全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 26( 1): 89～ 92, 2000
Journal of Zhejiang University ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 1999-01-12
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39570431)
作者简介: 董尚胜 ( 1966-) ,男 ,浙江浦江人 ,硕士 ,副教授 ,主要从事茶及茶用香花生理生态方面的研究 .
文章编号: 1008-9209( 2000) 01-0089-04
栀子花中糖苷酶的分离及其与醇系香气形成的关系
董尚胜 , 童启庆
(浙江大学 茶学系 ,浙江杭州 310029)
摘　要: 利用柱层析法对栀子花中糖苷酶进行了分离收集 . 通过对 β -葡萄糖苷酶、β -木糖苷酶和 β -樱草
糖苷酶三种酶活性的测定 ,收集液被划分为 A～ K共 11个分部 ,利用各分部与栀子花的粗香气前体物
进行香气生成反应 ,来分析各分部与 Z-3-己烯醇、莰醇、芳樟醇、 牛儿醇、苯甲醇、 2-苯乙醇、丁子香酚
七种香气生成的关系 . 结果表明: β -葡萄糖苷酶和 β -樱草糖苷酶的活性在 H分部最高、β -木糖苷酶的活
性在 F分部最高 ;莰醇、芳樟醇、 2-苯乙醇、 Z-3-己烯醇、 牛儿醇均以 F分部的生成量最多 ;丁子香酚、
苯甲醇的生成高峰分别在 E与 I分部 .七种醇系香气总量中 2-苯乙醇、 Z-3-己烯醇占明显多数 .此外 ,以
从山茶花中提纯的丁子香酚基 -β-樱草糖苷为底物的对比试验结果表明: β -樱草糖苷酶确能水解樱草糖
苷键 ;栀子花与山茶花的丁子香酚生成途径可能不同 .
关　键　词: 栀子花 ; 糖苷酶 ; 香气
中图分类号: S573; TQ243; TS201. 2　　　文献标识码: A
DONG Shang-sheng , TONG Qi-qing (Dept. of Tea Science , Zhe jiang Univ . , Hangzhou 310029, China)
Glycosidases separation and their relation to alcohol aroma product ion in the flowers ofGardenia Jasmi-
noides E . Journa l of Zhejiang Univ ersity ( Agric. & Life Sci. ) , 2000, 26( 1): 89～ 92
Abstract: Glyco sidases were sepa rated with CM-Toyopea rl 650M co lumn ch romatog raph y in this study.
The collected liquid w as divided into elev en f ractions from A to K by the activ ities of three gly cosidases β-
Gluco sidase,β -Xylo sidase and β-Primevero sidase. The relationship betw een the pro tein f ractions and the
seven ar oma productions was examined by observing the ar oma-producing r eaction of primarily pr epared
a roma precur sor ex tract in the flowers of Gardenia Jasminoides E. . It was found tha t the highest β -Glu-
cosidase andβ -primeverosidase activities w ere in H-f raction, while the gr ea test β-Xy losidase activity wa s in
F-fraction. The enzyme activ ity o f indiv idua l frac tion show ed evident difference in the production of the
seven aromas. H-f raction r esulted in the production o f borneol, lina lool, 2-pheny l ethanol, Z-3-hexenol
and geraniol, w hile E-fraction brough t the high est eugenol pr oduction and I-fraction gave th e maximum
benzy l alcohol output respectiv ely. Of th e seven a lcoh olic aromas, 2-pheny l ethanol and Z-3-hexenol con-
stituted the majority of to tal production. In addition, the experiments in eugenol-primeveroside ex tracted
a s substra te from Camellia sasanqua L. show ed that β-primevero sidase can really hydroly ze the g lyco sidic
bond in primeveroside and th ere may ex ist different pathw ays o f eugenol synthesis in Gardenia Jasminoides
E. and Camellia sasanqua L. .
Key words: Gardenia Jasminoides E. ; glycosidase; aroma
　　在自然界 ,许多植物有着天然的花香 ,这不
仅给人带来多方面的享受 ,也是诱导昆虫行为
的特异性刺激物 ,随着香气分析技术的和香料
工业的不断进步发展 ,分子水平上的香气形成
机理研究已日益受到重视 . 醇系香气作为植物
自然香气中的一大类已成为目前香气研究中的
一个热点 ,分离纯化植物中的香气前体物质和
探明分解这些前体物质的酶 ,是研究醇系香气
形成机理的两个基本点 . 作者在研究中对栀子
花中的糖苷酶进行了适当的分离 ,并探讨了糖
苷酶与栀子花主要醇系香气成份形成的关系 .
