全 文 ：绿豆芽中SOD的分离纯化、固定化及性质研究
梁丽琴，程琳，李继变，段江燕*
（山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041004）
摘 要：为降低 SOD生产成本，提高其稳定性及其重复利用率，选用绿豆芽为材料，对 SOD进行分离纯化，固定化
及性质研究。结果表明，用 0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液（含 0.1 mol/L MEDTA）提取 SOD，40 %饱和度的硫酸铵去除
杂蛋白、80 %饱和度的硫酸铵沉淀 SOD，DEAE-纤维素-柱层析纯化，SOD的纯度可达 4.662×10-5 kat/mg 蛋白，总酶
活回收率达 43.7 %，纯化倍数达 26.4；包埋剂聚丙烯酰胺凝胶的浓度为 22.5 %时，固定化酶的结合效率为 87.0 %，
固定化酶的活力回收率为 80.9 %；H2O2和 KCN对 SOD的活力抑制表明，绿豆芽 SOD为 Cu、Zn-SOD。PAGE电泳图
谱显示绿豆芽 Cu、Zn-SOD由 2个亚基组成。本研究结果将为绿豆芽 SOD的开发利用提供理论参考。
关键词：SOD；绿豆芽；分离纯化；固定化；性质
The Research on Isolation and Purification，Immobilization and Character of Mung Bean Sprouts SOD
LIANG Li-qin，CHENG Lin，LI Ji-bian，DUAN Jiang-yan*
（College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041004，Shanxi，China）
Abstract：In order to reduce production costs and improve stability and utilization， the mung bean sprouts were
selected as tested materials and SOD purified through ammonium sulfate frationation and DEAE -cellulose
chromatography was immobilized. The results showed that after extracted with 0.05 mol/L pH7.8 PBS（containing
0.1 mol/L MEDTA）， removed other protein with ammonium sulfate of 40 % saturation， precipitated with
ammonium sulfate of 80 % saturation and purified with DEAE-cellulose chromatography， the putrity of SOD was
4.662×10-5 kat/mg protein，the total recovery rate of enzyme activity was 43.7 % and the purification times was
26.4. When the concentration of polyacrylamide was 22.5 %，the combination efficiency of the immobilized
enzyme was 87.0 %，and the total recovery rate of immobilized enzyme activity was 80.9 % . The results of
enzyme activity inhibition by H2O2 and KCN showed that mung bean sprouts SOD was Cu，Zn-SOD. PAGE
electrophoresis results showed that mung bean sprouts Cu，Zn-SOD Comprised two subunits. The study results
will lay the foundation for exploiting mung bean sprouts SOD.
Key words：superoxide dismutase；mung beans prouts；isolation and purification；immobilization
基金项目：山西师范大学校自然科学基金（NO.YZ07006）
作者简介：梁丽琴（1979—），女（汉），讲师，硕士，主要从事植物生物
化学方面的研究。
*通信作者：段江燕（1966—），女（汉），教授，硕士，主要从事植物生
物化学方面的研究。
食品研究与开发
Food Research And Development
2014年 3月
第 35卷第 5期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.05.008
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC1.15.1.1
简称 SOD）能够催化超氧化物自由基歧化为 O2与
H2O，从而防止因超氧自由基在生物体内的过多积累
