全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2013 年
收稿日期：2012－10－15
基金项目：浙江省科技厅公益技术研究社会发展项目（2010C33072）；浙江医药高等专科学校重点科研项目（ZPCSR2010001）
作者简介：叶选怡（1965－），女，浙江青田人，副教授，硕士，主要从事微生物学、发酵工程与技术的教学与科研工作，（电话）13646659340
（电子信箱）2634052193＠qq．com；通讯作者，凌庆枝（1963－），男，教授，（电话）0574－88227845（电子信箱）lingqingzhi＠sina．com。
第 52卷第 6期
2013年 3月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 52 No.6
Mar．，2013
漆酶（Laccase，EC1．10．3．2）是一种含铜的多酚
氧化酶，与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白和胞外
胆红素氧化酶同属于铜蓝氧化酶（Blue multicupper
oxidase）家族［1，2］。1883年，日本学者吉田（Yoshida）［3］
首次从日本漆树（Rhus verniciflua）树汁中发现了一
种可以使树漆迅速氧化、硬化的酶；1894 年，这种酶
被分离纯化，并被命名为漆酶 ［4］。 多年来的研究证
明，漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌、少数昆
虫和细菌中， 尤其在白腐真菌系统中分布更为广
泛，现已成为研究的热点。 漆酶具有的独特功能使
其具有巨大的生物利用潜能， 如纸浆的去木质化、
染料脱色、废水脱毒、食品加工和制药等［5］。
亮菌（Armillariella tabescens）又名假蜜环菌，因
由柳树发光朽木分离出菌种， 菌丝体在暗处有荧
光，故称亮菌［6］。 亮菌中含有亮菌甲素、乙素、丙素、
氨基酸、多糖等多种化学成分。 民间用亮菌治疗胆
囊炎和传染性肝炎有显著效果，现代药理研究表明
亮菌具有醒酒［7］、保肝［8］、防辐射［9］、增强免疫 ［10］和抗
肿瘤［11］等多种功效。 为此，在前期工作的基础上，以
漆酶酶活为检测指标，对亮菌液体发酵和固体发酵
产漆酶的条件进行了研究。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌种 亮菌（Armillariella tabescens）菌
种由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，培养
亮菌产漆酶的液体和固体发酵条件优化
叶选怡 1，杨丽红 2，凌庆枝 3，董丽辉 3，何军邀 3，张 超 2
（1．丽水学院生态学院，浙江 丽水 323000；2．安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001；
3．浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100）
摘要：为了探讨液体和固体发酵条件对亮菌（Armillariella tabescens）产漆酶的影响，采用正交试验对亮菌
液体和固体发酵产漆酶培养基和培养条件进行筛选。 供试亮菌在液体培养时产漆酶甚微，在培养基和培
养条件优化后最高酶活为 7．92 U ／ mL；固体发酵时在以葡萄糖浓度 0.6%、稻草麦麸质量比 3∶7、温度
27 ℃、含水量 65％、接种量 11mL/100 g培养时漆酶酶活可达 3 496.7U ／ g。 固体发酵的酶活显著高于液体发
酵，固体发酵更适宜亮菌产漆酶。
关键词：亮菌（Armillariella tabescens）；漆酶；液体发酵；固体发酵
中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2013）06－1410-05
Production of Laccase from Armillariella tabescens with Liquid and Solid Fermentation
YE Xuan－yi1，YANG Li－hong2，LING Qing－zhi3，DONG Li－hui3，HE Jun－yao3，ZHANG Chao2
（1．College of Ecology， Lishui University， Lishui 323000， Zhejiang， China； 2． Medical College of Anhui University of Science and
Technology， Huainan 232001， Anhui， China； 3．Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 315100，Zhejiang，China）
