结果见表 3。
表 3 金黄色葡萄球菌的回收率
次数 5个平皿 /1ml实验组 对照组 菌液组 回收率
1 106 0 141 75%
2 87 0 123 71%
3 72 0 96 75%
4 81 0 98 83%
由表 3可得:将 1∶10供试液 1ml分注入 5个平
皿时 ,金黄色葡萄球菌的回收率高于 70%。即在此
试验条件下可使野牡丹止痢片对金黄色葡萄球菌的
抑制作用忽略不计 。
5.1.3 枯草芽孢杆菌的回收率试验:取 1∶10的供
试液用培养基稀释法 , 1 ml分注入 10个平皿时 ,枯
草芽孢杆菌的回收率还远达不到 70%,见表 4。
表 4 枯草芽孢杆菌的回收率
次数 10个平皿 /1ml实验组 对照组 菌液组 回收率
1 19 0 62 29%
2 31 0 94 33%
由于 2005版药典要求用试验可能用的最低稀
释级供试液(即 1∶10供试液),因此应对供试液采
用沉降法 、薄膜过滤法或离心沉淀法处理后 ,再作试
验。
沉降法:将 1∶10供试液静置 10 min。取上层液
进行试验 ,结果与常规稀释法相似 ,每 ml分注入 10
个皿 ,枯草芽孢杆菌的回收率只有 39%。因此沉降
法不适合本品 。
薄膜过滤法:取 1∶10供试液 1 ml,加到 100 ml
的稀释剂中 ,摇匀 ,用灭菌的开放式漏斗减压抽滤 ,
滤干后 ,分 3次 ,每次用 100 ml的稀释剂冲洗滤膜 ,
取出滤膜 ,膜面朝上 ,贴于已制备好的营养琼脂平板
上 ,倒置培养 。结果 ,由于药渣颜色太深 ,菌落分不
清。因此本法也不能用 。
离心沉淀法:取均匀 1∶10供试液 10 ml,用 500
转 /min,离心 4 min,取上层液 ,再用 3000转 /min,离
心 25 min。弃去上清液 ,留下底部约 1 ml的沉淀 ,
·300· 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
加稀释剂至 10 ml,用该液进行试验。结果见表 5。
从表 5可看到 ,用离心沉淀法 ,可有效地消除野牡丹
止痢片在试验条件下对各类细菌的抑制作用。
表 5 离心沉淀法对枯草芽孢杆菌的回收率
每 ml分注皿数 试验组 对照组 菌液组 回收率
1 41 0 86 48%
2 54 0 86 63%
5 68 0 86 79%
5.1.4 白色念珠菌和黑心霉的回收率试验:由预
试验可知野牡丹止痢片对霉菌和酵母菌的抑菌作用
均可忽略不计。可用常规法作回收试验。取均匀 1
∶10供试液 1 ml注入 1个平皿中 ,做 2 ml供试液 。
结果见表 6、表 7。各菌株稀释剂对照组的回收率均
大于 70%,与预试验相符 。
表 6 白色念珠菌的回收率
试验次数 试验组 对照组 菌液组 回收率
1 96 0 95 100%
2 103 0 112 92%
3 86 0 91 95%
表 7 黑曲霉的回收率
试验次数 试验组 对照组 菌液组 回收率
1 80 0 98 82%
2 52 0 63 83%
3 43 0 50 86%
5.2 控制菌检查的方法验证 按《中国药典》2005
版标准规定 ,口服给药制剂每 g不得检出大肠埃希
菌 ,故除了对野牡丹止痢片进行细菌数 、霉菌的酵母
菌数检查外 ,还应检查控制菌大肠埃希菌 。验证方
法如下:
实验组:取规定量的供试液及 10 ～ 100 cfu试验
菌加入胆盐乳糖培养基中(同时采用培养基稀释法
试验),依大肠埃希菌检查法检查;阴性对照组:方
法同试验组 ,加入的对照菌为 10 ～ 100 cfu金黄色葡
萄球菌;结果判断:阴性对照菌组应未检出金黄色葡
萄球菌 ,试验组检出的试验菌大肠埃希菌则方法成
立 。若试验组未检出试验菌 ,应调整方法消除供试