而引起疾病或衰老，是一种具有重要生物医学意义的
金属酶。据其活性部位结合金属离子的不同，目前生
物体中已发现的 SOD 主要有 Cu、Zn-SOD、Mn-SOD、
Fe-SOD及 Ni-SOD4种。
由于动物血液具有疾病多，价格昂贵等缺点，因而
以成本低廉，SOD含量丰富且无污染的植物为材料提取
SOD势在必行；水稻、玉米、沙棘、大豆中的 SOD提取纯
化目前已有较全面的研究[1]，而绿豆芽中的 SOD提取
纯化研究则较少；此外，天然 SOD稳定性差，易失活，不
能重复利用，而固定化酶则可克服以上缺点，为此，以绿
豆芽为材料提取纯化 SOD，并对其加以固定化，从而为将
SOD更好的应用于食品及医药工业奠定理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
绿豆种子（中绿一号）、牛血清白蛋白、邻苯三酚、
硫酸铵（（NH4）2SO4）、丙烯酰胺（Acr）、N，N’-亚甲基
双丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、乙二胺四
乙酸（EDTA）、过硫酸铵（AP）、二乙胺基乙基纤维素、
考马斯亮蓝（G250）等为分析纯。
分离提取
27
1.2 主要仪器
TGL-16G-A型高速冷冻离心机：上海安亭科学
仪器厂；UV-7504型紫外可见分光光度计：上海欣茂
仪器有限公司；HD-2001-B-C型核酸蛋白检测仪：上
海嘉鹏科技有限公司；层析实验冷柜：北京博医康实
验仪器有限公司；DYY-2C型电泳仪及 DYCZ-24D型
双垂直电泳槽：北京市六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 SOD粗酶液的制备
绿豆用沸水冲洗 3次，25 ℃恒温箱培养 7 d，取去
根尖的绿豆胚 20 g研磨成匀浆，加 30 mL 0.05 moL/L磷
酸缓冲液混匀，用四层纱布过滤。滤液经高速冷冻离
心机离心 15min（4000 r/min，4℃），上清液即粗提酶液。
1.3.2 SOD酶液的纯化
向粗提酶液中加硫酸铵至 30%、35%、40%、45%饱
和度，混匀，4℃静置过夜，离心 15min（4℃，4000 r/min），
取上清液，继续加硫酸铵至 80 %饱和度，静置 6 h后
离心 15 min（4℃，4 000 r/min），沉淀用 5 mL 0.025 mol/L
pH7.8的磷酸缓冲液溶解。溶解液加入 1.25 mL95 %冷
乙醇和 0.75 mL冷氯仿，边加边搅拌，10 000 r/min离心
10 min，取上清液对蒸馏水透析过夜。透析液用聚乙二
醇浓缩至一定体积。浓缩液用 DEAE-纤维素-32上柱
（2 cm×40 cm），用 0.025 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液洗
脱，流速为 1.5 mL/管/4 min。以上各步均需测蛋白质的
含量和酶的活力。
1.3.3 蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝结合法[2]，标准曲线回归方程：A595 nm=
0.082 5 + 0.008 3 ×蛋白质含量
1.3.4 SOD纯度的鉴定—PAGE电泳[2]
1.3.5 绿豆芽 SOD的鉴定[3]
1.3.5.1 H2O2对绿豆芽 SOD活力抑制
取 4只洁净试管，各加入 15%H2O215、20、25、30μL
及适量层析 SOD酶液，于 30 ℃水浴恒温 30 min，取出
迅速冷却至 25℃，测定酶活力，并计算其相对活力。
1.3.5.2 KCN对绿豆芽 SOD活力抑制
取 6 只洁净试管，各加入 10 mmol/L KCN 100、
200、300、400、500、600μL及适量绿豆芽 SOD酶液。于
30℃水浴恒温 30 min，取出迅速冷却至 25 ℃，测定酶
活力，并计算其相对活力。
1.3.6 绿豆芽 SOD固定化酶制备[4]
取 5支洁净的小烧杯，按表 1加样并混匀，于 4℃
冰箱中静置 24 h后即得固定化酶胶体。
1.3.7 绿豆芽 SOD活力的测定
1.3.7.1 自由酶活力的测定
邻苯三酚法[5]（前 3 min与时间呈线性关系，经计
算得邻苯三酚自氧化速率为 0.070 nm/min。）
抑制率 = A0 - ASODA0
× 100 %
SOD活力（IU）= A0-ASODA0
×总体积× 12 ×
1
样品液体积
1 kat = 1 × 106 IU
1.3.7.2 固定化酶活力的测定
取 6支离心管，分别加入 pH8.2 0.1 mol/LTris-HCl
缓冲液 4.5 mL，1号试管加入蒸馏水 4.2 mL。2、3、4、5、6
号试管加入蒸馏水 4.1 mL，再分别加入用 0.1 mL的游
离酶液配制成固定化酶粉末，凝胶浓度分别为 17.5 %、
20.0 %、22.5 %、25.0 %、27.5 %，混匀后于 25 ℃预热
20 min。然后分别加入 25℃预热过的邻苯三酚 0.3 mL
（在 1号管用 0.3 mL 10 mmol/L盐酸代替），开始计时，
同时震荡离心管，准确反应 4 min 后，立即分别加入
1滴 8 mol/LHCl终止反应。将 6支离心管置离心机中，
8 000 r/min离心 10 min，取上清夜，以 1号管为空白
管，在 420 nm波长处测定其吸光值。
1.3.7.3 洗涤酶活力的测定