Abstract： To study the effect of liquid and solid fermentation conditions on laccase production from Armillariella tabescens，
the culture media and conditions for liquid and solid fermentation of A． tabescens was optimized through orthogonal test． Lac-
case activity of A． tabescens was very low by liquid fermentation； the highest enzyme activity was 7．92 U ／mL． Under solid
fermentation conditions， when mass ratio of straw and bran was 3∶7， temperature was 27 ℃， water content was 65％， inocu-
lum size was 11％， the enzyme activity reached up to 3 496 U ／ g， which was significantly higher than that of liquid fermenta-
tion． The solid fermentation was more suitable for laccase production by A． tabescens fermentation．
Key words： Armillariella tabescens； laccase； liquid fermentation； solid fermentation
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2013.06.013
第 6 期
保存于浙江医药高等专科学校实验室。
1．1．2 主要试剂 ABTS［2，2′－联氮－双（3－乙基苯
并噻唑啉－6－磺酸）二胺盐］购自美国 Sigma公司，愈
创木酚购自上海晶纯试剂有限公司，其他试剂均为
国产分析纯。
1．1．3 仪器与设备 TU－1810SPC 型紫外可见分光
光度计购自北京普析通用仪器有限公司 ，Biofuge
Stratos 冷冻离心机购自德国贺利氏公司，PHS－3C
型 pH 计购自上海精科仪器有限公司 ，BCM－1000
型生物净化工作台购自苏州净化设备有限公司 ，
SPX 智能型生化培养箱购自宁波江南仪器厂 ，
BS124S 型电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公
司，HH－2 型恒温水浴锅购自国华电器有限公司，
BSD－226SK型冰箱购自青岛海尔股份有限公司。
1．1．4 培养基 综合 PDA 固体培养基（%）：葡萄糖
2.0、 琼脂粉 1.8、 土豆汁 20、MgSO4·7H2O 0.15、
KH2PO4 0.3、VB1 0．005；液体种子培养基（1 L）：葡萄
糖 20 g、 蛋白胨 15 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 1
g、（NH4）2SO4 5 g、玉米粉 20 g、pH 6．0；液体发酵正
交试验培养基（1 L）［12］：小分子碳源、高分子碳源、无
机氮源、 有机氮源、CaCl2 1 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1
g、VB1 0．05 g、吐温－80 0．5 mL、微量元素 8 mL、pH
6．0； 液体发酵培养基微量元素 （1L）：MnSO4·2H2O
0．5 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0．1 g、ZnSO4·7H2O 0．1 g、
CuSO4·5H2O 0．1 g、H3BO3 0．01 g； 固体发酵正交试
验培养基（％）：葡萄糖、碳源、氮源、水、（NH4）2SO4
0．5、CuSO4 0．03、CaCl2 0．47、KH2PO4 0．5、MgSO4 0．2、
VB1 0．005、pH 6．0。
1．2 方法
1．2．1 培养方法
1）斜面及平皿菌种培养。 在无菌条件下接种斜
面和平皿培养基，于 26 ℃避光培养 7 d，于 4 ℃冰箱
保存，备用。
2）种子液培养条件。 250 mL 三角瓶装 100 mL
种子液培养基， 在无菌条件下用打孔器 （直径 0．5
cm） 量取 2 块平皿培养基的菌丝块接种至种子液
中，置于 27 ℃摇床以 120 r ／ min 避光培养 7 d。
3）液体发酵培养条件。 将种子液按 6％的体积
比转接，培养条件除试验特定其余均与种子液培养
条件相同，所有试验均重复 3次。
4）固体发酵正交试验培养条件。 将种子液按一
定的体积质量比转接，在试验条件下避光静置 30 d。
1．2．2 粗酶液的制备