品的抑菌活性 ,并重新进行方法验证 。
结果显示;阴性对照组各增菌培养液均未检出
金黄色葡萄球菌(另菌量为 90 cfu),试验组各增菌
培养液均可检出试验菌大肠埃希菌(加菌量为 81
cfu)。结论:本品控制菌大肠埃希菌可用常规法检
查 。
6 野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立
细菌计数法的建立:由大肠埃希菌 、金黄色葡萄
球菌及枯草芽孢杆菌的回收率试验可知 ,要使野牡
丹止痢片所污染的各种类型的细菌均顺利检出 ,必
需采用最敏感的枯草芽孢杆菌的回收率达到要求的
检验方法 ,即离心沉淀法加培养基稀释法(1 ml分
注入 5个平皿中)。才能检出样品中污染的各种细
菌。
霉菌和酵母菌计数法以及控制菌检查法的建
立:用常规法。
用所建立的细菌计数法 ,对大肠埃希菌 、金黄色
葡萄球菌及枯草芽孢杆菌进行回收率试验 ,每个菌
株每次各做 2 ml供试液。共进行 3次独立的平行
试验 ,回收结果见表 8。
表 8 1∶10供试液离心沉淀后 1 ml分
注入 5个平皿中各菌株的回收率
菌株 次数 试验组 对照组 菌液组 回收率
大肠埃希菌 1 113 0 120 94%
2 99 0 103 96%
3 88 0 93 95%
金黄色葡萄球菌 1 145 0 155 94%
2 123 0 135 91%
3 103 0 111 93%
枯草芽孢杆菌 1 68 0 86 79%
2 56 0 63 89%
3 89 0 112 79%
由表 8可知:所建立的细菌计数法成立 。
7 讨论
对于具有抑菌作用的药品制剂 ,还需要做微生
物限度检查? 答案是肯定的。因为 〔5〕:污染于抑菌
药品中的微生物 ,在一定条件下(如干燥)是可以稳
定地存在一段时间的 ,虽然它们可能受到损伤 ,但未
死亡 ,在条件改变时 ,如服用至人体内 ,条件适宜时
仍可生长繁殖 。某些药品在试验条件下呈现抑菌作
用并干扰待检菌的检出或计数 ,但当服用后受到胃
液及肠液的稀释 ,抑菌作用减弱 ,细菌便可复苏并繁
殖 ,对人体造成危害 。因此 ,对抑菌性药物有必要进
行微生物限度检查 。
从野牡丹止痢片的微生物限度检查法建立研究
来看 ,对对抑菌作用较强的中成药 ,用培养基稀释法
简便有效 。但是 ,当供试品的抑菌作用很强 ,用稀释
法难以消除供试品的抑菌作用时 ,应考虑采用用沉
降法 、离心沉淀法或薄膜过滤法等方法来消除其抑
菌作用 ,以提高微生物的检出率 ,使检查结果更真实
反映药品的污染情况。
通过对各菌株的回收率实验可知 ,野牡丹止痢
片对革兰阳性菌的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌
·301·中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
的抑菌作用很强 ,而对革兰阴性菌的大肠埃希菌几
乎无抑菌作用 ,对霉菌和酵母菌的黑曲霉和白色念
珠菌无抑菌作用 。也就是说野牡丹止痢片的抗菌谱
为革兰阳性菌。这一结果可为该品种的临床用药研
究提供有用的参考价值。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中国药典 .北京:化学工业出版社 ,
2000:附录 .
[ 2] 国家药典委员会 .中国药典 .北京:化学工业出版社 ,
2005:附录 .
[ 3] 马绪荣 , 苏德模 .药品微生物检验手册 .北京:科学出
版社 , 2000:65-66.
[ 4] 杜平华 , 朱世真 ,赵鲁青 .药物微生物限度检查预试验
及方法验证的探讨 .中国药品标准 , 2003, (3):180.