1　材料与方法
1. 1　材　料
栀子花: 采自自然生长的成年栀子树 ;山茶
花:采自自然生长的成年山茶树 ; 4-甲基伞形糖
基 β-葡萄糖苷 ( 4-MUβ -Glc): SIGMA公司产
品 ; 4-甲基伞形糖基 β-木糖苷 ( 4-MUβ -Xyl ):
SIGMA公司产品 ; 4-甲基伞形糖基 β -樱草糖苷
( 4-MUβ-Pri):用木糖和 4-MUβ-Glc(均为 SIG-
M A公司产品 )自制 .
1. 2　方　法
1. 2. 1　酶纯化　　栀子花→制丙酮粉→ 0. 1
mol /L柠檬酸缓冲液抽提→ 50%丙酮沉淀→
20%～ 80%硫酸铵沉淀→透析 ,浓缩→过 CM-
Toyopearl 650 M柱 ( 0～ 0. 5 mol /L NaCl洗脱 ,
流速为 2 mL /min,按 10 mL /管收集 130管 )→
得到各分部 .
1. 2. 2　粗香气前体物提取　　栀子花→ 95%
甲醇抽提→过 XAD-2柱 ( H2O /甲醇分取 ) →
取甲醇相过 ODS柱 ( 50% M eCN洗脱 ) →冻干
备用 .
1. 2. 3　丁子香酚基 -β-樱草糖苷提取　　山茶
花嫩叶→ 80%甲醇抽提→过 XAD-2柱 ( H2O /
甲醇分取 ) →甲醇相干燥→水溶 ,去不溶物→
冻干备用 .
1. 2. 4　酶活性测定　　 4-MU法 ( 0. 2 mmol /
L 4-MUβ -糖苷 50μL→加酶液 20μL, 0. 1
mol /L柠檬酸缓冲液 30μL→ 37℃反应 0～ 30
min→测发射波长 448 nm荧光强度 )
1. 2. 5　香气生成反应　　取 A～ K各分部酶
液 4 mL( 70 g鲜花相当量 ) ,加入香气前体物 2
mL( 50g鲜花相当量 ) , 37℃振荡反应 24 h ,
CH2 Cl2抽提 .
1. 2. 6　催化丁子香酚基 -β-樱草糖苷的反应　
　取 A～ K各分部酶液 200μL( 3 g鲜花相当
量 ) ,加入 80 mmol /L丁子香酚基 -β-樱草糖苷
100μL( 1 g鲜花相当量 ) , 37℃振荡反应 24 h ,
CH2 Cl2抽提 .
1. 2. 7　香气成份定性　　用 GC-M S法 .
1. 2. 8　香气成份定量　　用 GC定量法 .
1. 2. 9　糖分析　　用 HPLC法 . 将 1. 2. 6的
反应残液过 Sep-Pak( C 18)柱 ,收集水溶部分 ,
供 HPLC作糖分析 .
2　结果与分析
2. 1　 CM-Toyopearl 650 M柱层析分部结果
　　栀子花中的酶液经 CM-Toyopearl 650 M
离子交换柱层析分离后得到 130管收集液 ,各
管收集液经 β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶和 β -樱
草糖苷酶三种水解酶活性测定后得到酶活性峰
形结果见图 1.
　　图 1中 ,根据三种酶活性的峰形 ,收集液被
划分为 A～ K共 11个分部 .将相同分部各管合
并浓缩 ,测定三种酶的总活性 ,结果见表 1.
2. 2　各分部催化栀子花香气前体物的香气生
成情况
　　 A～ K各分部与栀子花粗香气前体物经香
气生成反应后得到的 7种醇系香气生成量见表
2所示 .