1）液体发酵酶液的制备。 从液体培养的第 8天
开始，每天定时取样 2 mL，在 4 ℃、8 000 r ／ min 下离
心 10 min，上清液即为粗酶液。
2）固体培养基酶液的制备。 将固体培养基按质
量比 1∶1 加入去离子水、捣碎培养料并搅拌均匀，放
置于 4 ℃冰箱中浸泡 24 h，用八层纱布过滤，然后将
滤液于 4 ℃、8 000 r ／ min 下离心 10 min， 上清液即
为粗酶液，于 4 ℃冰箱保存备用。
1．2．3 漆酶酶活的测定 4 mL 反应体系中含 0．5
mmol ／ L 的 ABTS （反应底物）、0．1 mol ／ L 的柠檬酸－
柠檬酸钠缓冲液 （pH 4．0）、1 mL 稀释的粗酶液，于
35 ℃反应 5 min，在波长 420 nm 处测吸光度，取吸
光度变化的线性部分。 酶活定义：在一定条件下，每
分钟催化 1 μmol ABTS 氧化所需的酶量为一个酶
活单位，单位为 U。酶活＝△OD420 nm×稀释倍数×4 mL×
106 ／ （1 mL×△t×ε×1 cm）（ε 为消光系数，ε＝3．6×104
cm ／ （L·mol）。
1．2．4 亮菌产漆酶的液体发酵工艺
1）不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响。 对不
同碳源和氮源组合进行 L16（45）正交试验，试验因素
与水平见表 1，培养完成后测定亮菌漆酶酶活，分析
不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响。
2）不同培养基浓度对亮菌产漆酶的影响。 在上
一步试验得到的最优培养基组合基础上对培养基
不同浓度进行 L16（45）正交试验，试验因素与水平见
表 2。发酵完成后测漆酶酶活，分析不同培养基浓度
对亮菌产漆酶的影响。
3）不同培养条件对亮菌产漆酶的影响。 在优化
培养基前提下分别对装液量、接种量、菌龄和培养
时间进行 L9（34）正交试验，试验因素与水平见表 3。
发酵结束后测漆酶酶活，分析不同培养条件对亮菌
产漆酶的影响。
4）不同诱导剂对亮菌产漆酶的影响。 在以上最
佳培养基和培养条件下进行亮菌产漆酶诱导试验。
表 1 培养基组合试验的因素与水平
水平
1
2
3
10 g/L 小分子
碳源（A）
葡萄糖
蔗糖
麦芽糖
20 g/L 高分子
碳源（B）
淀粉
玉米粉
麦麸
3 g/L 无机
氮源（C）
硫酸铵
氯化铵
硝酸铵
15 g/L 有机
氮源（D）
酵母浸膏
蛋白胨
黄豆粉
因素
表 2 培养基浓度试验的因素与水平
水平
1
2
3
4
葡萄糖浓度（A）
g/L
0
5
10
15
淀粉浓度（B）
g/L
10
15
20
25
硫酸铵浓度（C）
g/L
1
2
3
4
酵母浸膏浓度（D）
g/L
10
15
20
25
因素
叶选怡等：亮菌产漆酶的液体和固体发酵条件优化 1411
湖 北 农 业 科 学 2013 年
试验设计 4组， 分别加入 0．5 mmol ／ L愈创木酚、0．5
mmol ／ L 吐温－80、0．5 mmol ／ L 苯酚 、0．2 g ／ L CuSO4
作诱导产漆酶试验，平行试验 3 组，分析不同诱导
剂对亮菌产漆酶的影响。
1．2．5 亮菌产漆酶固体发酵正交试验 选择葡萄
糖浓度、稻草∶麦麸（m/m，下同）、温度、含水量、接种
量 5 个因素进行 L16（45）正交试验，试验因素与水平
见表 4。发酵完成后测定漆酶酶活，分析不同培养基
及发酵条件对亮菌固体发酵产漆酶的影响。
2 结果与分析
2．1 亮菌产漆酶液体发酵结果
2．1．1 不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响 碳
源和氮源是影响亮菌菌丝生长和代谢的重要因素，
也是合成漆酶的重要原料。 试验分别以小分子碳源
葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，高分子碳源淀粉、玉米粉、麦
麸，无机氮源硫酸铵、氯化铵、硝酸铵，有机氮源酵
母浸膏、蛋白胨、黄豆粉组合为不同碳源和氮源，测
定不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响。 试验取第
10 天发酵液的酶活进行分析，结果表明，极差为有
机氮源﹥无机氮源﹥小分子碳源﹥高分子碳源，有
机氮源是影响亮菌漆酶酶活的关键因素，其他 3 个
因素也有一定的影响。 由图 1 可知，该菌发酵产漆
酶的最适条件组合为 A1B1C1D1， 即最适小分子碳源
为葡萄糖，最适高分子碳源为淀粉，最适有机氮源
为酵母浸膏，最适无机氮源为硫酸铵，该条件下产
生的漆酶酶活为 2．05 U ／mL，较其他酶活不足 1 U ／mL
的状况有显著提高。
2．1．2 不同培养基浓度对亮菌产漆酶的影响 在
上一步试验得到的最优培养基组合基础上对培养
基不同浓度进行正交试验， 并取第 10 天酶液酶活
进行极差分析。 结果表明，极差为酵母浸膏浓度﹥
硫酸铵浓度＞葡萄糖浓度＞淀粉浓度，酵母浸膏浓度