将凝胶浓度分别为 17.5 %、20.0 %、22.5 %、25.0 %、
27.5 %的固定化酶取出，碎成 1 mm见方的小颗粒，装
入层析柱，用少量双蒸水洗涤 3~4次，合并洗涤液，进
行酶活力测定，方法同 1.3.7.1。
1.3.7.4 固定化结果分析
未包埋酶 = 洗涤酶总活力
加入酶总活力
× 100 %
酶的结合效率= 加入酶总活力-未结合酶活力
加入酶总活力
×100%
固定化酶总活力回收率 = 固定化酶总活力
加入酶总活力-洗涤酶活力 ×
100%
2 结果与分析
2.1 不同 pH磷酸缓冲液对绿豆芽 SOD提取结果的
影响
不同 pH磷酸缓冲液对绿豆芽 SOD 提取结果的
表 1 固定化酶制备加样表
Table 1 The formula on preparation of immobilized superoxide
dismutase
分离提取梁丽琴，等：绿豆芽中SOD的分离纯化、固定化及性质研究
凝胶浓
度/%
30 %凝胶
贮液/μL
2 %过硫
酸铵/μL
双蒸水/
μL
TEMED/
μL
绿豆芽 SOD
酶液/μL
17.5 5 830 100 3 950 20 100
20.0 6 670 100 3 110 20 100
22.5 7 500 100 2 280 20 100
25.0 8 300 100 1 450 20 100
27.5 9 170 100 610 20 100
28
影响见图 1。
图 1表明，磷酸缓冲液的 pH在 7.7～8.0范围内，
pH7.8时提取液中 SOD的活力最高，当缓冲液中含有
0.1 mmol/L EDTA时，溶液中 SOD的活力则大幅度升
高。因而取 0.05 mol/L pH7.8（内含 0.1 mmol/L EDTA）
的磷酸缓冲液来提取绿豆芽 SOD。
2.2 不同硫酸铵浓度对绿豆芽 SOD纯化结果的影响
不同硫酸铵浓度对绿豆芽 SOD纯化结果的影响
见图 2。
由图 2可以看出，用不同浓度的硫酸铵处理绿豆
芽上清液，随着硫酸铵浓度的增大，沉淀去除的蛋白
质越多，但酶的活力回收也越低，从去杂蛋白和活力
回收这两方面考虑，以 40 %饱和度硫酸铵最佳，这样
既可以去除更多的杂蛋白又保留较多的酶。
2.1 DEAE-纤维素-柱层析
DEAE-纤维素-柱层析见图 3。
由图 3可以看出，吸光值曲线有一个高峰和一个
小峰，结合抑制率曲线分析可知小峰为杂蛋白。在吸
光值曲线高峰管附近选择酶活力较高的管进行电泳
和酶的固定化。
2.4 绿豆芽 SOD纯化结果
绿豆芽 SOD纯化结果见表 2。
由表 2可以看出，粗提液经盐析和层析之后，酶的
比活达到 4.662×10-5 kat/mg，总酶活回收率为 43.7 %，
纯化倍数为 26.4。
2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定绿豆芽 SOD蛋白质纯度
聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定绿豆芽 SOD蛋白质纯
度见图 4、图 5。
由图 4可以看出，未层析酶的电泳图中有 3 条
带，层析酶酶的电泳图中有 2条带。从有关资料查证
纯化 SOD酶的电泳图中有 2条带，因而说明层析酶为
纯化的 SOD。由图 5可知，层析酶的电泳图中有 2个
迁移率峰，再次说明层析酶已为纯化的 SOD。
2.6 H2O2和 KCN对绿豆芽 SOD活力的抑制
H2O2和 KCN对绿豆芽 SOD活力的抑制见图 6。
图 1 不同 pH缓冲液中的 SOD活力
Fig.1 Activity of SOD in different pH
18
17
16
15
14
SO
D
活
力
/U
7.70 7.75 8.00
pH
7.80 7.85 7.90 7.95
加入 EDTA
600
500
400
300
200
100
比
活
力
/（
U/
m
g）
原酶料
硫酸铵浓度/%
30 35 40 45
100
98
96
94
92
90
88
86
活
力
回
收
率
/%
比活力
活力回收率
图 2 不同硫酸铵浓度对 SOD纯化结果的影响
Fig.2 The effect of different ammonium sulfate coruentration on
the purify results
图 3 DEAE-纤维素-柱层析
Fig.3 DEAE-cellulose-column chromatography
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
A 2
80
0
管号
10 20 30 40
80
70
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
率
/%
蛋白 A280
抑制率
表 2 绿豆芽 SOD纯化结果
Table 2 The purified of mung bean sprouts SOD purified
项目 比活/（kat/mg） 回收率/% 纯化倍数
粗提液 1.767×10-6
盐析液 8.3×10-6 94.0 4.9
层析液 4.662×10-5 43.7 26.4
21 +
-
1.未层析酶；2.层析酶
图 4 电泳图
Fig.4 The electrophoretograms
0.300
0.280
0.260
0.240
0.220
0.200
0.180
0.160
0.140
OD