表 1　各分部收集液的糖苷酶活性
Table 1　 Glycosidase activi ties corresponded to Frs. A-K U　
糖苷酶 收　集　液　分　部
A B C D E F G H I J K
΢
β-葡萄糖苷酶 0 3 000 100 50 100 50 650 4 200 100 75 0 8 325
β-木糖苷酶　 0 1 750 0 50 370 1 600 250 75 50 50 0 4 195
β-樱草糖苷酶 0 95 0 0 15 15 30 230 10 55 0 450
90　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 6卷　
○葡萄糖苷酶活性　◇木糖苷酶活性　△樱草糖苷酶活性
图 1　栀子花中糖苷酶经 CM-Toyopearl 650 M柱层析后的活性分离状况
Fig. 1　 CM-Toyopearl 650 M column ch romatog raph y of glycosidases f rom Gardenia jasminoides E.
表 2　各分部收集液催化七种香气的生成量
Table 2　 Amounts of alcoh olic aroma formed af ter reaction of Frs. A-K wi th glycosidic f ractions μg　
香气成分 收　集　液　分　部
A B C D E F G H I J K
∑
莰　醇 0 0. 3 0. 1 0 3. 0 1. 7 1. 8 6. 1 1. 9 0. 1 0 15. 0
芳樟醇 1. 6 1. 0 0. 9 1. 1 2. 0 3. 2 4. 4 4. 8 2. 5 1. 3 2. 0 24. 8
2-苯乙醇 1. 0 2. 0 1. 0 1. 5 3. 5 3. 0 8. 0 17. 0 4. 5 1. 0 1. 5 44. 0
Z-3-己烯醇 0. 5 1. 5 0. 5 0. 5 3. 5 5. 5 11. 5 17. 0 3. 5 0 0 44. 0
牝尤彡牛儿醇 0 0 0 0 0. 7 0. 7 0. 1 0. 2 0 0. 5 0 2. 2
苯甲醇 0. 5 0 0 0. 2 0. 1 0. 2 0 0. 6 1. 8 0 0. 2 3. 6
丁子香酚 0. 2 0. 1 0 0. 1 0. 3 0. 1 0 0 0 0 0 0. 8
∑ 3. 8 4. 9 2. 5 3. 4 13. 1 14. 4 25. 8 45. 7 14. 2 2. 9 3. 7 134
　　表中可见 ,莰醇、芳樟醇、 2-苯乙醇、 Z-3-己
烯醇、牝尤彡牛儿醇均以 F分部的生成量最高 . 其
中 ,牝尤彡牛儿醇仅生成于 H, E, F, J, G分部 , G的
生成量较少 ;芳樟醇在每一分部均有较多生成 ,
从 D至 H有渐增的趋势 ; 2-苯乙醇与 Z-3-己烯
醇也有从 D至 H的渐增趋势 ,生成量主要集中
于 E至 I的范围内 ;莰醇的生成也主要集中于
E至 I,但在 H, E处各有一个高峰 .丁子香酚的
生成量以 E分部最多 ,主要集中于 E, A, B, D,
F五分部 .苯甲醇的生成高峰在 I分部 , A, H两
分部有较多生成 , D, E, F, K则生成较少 . 从七
种醇系香气的累计总量来看 ,约 85%的生成量
集中于 E至 I的范围内 ,其中以 H最高 ,占
44% .从各种香气的量的构成来看 , 2-苯乙醇和
Z-3-己烯醇占明显多数 ,两者均占七种香气总
量的 32. 8% .
2. 3　各分部催化丁子香酚基-β-樱草糖苷的香
气生成情况
A～ K各分部催化栀子花粗香气前体物及
丁子香酚基-β -樱草糖苷后的丁子香酚生成量
差异见表 3.
　 表 3　各分部收集液不同香气前体物时的丁子香酚生成量
Table 3　 Amounts of eugenol form ed af ter reaction of Frs. A-K wi th di fferent precursor μg　
香气成分 收　集　液　分　部
A B C D E F G H I J K
∑
Ⅰ 0. 16 0. 11 0 0. 09 0. 25 0. 08 0 0 0 0. 04 0 0. 73
Ⅱ 0 21. 5 0. 5 0 3. 0 6. 9 6. 8 7. 2 0. 5 0. 5 0 46. 9
　　注: 底物Ⅰ 为栀子花粗香气前体物 ,Ⅱ为丁子香酚基 -β-樱草糖苷 .