是影响亮菌产漆酶的关键因素。 由图 2 可知，亮菌
漆酶酶活最高的浓度组合是 A2B2C2D2 或 A2B4C2D2，
进行补充试验比较， 结果表明 A2B2C2D2组合酶活较
高，即在浓度组合葡萄糖 5 g ／ L、淀粉 15 g ／ L、硫酸铵
2 g ／ L、酵母浸膏 15 g ／ L 下，亮菌漆酶酶活达 4．97
U ／ mL。
2．1．3 不同培养条件对亮菌产漆酶的影响 在优
化培养基的前提下分别对装液量、接种量、菌龄和
培养时间进行正交试验， 并对其结果进行极差分
析。 结果表明，极差为菌龄﹥接种量﹥培养时间﹥
装液量，菌龄是影响亮菌产漆酶最重要的因素。 由
图 3 可知，亮菌液体发酵产漆酶的最优条件组合是
A2B2C2D2，对该组合进行补充试验，结果表明，该组
合是亮菌产漆酶的最优条件组合， 即在装液量 75
mL、接种量 6％、菌龄 7 d、培养时间 10 d 的条件下，
亮菌漆酶酶活最优，达 5．35 U ／ mL。
2．1．4 不同诱导剂对亮菌产漆酶的影响 在前面
最佳培养基和培养条件下进行亮菌产漆酶诱导试
验，以未添加诱导物的培养基作为空白对照，结果
见表 5。 由表 5 可知，以愈创木酚为诱导剂时，酶活
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
酶
活
//U
/m
L
小分子碳源（A）
图 1 培养基组合效应曲线图
表 3 培养条件试验的因素与水平
水平
1
2
3
装液量（A）//mL
50
75
100
接种量（B）//%
4
6
8
菌龄（C）//d
5
7
9
培养时间（D）//d
8
10
12
因素
表 4 固体发酵试验的因素与水平
水平
1
2
3
4
葡萄糖浓度（A）
%
0
0.3
0.6
0.9
稻草∶麦麸
（B）
6∶4
5∶5
4∶6
3∶7
温度（C）
℃
25
26
27
28
含水量（D）
%
55
60
65
70
因素
接种量（E）
mL/100 g
5
8
11
14
高分子碳源（B）无机氮源（C）有机氮源（D）
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
图 2 培养基浓度效应曲线图
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
酶
活
//U
/m
L
葡萄糖浓度
（A）
1
2
3
4
淀粉浓度
（B）
硫酸铵浓度
（C）
酵母浸膏浓度
（D）
1
2 3
4
4
4
3 32
2
1
1
图 3 培养条件效应曲线图
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
酶
活
//U
/m
L
装液量（A） 接种量（B） 菌龄（C） 培养时间（D）
3
3
33
2
2
2
2
1
1
1
1
1412
第 6 期
提高到 1．480 倍，吐温－80 和 CuSO4组几乎未变，苯
酚组酶活相对减弱。 总体上，诱导剂的加入使亮菌
产漆酶并未大幅度地提高。
2．1．5 4 次试验结果的比较 将亮菌液体发酵优化
试验依次表示为试验 1、试验 2、试验 3、试验 4，并
对各步最优漆酶酶活进行比较，结果见图 4。 由图 4
可知， 漆酶酶活随着发酵条件的改善逐步提高，但
最高酶活仍不理想。
2．2 亮菌产漆酶固体发酵正交试验结果
选择葡萄糖浓度、稻草∶麦麸、温度、含水量、接
种量 5 个因素进行正交试验，并对其结果进行极差
分析。 结果表明，极差由大到小为稻草∶麦麸﹥接种
量﹥含水量﹥葡萄糖浓度﹥温度，稻草∶麦麸是影响
亮菌产漆酶的重要因素。 由图 5 可知，最佳组合是
A3B4C3D3E3。对该组合进行补充试验，结果表明，该组
合是最优发酵产漆酶组合， 即葡萄糖浓度 0.6%、稻
草 ∶麦麸 3∶7、温度 27 ℃、含水量 65％、接种量 11
mL/100 g， 其他条件不变的情况下亮菌漆酶酶活可
达 3 496．7 U ／ g，比其他组合的最好酶活高出约 1．7倍。
3 讨论
真菌发酵筛选优化培养基和培养条件的方法
很多，如单因素试验、均匀试验、正交设计等。 由于
本试验亮菌发酵产漆酶的培养基和培养条件因素
多，因素间的组合比较复杂，利用正交设计“均匀分
散性和整齐可比性”的优点，可以更准确高效地筛
选出最优发酵因素和组合。
3．1 漆酶的亮菌液体发酵生产
微生物培养基碳氮源一般由小分子碳源、高分
子碳源、无机氮源和有机氮源组成，因此将这 4 部
分分别作为影响因素，既考虑到了单个碳源和氮源
的影响，又考虑到了这 4 个因素之间不同组合的影
响，可使得到的优化培养基营养更为均衡，更有利
于菌种的生长代谢。 其次，在最优培养基组合基础
上依次进行培养基浓度、培养条件正交试验，并进
一步做了漆酶诱导试验。
结果发现优化后亮菌漆酶酶活虽然有提高，但
提高幅度很小，液体发酵所产漆酶的最高酶活只有
7．92 U ／mL，其原因可能是：①该菌本身在液体状况
下不具备良好的产漆酶的能力； ②选择的液体发
酵培养基不适宜，尤其表现在碳氮源的组合上。 菌
株发酵碳氮源选择具有强大的广泛性， 本试验选
