全 文 ：第 2 8卷第 3期
19 98 年 9 月
复 旦 学 报 (自然科学版 )
Jo t u l 以 1 o f F bad n U ul v e反 ty (aN t喷 1 S e le n c e )
V o l
.
28 N o
.
3
eS P t
.
198 9
苏铁树叶细胞质 5 5 r R N A 的一级
结构分析
周 雪琼 王鸣咬
(复 旦 大 学 )
.刘 望夷
(上海生物化学研究所 )
提 要
用热酸法抽提苏铁 ( O脚as 犷 “哪乙耐a) 树叶细胞质的总 R N A , 经 10 % 聚丙烯
峨胺凝胶 电泳分离得到 5 5 r R N A . 用核糖核酸酶和化学降解凝胶直读法测 定
出 5 5 r R N A 的一级结构由 121 个核普酸组成 , 且 3忆端有连续三个尿普酸 . 并
具有真核生物 5 5 r R N A 的一般结构特征 . 按真核生物 5 5 r R N A 的二级结构
模型 ,构建了苏铁树叶细胞质 5 5 r R N A 的二级结构 .
关键词 : 苏铁 , 细胞质 , 结构分析 ; 5 5 r R N A .
_ 肆
核糖体是蛋白质生物合成的唯一场所 . 它存在于一切生物的细胞质 、 线粒体和叶绿
体之中 . 研究核糖体 R N A ,对于深入了解蛋 白质合成的机理和生物的进化过程具有重大
意义 . 真核生物的核糖体由大 、小两个亚基组成 , 5 5 r R N A 是核糖体大亚墓中一个稳足
的组分 , 具有相当保守的一级和二级结构 . 在研究生物进化和个体发育中 , 5 5 r R 丫 A 越
来越受到重视山 . 从 1 9 6 8 年 B or w n le 等测定 了第一个 5 r R N A 以来 s[J , 到 目前力止 ,
共测定了 3 50 多个 5 r R N A 的一级结构闭 .苏铁树是一种古老的裸子植物 , 有活化石之称 . 地球撇存的苏铁有 1。 属 、 1。。种
左右〔` , . 我国仅有一属 , 共 9 种 . 本实验以苏铁树叶为材料 , 研究了其细胞质 5 0 r R N人
的结构 .
一 、 材 料和 方 法
1
. 材料
苏铁树叶从中国科学院上海分院花房采得。
2
. 细胞质总 R N A 的制备
阵 本文 19 87 年 5月 2 3 日收到
.
3 26 复 且 学 报 (自然科学版 ) 第 28 愁
新鲜苏铁树叶用蒸馏水洗净 , 吸干 、 剪碎 , 每克树叶加 3 . Om l 抽提液 (。 . 05 m ol / L
丁 r j s一C I , pH 7 . 5 , 0 . 0 1坦 0 1/ L K C I ; 0 . 0 1 m o l / L 疏基 乙醇 , l o nmr o l / L M g o l: ) . 快速匀浆 (每分钟 3次 ) ,离心弃去细胞核 、 细胞碎片等杂质沉淀 . 上清液离心 .l0 创 n (2 0 0 09 ,
4 oC )
,弃去叶绿体沉淀 , 上清液再离心 10 面 n ( 40 0 0勺 , 犷O ) ,弃去线粒体等杂质 . 参照
M an iat sj 的方法从上清液中抽提总 R N 人 .1[ . 于上清液中加入等体积水饱和酚 (水饱 和
酚 :间甲酚 : 8一经基咬琳 = 60 0心 : 70 m l : 。 . 5 9 ) . 在 6。 ,O 激烈振荡 15 m in 后 ,离心 1 0n 吐h
( 2 。。g0 , 4 O )C ,弃去下层有机相 . 水相中加入等什积水饱和酚与氯仿一异戊薄 ( 24 , 1) 再抽
提 . 最后加入级仿一异戊醇抽提 , 其余操作同第一次 . 用 2 . 5 倍体积的95 终乙醇 (含 2那
又 AO) 沉淀出水相中的 R N A . 真空干燥 ,得总 R N A 粗制品 , 于低温冰箱 ( 一 2 00 )贮藏
备用 .
3
. 细胞质 5 5 rR N A 的制备
参照赵最等人的方法进行 〔 . 〕 . 10 拓聚丙烯酞胺凝胶含 7 . 8 m o l/ L 脉素 , 电泳缓冲液
内含 89 ~ ol / L T
r 坛一硼酸 , 2 . Om o ol / L E D T A , p R S . 3 . 电泳时电压为 1 5 0 V , 电流为
2 0坦A . 电泳完毕后 , 在紫外灯下切下 5 5 r R N A 条带 ,浸泡在 N E S 抽提液 ( o . s m ol / L
N .R A O
, 。 . 1
~
ol L/ E D T A
, 。 . 1环 s D )S 中 , o4 C 过夜 . 次日在抽提液中加入 95 拓 乙
醇 , 沉淀出 5 5 rR N A , 离心 ,真空干燥后贮藏于 一 20 ℃低温冰箱备用 .