[ 5] 林丽英 , 魏雪芳 , 梁艺英 , 等 .硝呋太尔片大肠杆菌检
查法 .广东药学 , 2004, (1):20.
(2005-08-15收稿)
HPLC法测定腰息痛胶囊中欧前胡素的含量
程艳芹
(解放军第 401医院药剂科 ,山东青岛 266071)
摘要 目的:建立一种 HPLC法测定腰息痛胶囊中欧前胡素含量。方法:色谱柱为 C18色谱柱。流动相甲醇-水
为(74∶26),流速为 1.0 ml/min,检测波长为 300nm, 柱温为 30℃。结果:欧前胡素在 0.128 ～ 1.024μg范围内线性
关系良好(r=0.9999), 平均回收率为 98.6%, RSD为 1.29%(n=6)。结论:该方法准确 、灵敏度高 , 重现性好 ,可
用于腰息痛胶囊的质量控制。
关键词 腰息痛胶囊;欧前胡素;高效液相色谱法
中图分类号:R927.2 文献标识码:B 文章编号:1001-4454(2006)03-0302-02
腰息痛胶囊为白芷 、草乌 、独活等 22味中药及
扑热息痛组成的中药 、化学药复方制剂。具有舒筋
活络 、祛瘀止痛 、活血驱风之功效。临床上主要用于
治疗风湿性关节炎 、肥大性胸椎炎 、颈椎炎 、坐骨神
经痛 、腰肌劳损等 。原质量标准(WS3-B-2256)中只
有扑热息痛的含量测定 ,没有中药药味的含量限定 。
白芷为方中主药之一 ,欧前胡素是白芷的主要活性
成分 ,故采用欧前胡素作为含量控制指标 。本实验
采用 HPLC测定腰息痛胶囊中欧前胡素含量 ,现报
道如下:
1 仪器 、试药与样品
SSI高效液相色谱仪 (SSI公司), SSI500检测
器 , ANASTAR液相色谱工作站 。欧前胡素对照品
由中国药品生物制品检定所提供 (批号:11826-
200308,供含量测定用)。甲醇为色谱纯(天津科密
欧化学试剂开发公司),水为双蒸水 ,其它试剂均为
分析纯 。腰息痛胶囊样品由山东某制药厂提供 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 phenomenC18色谱柱(填料 Kro-
mosilTMC18 5 μm, 150×4.6 mm);流动相:甲醇 -水
(74∶26);流速:1.0 ml/min;检测波长:300nm;柱温
30℃,进样量 20μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备:精密称取欧前胡素对
照品 2.50 mg,置 25 ml量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释
至刻度 ,摇匀 ,再精密吸取 5.0 ml,定容至 50 ml量
瓶中 ,摇匀 ,备用。
2.2.2 供试品溶液的制备:取本品 10粒 ,混匀 ,取
约 1 g,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加乙醚适量 ,回
流提取 8 h,挥干乙醚 ,残渣用甲醇溶解 ,定容成 10
ml,微孔滤膜过滤 ,取续滤液 ,即得 。
2.2.3 阴性对照溶液的制备:按处方比例取 3粒
量 ,参照样品溶液的制备方法 ,制备不含白芷的阴性
对照溶液 。
2.3 阴性干扰试验 分别精密吸取对照品溶液 、
供试品溶液 、阴性对照溶液各 20 μl,注入液相色谱
仪 ,记录色谱图。结果表明 ,供试品色谱图中 ,在与
对照品色谱峰相应的位置上有相同的色谱峰 ,主峰
与其他色谱峰之间分离关系良好;在阴性空白溶液
色谱图中 ,与欧前胡素保留时间相同的位置上无色
谱峰 ,表明处方中其他组分对欧前胡素含量测定无
干扰;欧前胡素与其他峰之间分离度均大于 1.5,满
足含量测定要求。
2.4 线性关系考察 精密称取欧前胡素对照品
·302· 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月