91　第 1期 　 董尚胜 ,童启庆　　栀子花中糖苷酶的分离及其与醇系香气形成的关系 　 　　　　
　　表 3中 ,以丁子香酚基 -β-樱草糖苷 (Ⅱ )为
底物时 ,丁子香酚生成量以 B分部最高 , C, E,
F, G, H, I, J各分部均有生成 ,且 H, F, G, E的
生成量也较多 . 而以栀子花粗香气前体物 (Ⅰ )
为底物时的丁子香酚生成量明显以 E分部最
高 ,可见催化香气生成的酶收集液有明显不同 .
且从丁子香酚的绝对生成量来看 ,用丁子香酚
基-β -樱草糖苷为底物时 ,生成量要高数十倍 .
2. 4　丁子香酚基 β-樱草糖苷酶解后的糖分析
　　各分部收集液与丁子香酚基 β-樱草糖苷混
合反应后 ,经 CH2 Cl2萃取 ,剩余的水溶液经
HPLC糖分析 ,得到结果见图 2.
图 2　 A-K各分部催化丁子香酚基 β-樱草糖苷后的 HPLC糖分析结果
Fig. 2　 HPLC analysis of s ugars released af ter reaction of each f raction ( A-K) wi th eugenylβ-primev erosid e
　　图 2显示 ,在 B, E, F, G, H, I六种反应液
中均检测到了樱草糖的存在 ,从而证实了该六
种反应液中生成的丁子香酚确系由丁子香酚基
β -樱草糖苷被 β -樱草糖苷酶水解后生成的 .
3　讨　论
在植物香气成份的次生代谢机理中 ,制约
醇系香气生成的两大因素是香气前体物的积累
和开花过程中的酶活性变化 [1 ] ,本试验结果表
明 ,不同分部的酶液催化生成香气的种类和量
是不同的 , E至 I分部的酶液与醇系香气生成
的关系较为密切 ,将这部分酶液进行细分 ,以进
一步明确各种香气成份的形成机理 ,显得很有
必要 . 其中 H分部的 β -葡萄糖苷酶和 β -樱草糖
苷酶活性均为最高 ,同时这一分部催化的莰醇、
芳樟醇、 2-苯乙醇、 Z-3-己烯醇、牝尤彡牛儿醇生成
量均最高 ,这些香气的生成是否决定于 β -葡萄
糖苷酶或 β -樱草糖苷酶或其它未被测定的酶活
性 ,尚不能一概而论 . 但已有报道称 ,从栀子花
中分离到了糖苷类香气前体物莰醇基 β -樱草糖
苷和苯乙基 β -樱草糖苷 [2 ] ,由此推测 ,莰醇和 2-
苯乙醇的生成与 H分部的 β-樱草糖苷酶活性
有关 .糖分析结果表明 ,樱草糖苷是在 β -樱草糖
苷酶作用下一次水解释放出樱草糖 ,排除了樱
草糖苷先被切下木糖 ,后再由 β-葡萄糖苷酶水
解释放香气的可能性 .此外 ,用栀子花粗香气前
体物作底物时的丁子香酚生成情况与用丁子香
酚基 -β-樱草糖苷作底物时有明显差异 ,表明栀
子花中不一定存在丁子香酚基-β -樱草糖苷 ,栀
子花中的丁子香酚可能是通过其它前体物及其
相应的未知酶作用下而释放的 .
参考文献:
[ 1 ]　 Eran Pich ersky, Robert A. Eaguso, Ef raim Lew insoh n,
et al . Floral scen t production in Clarkia ( Onagraeeae)
[ J] . Plant Physiol , 1994, 106: 1533-1540.
[ 2 ]　 Watanabe N, Moon Jaehak. Formation of f low er f ra-
grance compound s by enzymat ic action during flow er
opening [ A]. Proceed ings of 13th International
Cong ress of Flavour , Fragrance and Essential Oil s [C ] .
Istanbul, Turkey: [ s. n. ] , 1995.
(责任编辑　杜玲玲 )　　
92　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 6卷