4
. 细胞质 sa r R N A 一级结构测定
5 5 r R N A 按 r ae t le 的化学部分降解凝胶直读法 (胶浓度为 20 % )和 D O n is 一K e n er
的核糖核酸酶专一降解凝胶直读法 (胶浓度为 15 拓 ) 测定序列〔1一】. 本实验条件略有不
伺 ,见参考文献〔1 0〕和〔 1 1〕.
二 、 结 果 和讨 论
1
. 细胞质 R N A
图 1 苏铁树
叶 细胞 嗽小
分子 R互入 的
1。绍聚丙始陇
胺凝胶电泳
1为 苏 铁树叶
细胞质小 分 子
R N A ; 2为醉
母小分子 R N人
的制备
苏铁树叶经充分匀浆 、分步离心后 , 得到无细胞核 、 树
叶碎片 、 叶绿体 、线粒体和细胞碎片的细胞质上清液 . 用苯
口酚和抓仿在热变性条件下处理细胞质上清液 , 经乙醇沉淀
得总 R N A . 用 1。终聚丙烯酞胺凝胶电泳鉴定细胞质小分
子 R N A , 用已知 S 值的酵母小分子 R N A 作为对照 . 与其
它真核生物一样 , 苏铁细胞质核糖体含 有 5 . 8 5 rR N A 和
5 8 rR N A 两种组分 (图 1) . 由于 R N A 容易被核搪核酸酶
降解 ,所以在整个制备过程中必须保持低温 , 并加入核糖核
酸酶抑制剂 . 为了增强蛋 白质变性效果 , 提高 R N A 抽提
产率 , 用苯酚和氯仿两种变性荆 , 在热变性条件下 制 备
R N A二 , ` ,2 . 细胞质 5 5 r R N A 的结构分析
用化学部分降解凝胶直读法 、 核糖该酸酶专一降解凝 月
甲 策 8斯 周雪琼等 : 苏铁树叶细胞质 65 r R N A 的一级结构分析
胶直读法测定 3 ,一端标记和 5, 一端标记 5 5 r R N A 的一级结构 , 结果如图 2 所示 . 苏铁树
叶细胞质 5 8 r R N A 有 121 个核昔酸 , 其 3’ 一端有连续 3个尿普酸 , 比 H or i 等公布的顺序
多一个尿普酸 〔 1 , , . 我们的证据如下 : ( 1) 3’ 一端 。 sP 标记的苏铁树叶细胞质 S S r R N A ,
用 P ea t ie 的化学降解凝胶直读法测定出其一级结构 , 3 ,一端有连续三个尿昔`酸 (图 3 ) ,
( 2) 3气端 “ , P 标记的苏铁树叶细胞质 5 5 rR N A 经核搪核酸酶专一降解凝胶直读法测
定 , 得其 3仁端有连续两个尿普酸 ,见图 4( 根据此法的测定原理 s[ , . 〕 , 3几端的最后一个核
10 2 0 3 0 4 0
P GG G U G OG A U C A U A OC人G C G U U A A U G O A C CG G A U C C C A U C A
5 0 6 0 7 0 8 0
G A A C U C C G C A G U U A A GC G C G C U U G G G U U G G A G U A G U A C U A
90
G G A U GG G U G A
1O0
(又) U CC U召GG A 1 1 0A G U C C U A A U A 1 2 0U U G C A C C C U U U O H
图 2 苏铁树叶细胞质 6吕 r R N A 的一级结构
`律
卜
图 3 . 、 二 , ,。 一~ ~ 。 、 、。 侧定
6 5 r R N A 顺序
2为 A > G 反应 ; 3为 O> U
图 4 . 核搪核酸酶专一降解凝胶直读法测定
5 5 r R N A 顺序
1为 G 反应 ;
反应 ; 4为U 反应 ; O 为对照反应
味
一 E ,毛 为不加酶的对照和 ` 梯子 , 对照 ; T : 为 R N as O T :
晦反应 ; U : 为 R N a 3 e U : 酶反应 ; P 为 R N a , . p冲M
酶反应 号 A 为 R N as e A 酶反应
复 旦 学 报 (自然科学版 ) 第 28 卷
`
(二)
不 2 0
,
-
夕
、 、 )产
t’- 、、 . 夕
一 ~ . . . . . . . . . . . . . 闷 1
图 5 苏铁树叶细胞质
5 5 r R N A 3, 一末端鉴定
1为 3, - A M P ; 2 为 8 1一 C M P ;
3为 3 , - G M P ; 4 为 3 ,一 U M P
普酸是测定不出的 ) , (3 ) 用核糖核酸酶 T : 水解 3忆端 . , P
标记的 5 5 r R N A , 经过微晶纤维素薄板双向层析 ,鉴定出其
3` 一末端也为尿普酸 (图 5 ) . 所以 , 无论是化学法还是酶解法
都证明了 5 5 r R N A 的 31一末端有连续三个尿昔酸 . 用核糖
核酸酶专一降解凝胶直读法测定 5 `一端标记 5 5 r R N A 的结
果在此略去 .