择的碳氮源只局限在其中的几种， 可能这几种都
不是亮菌具有良好液体发酵产漆酶能力的原料，
因此还需要不断尝试；③碳氮比例不合适。 虽然这
几种培养基菌体长势不错， 但是菌体在生长阶段
和代谢产物产生时期所需的碳氮比往往不一样，
因此，这也是今后研究的重点；④漆酶有两种，一
种是可诱导型漆酶，一种是组成型漆酶。 在担子菌
中，细胞外组成型漆酶的生产量是很低的。 但是各
种与木质素或木质素衍生物相关的芳香烃类和酚
类化合物以及重金属都可以显著地提高漆酶的产
量［5］，此试验只选了愈创木酚、吐温－80、苯酚、CuSO4
作为诱导剂，具有很大的局限性，应加大诱导剂试
验范围。
3．2 亮菌液体和固体发酵产漆酶能力的比较
以稻草、麦麸为主料优化亮菌固体发酵产漆酶
培养条件后，亮菌漆酶酶活达 3 496．7 U ／ g，以其为
标准数值计算固体发酵每克干料产漆酶酶活和每
克干料每天产漆酶酶活。 结果表明，每天每克干料
的产酶效率为 492．89 U ／ g。 以同样的方式计算亮菌
液体发酵每克干料的酶活和每克干料的产酶效率，
结果表明，每天每克干料的产酶效率为 15．6 U ／ g，固
体发酵的产酶效率是液体发酵产酶效率的 31．6 倍。
本实验室曾以麦麸∶豆饼粉为 8∶2 进行培养，亮菌产
漆酶酶活可达 20 000 U ／ g 左右， 产酶效率更高 ［13］。
综合培养料的价格等因素，液体发酵成本较高。 试
验结果表明固体发酵更适合亮菌产漆酶。
表 5 不同诱导剂对亮菌产漆酶的影响
诱导剂
0.5 mmol/L 愈创木酚
0.5 mmol/L 吐温-80
0.5 mmol/L 苯酚
0.2 g/L CuSO4
酶活倍数
1.480
1.094
0.822
1.166
图 4 亮菌液体发酵优化前后漆酶酶活比较结果
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
酶
活
//U
/m
L
试验 1
2.05
4.97 5.35
7.92
试验 2 试验 3 试验 4
图 5 固体发酵正交试验效应曲线图
葡萄糖
浓度（A）
稻草：麦麸
（B）
温度
（C）
含水量
（D）
接种量
（E）
2 000
1 800
1 600
1 400
1 200
1 000
800
600
400
200
0
酶
活
//U
/g
1 2 3 4
1
1 1
12
2 2
2
3
3 3 3
4
4 4 4
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上述因素进行试验， 以感官品质得分作为指标，进
行工艺优化，试验结果见表 8。
由表 8 可知，在试验范围内，芹菜水焯的最佳
工艺条件为 A1B2C2，即乙酸体积分数为 0．02％，水焯
时间为 3 min，料液比为 1∶4，在此条件下得到的芹
菜品质最好。 由极差分析结果可知，各因素对芹菜
品质的影响主次顺序为水焯时间＞乙酸体积分数＞
料液比。
2．4 芹菜水焯时的干物质溶出率
芹菜水焯时的干物质溶出率是芹菜水焯时溶
出的干物质与水焯前芹菜质量的比值。 试验结果表
明，按最佳配方水焯芹菜的干物质溶出率为 0．41％，
表明营养成分在此工艺条件下可以得到有效保留。
3 结论
在单因素试验的基础上进行了正交试验，确定
水焯芹菜的最佳工艺为乙酸体积分数 0．02％， 料液
比 1∶4，水焯 3 min，在此条件下焯出的芹菜品质最
好、口感最佳。 由极差分析结果可知，各因素对芹菜
品质影响的主次顺序为：水焯时间＞乙酸体积分数＞
料液比。 按最佳配方水焯芹菜时的干物质溶出率为
0．41％。
芹菜具有一定的药理和治疗价值，并适合多种
烹调方法，是一种大众化的餐桌食品，具有广阔的
市场开发前景。
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［10］ 刘树兴，吴少雄 ．食品化学［M］．北京：中国计量出版社 ，2008．
76－77．
（责任编辑 田宇曦）
表 8 正交试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
x1
x2
x3
R
最优水平
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
86.0
81.3
81.0
5.0
A1
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
83.3
85.7
79.3
6.4
B2
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
82.0
85.0
81.3
3.7
C2
感官评分//分
84
91
83
86
81
77
80
85
78
（上接第 1403页）
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（责任编辑 田宇曦）
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