0 200 1 200
Mol. Weight in Rf
400 600 800 1 000
r2
r1
1ane 2
图 5 层析酶的电泳分析图
Fig.5 The electrophoretic analysis chart of purified enzyme
梁丽琴，等：绿豆芽中SOD的分离纯化、固定化及性质研究分离提取
29
由图 6可以看出，采用 1.5 %H2O2和 10 mmol/L
KCN作用于绿豆芽 SOD30 min（30 ℃），随着二者体积
的加大，H2O2和 KCN对 SOD活力的抑制也逐渐增加，
当二者体积分别增大至 30 μL及 600 μL时，绿豆芽
SOD的相对酶活力分别降低至 15 %及 7 %，这说明
H2O2和 KCN对 SOD活力的抑制很显著。而据资料[7]显
示，Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感，Cu，Zn-
SOD对氰化物和过氧化氢均敏感，Fe-SOD对氰化物
不敏感，这表明，绿豆芽 SOD为 Cu，Zn-SOD。
2.7 聚丙烯酰胺凝胶固定化 SOD
聚丙烯酰胺凝胶固定化 SOD见图 7。
由图 7可以看出，0.1 mL的绿豆芽 SOD游离酶经
固定化后活性下降。其中 22.5 %的聚丙烯酰胺凝胶作
包埋剂时活性较高。这是由于低浓度的聚丙烯酰胺固
定化凝胶较稀，网孔较大，经水洗时，可能损失较多，故
活性丧失较大。而高浓度的聚丙烯酰胺固定化凝胶较硬，
不利于催化底物发生反应，则固定化酶的活性比较小。
采用 22.5%的聚丙烯酰胺凝胶固定绿豆芽 SOD，对
固定化酶及游离酶的活力进行比较，结果如表 3所示。
从表 3可以看出，固定化酶的结合效率达 87.0 %，
其活力回收率为 80.9 %。固定化酶的酶活力小于游离
酶，其原因可能是酶分子在固定化的处理过程中，空间
构象会发生变化。酶固定化后，其分子的空间自由度受
到限制，影响酶分子活性中心对底物的定位作用。对于
大分子底物如蛋白质等生物大分子，酶反应的空间效
应表现的更为明显。同时因为载体的空隙太小，或者是
固定方式与位置不当，给酶的活性部位造成空间屏障。
这种空间屏障使酶分子的活性基团不易与底物或效应
物接触，其直接结果是影响固定化酶的活力。
3 结论
1）用 pH7.8 磷酸缓冲液（内含 EDTA）提取 SOD
效果较好，可达 3.571×10-7 kat /20 g绿豆芽。
2）用 40 %饱和度的硫酸铵处理 SOD粗提液，既可
以去除更多的杂蛋白又可保留较多的酶，此时 SOD的
比活为 8.301×10-6 kat/mg。经过进一步透析、DEAE-纤维
素-柱层析纯化后，酶的纯化程度可达 4.662×10-5 kat/mg
蛋白，总酶活回收率 43.7 %，纯化倍数 26.4。
3）SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析显示 SOD
主要由 2个亚基组成。
4）H2O2和 KCN对绿豆芽 SOD活力的抑制结果说
明绿豆芽 SOD为 Cu，Zn-SOD。
5）包埋剂聚丙烯酰胺凝胶浓度为 22.5 %时，固定
化酶的结合效率达 87.0 %，固定化酶的活力回收达
80.9 %。
参考文献：
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植物生理学报,1983, 9(1) :77-83
[2] 陈钧辉,陶力,李俊,等.生物化学试验[M].3版.北京:科学出版社,
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鉴定[J].云南化工,2000,27(3): 17-19
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和性质研究[J].生物化学与生物物理学报,1992,24(2): 180-183
收稿日期：2012-10-09
图 6 H2O2和 KCN对绿豆芽 SOD活力的抑制
Fig.6 The results of H2O2 and KCN in hibiting the activity of mung
bean sprouts SOD
100
80
60
40
20
0
酶
相
对
活
力
/%
0
H2O2体积/μL
5 10 15 30
H2O2体积
KCN体积
20 25
0
KCN体积/μL
100 200 300 600400 500
图 7 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶固定化 SOD活力
Fig.7 The activety of SOD immobilized with different
concentration of polyacrylamide gelatin
25
20
15
10
5
0固
定
化
SO
D
活
力
/U
17.5 20.0 27.5
聚丙烯酰胺凝胶浓度/%
22.5 25.0
表 3 固定化结果
Table 3 The results on immobilizing superoxide dismutase
分离提取梁丽琴，等：绿豆芽中SOD的分离纯化、固定化及性质研究
项目 SOD活力/（×10-6 kat） 项目 比率/％
游离酶 0.578 未包埋酶 13.0
洗涤酶 0.075 酶结合效率 87.0
固定化酶 0.407 固定化酶活力回收 80.9
30