高等植物细胞质 5 5 r R N A 结构间的差异一般很小 , 仅
在 3 ,一端和 5’ 一端核普酸的数目和种类的变化上大一些 . 苏铁
树叶细胞质核糖体的 5 8 rR N A 一级结构符合一般真核生物
中 5 5 r R N A 的一级结构特征 .在 5 5 r R N A 的 41 一“ 核替
酸位具有高等植物的保守序列 G A A C (图 2 中用一标出 ) , 低
等藻类在此位置也有 G A A C 序列 , 但动物 、 酵母和其它霉菌
等则 为 G A U C (个别是 G A U U )〔loJ . 有人认为 , 5 5 r R N A 的这一保守序列 , 是在蛋 白质
生物合成中与 tR N A 中的 C T冲C 配对后再行使功能的〔卫。 , . 一般真核生物中的 5 5 r R N A
都具有 36 个保守位点 , 但在苏铁树叶细胞质 5 5 r R N A 中只有 35 个保守位点 (图 2 中
用 , . 标出 ) . 一般真核生物在第 1 10 位上的保守位点是G , 但在苏铁树叶细胞质 5 5 r R N A
中是 A (图 2 中用 二 标出 ) . 目前已测出真核生物 5 5 rR N A 的一级结构中 , 仅有两个与
苏铁树叶细胞质 5 5 r R N A 的第 n 。 位点相同 , 即隐芽植物 ( ho 郁咖。。 as 夕a化。 `面“ 。 )
和松柏门植物 (万 e tas 四瓦 a gl 妙苦os t“ 石时山 s) , 而约有 60 拓原核生物 5吕 rR N 人 的第 1 10
位点为 A . 我们认为这一差异在分子水平上体现 了苏铁树的古老和原始性 .
按照 D e il h aS 的真核生物 5 5 r R N A 二级结构模型 〔川 , 我们构建了苏铁树叶细胞质
5
r R N A 二级结构模型 (图 6) . 它是一个五茎五环结构 , 41 ~ 4 位的保守序列 G A A O
在发夹环 13 上 ,环 n 为多支环 ,其中有保守序列 C A U A . 从这个模型上看 , 它的大部分
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图 6 苏铁树叶细胞质 65 r R N人 的二级结构模型
U
,
L Z
,
L s
,
4L
,
L S 为五个配对区 ;环 1 1 为多支环( M u l击xb ar n e h ed ]o P ) ;环 12
和环 1 4 为内部环 ( I n t e r io r 】DO P ) ;环 18 和环 I石为发夹环( H al 印垃 k 幻P )
第 . 期 周雪琼等 : 苏铁树叶细胞质 6 5r R N A的一级结构分析 3 2 ;-
保守位点均在单链区 , 这为 5 5 r R N A 在蛋 白质生物合成中行使功能提供了结构上的保
证 , 因为只有单链区才有利于 同其他分子上的相应碱基配对 .
另外 , 我们还测定了苏铁树叶绿体 5 5 r R N A 的一级结构 〔且 6’ , 并将这种叶绿 体 5 5
rR N A 与其他 14 种植物叶绿体 5 5 r R N A 进行了比较进化研 究 , 详 细情 况 请见文 献
〔1 6〕 .
参 考 文 献
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3 0 复 旦 学 报 (自然 科 学版 ) 第 28卷
NU C LEO I T DE S EQ U E NC E O FA C Y O T P LAS I TC I RO BSO M A L
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T o t a l o y t o P l a s t i e R N A s w e r e i s o l a t e d f r o m C如 a s 犷 e o o Z“ `a I e a v e , w i t h t h e
Ph e n o l n l e t h o d
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T h e 5 5 r R N A w a s s e p a r a t e d b了 1 0形 P o l了a e r 了 la , n ld e g e l e l e c t r o p h o -
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n u e l e o t id e s e q u e n e e w a s d e t e r i n in e d b y b o t h t h e e h e m i o a l I n e t h o d a n d t h e e n z y xn卜
t ie m e t h o d
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T h e 5 5 r R N A 15 t y p i e a
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K e y w o r d 。 : e了e a d a e e a e , e y t o p l a s m , s t r u e t u r a l a n a l了。 15 ; 5 5 r ib o s o m e R N A ·