全 文 ：Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2015年第2期
双菌发酵黄浆水制备豆腐凝固剂
培养条件优化
吕 博，黎晨晨，刘 宁，李 健*
（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）
摘 要：以豆腐黄浆水为原料，经保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵制备豆腐凝固剂。研究了黄浆水初始pH、乳糖添
加量、发酵时间、培养温度、接种量等因素对乳酸菌产酸量的影响，在此基础上采用正交实验优化培养基碳源及发酵
条件。实验结果表明最佳的凝固剂培养条件为：黄浆水中乳糖添加量1.5%、黄浆水初始pH=6.5、接种量6%、培养温度
37℃、发酵时间84h的条件下乳酸量为5.1g/L。在此工艺条件下豆腐出品率为196.43%，硬度为419.15g，黏聚性为
261.42gs，蛋白质含量9.62%。与其他方法相比，方法具有提高凝固剂中乳酸含量，改善豆腐凝固剂功能性，同时提高
了豆腐中蛋白质含量。
关键词：豆腐黄浆水，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，有机酸凝固剂，发酵
Optimization of culture conditions for yellow serofluid fermented by
double lactobacillus to prepare organic acid coagulant
LV Bo，LI Chen-chen，LIU Ning，LI Jian*
（Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province，College of Food Engineering，
Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）
Abstract：Yellow serofluid of tofu was used as a raw material，organic acid coagulant was prepared by
Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus fermentation. The influences of lactic acid content
were investigated by initial pH，lactose content，fermentation time culture temperature and inoculate quantity.
Orthogonal experiment was used to optimize carbon source and its fermentation condition. The optimize culture
conditions of organic acid coagulant were showed as follows：lactose content 1.5% ，initial pH=6.5，inoculate
quantity 6% ，culture temperature 37℃ ，fermentation time 84h. The lactic acid content under these conditions
was 5.1g/L. Under the above process conditions，the rate of production，hardness，cohesiveness and protein
content were 196.43% ，419.15g，261.42gs and 9.62% respectively. Lactic acid content was increased and
function of coagulant was improved by compare with other methods，protein content of tofu was also increased.
Key words：yellow serofluid ；Lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；organic acid coagulant ；
fermentation
中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2015）02-0212-05
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.037
收稿日期：2014－04－14
作者简介：吕博（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全控制与
分析检测。
* 通讯作者：李健（1956-），男，本科，研究方向：农产品化学与综合
利用。
基金项目：黑龙江省教育厅重点项目（12521z009）。
豆腐黄浆水是豆腐生产过程中的副产物之一[1-2]，
其中含有蛋白质、糖，大豆异黄酮，钾、钠，维生素等
多种营养成分[3-4]，随着豆腐行业的发展，黄浆水作为
其副产物，其处理问题日益受到关注[5-6]。
豆腐凝固剂是豆腐制作过程中的重要添加剂之
一[7]。有机酸类豆腐凝固剂是以降低豆浆溶液的pH
使其接近蛋白质的等电点的方法，达到沉降蛋白质
的目的。酸浆作为豆腐凝固剂有着悠久的历史，由于
酸浆需自然发酵后才可作为凝固剂点豆腐，并且浆
循环使用，存在潜在的安全卫生问题。宋莲军等[8]将
乳酸、乙酸等有机酸按照一定比例混合制成复合豆
腐凝固剂，弥补了单一凝固剂制得豆腐在弹性、硬度
方面的不足，但是口味稍酸，风味欠佳。乔明武等[9]用
响应曲面法优化发酵条件制备凝固剂，发酵时间短，
但接种量和乳糖添加量较大。王璐等[10]利用山楂、五
味子、灯笼果等药食两用食品，通过超声辅助水浴法
提取总酸，制得天然新型豆腐凝固剂，消除了化学合
成酸性凝固剂对人体的不利影响，但制成的豆腐不
硬挺。
常用的豆腐凝固剂为石膏、盐卤、葡萄糖-δ-内
脂。利用微生物发酵制备豆腐凝固剂的研究还不是
212
生 物 工 程
2015年第2期
Vol . 36 , No . 02 , 2015
非常全面。保加利亚乳杆菌（Str. Thermophilic）和嗜
热链球菌（Lb. Bulgaricus）存在共生关系，两者混合
发酵能提高产酸速度，减弱后酸化程度，促进风味物
质产生，并能调节人体肠道菌群[11-13]。因此本实验以
豆腐黄浆水为原料，采用正交实验优化方法探讨保
加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵制备新型的有
机酸豆腐凝固剂，以期提高黄浆水中乳酸含量并赋
予其特有的乳香味，减少处理副产物的工序和成本，
提高资源利用率，为新型豆腐凝固剂的研制提供基
础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
乳酸菌 哈尔滨商业大学食品学院农产品实验
室提供；黄浆水 李氏豆腐坊；NaOH（分析纯） 天
津市大陆化学试剂厂；酚酞 天津市天新精细化工
开发中心；乳糖（食品级） 武汉万荣科技发展有限
公司；葡萄糖（分析纯） 天津市致远化学试剂有限
公司；DNS（3，5-二硝基水杨酸）（分析纯） 北京笃
信精细制剂厂；盐酸（分析纯） 丹东市龙海试剂厂；
柠檬酸（食品级） 济南历下雅轩化工产品经营部；
硫酸铜（分析纯） 天津市劢特吉尔环保技术研究
所；硫酸钾（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公
司；碳酸钠（食品级） 天津市鑫大宇化工有限公司。
DHP-9032型电热恒温培养箱、DHG-9123A型电
热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；
LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医
疗器械厂；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州
净化设备有限公司；721E型可见分光光度计 上海
光谱仪器有限公司；pHS-25数显pH计 上海精密科
学仪器有限公司；ALC-110.4型电子天平 北京赛多
利斯仪器系统有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黄浆水中还原糖含量 采用DNS比色法测定
黄浆水中还原糖含量[14]。
1.2.2 黄浆水和豆腐中粗蛋白含量 采用GB/T
5511-2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白含量计
算凯氏法》[15]进行测定。
1.2.3 菌种的活化 牛乳在121℃条件下灭菌20min，
取菌种后，接种于15mL牛奶中，在37℃下活化24h，取
1mL再接种到15mL牛奶中，在37℃下活化24h，如此
反复活化3~4次后，作为种子菌种备用[16-17]。
1.2.4 乳酸菌的扩大培养 取5mL待发酵的黄浆水
与10mL试管中，121℃，灭菌20min。冷却后接入3环菌
种，于37℃条件下培养24h，为一级扩大培养液。取一
级扩大培养液3环，转入盛有100mL已灭菌的黄浆水
的250mL三角瓶中，放入37℃培养箱中静置培养24h
后备用[18]。
1.2.5 产乳酸量的测定 用0.1000mol/L NaOH溶液
滴定发酵前后黄浆水，计算乳酸菌产乳酸量计算公
式如式（1）所示
C2= C1×M×（V1-V2）V3
式（1）
式中：C2—乳酸菌产乳酸量，g/L；C1—NaOH溶液
浓度，mol/L；M—乳酸摩尔质量，g/mol；V1—NaOH滴
定发酵液消耗的体积，mL；V2—NaOH滴定原始黄浆
水消耗的体积，mL；V3—待测发酵液体积，mL。
1.2.6 单因素实验 考察乳糖添加量、黄浆水初始
pH、乳酸菌接种量、培养温度和发酵时间5种因素对
乳酸菌产酸量的影响。
1.2.6.1 乳糖添加量对产酸量的影响 在黄浆水中
分别添加0%、1%、2%、3%、4%的乳糖，通过葡萄糖标
准曲线确定相应的还原糖含量，黄浆水初始pH=6.0，
将乳酸菌以4%的接种量接种于黄浆水中，37℃条件
下培养60h后，按1.2.5测定产乳酸量，进而确定乳糖
添加量。
1.2.6.2 黄浆水初始pH对产酸量的影响 在黄浆水
中添加2%的乳糖，用NaOH和柠檬酸调pH分别为
4.5、5.0、5.5、6.0、6.5进行实验，将活化后的乳酸菌以
4%接种量接种于不同pH的黄浆水中，在37℃条件下
培养48h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定黄浆水初
始pH。
1.2.6.3 乳酸菌接种量对产酸量的影响 在黄浆水
中添加2%的乳糖，调节pH=6.0，乳酸菌接种量分别
为2%、4%、6%、8%、10%接种于黄浆水中，在37℃条
件下培养48h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定最适
接种量。
1.2.6.4 培养温度对产酸量的影响 在黄浆水中添
加2%的乳糖，调节pH=6.0，乳酸菌以6%的接种量
接种于黄浆水中，分别在29、33、37、41、45℃条件下
培养48h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定最适培养
温度。
1.2.6.5 发酵时间对产酸量的影响 在黄浆水中添
加2%的乳糖，调节pH=6.0，乳酸菌以6%的接种量接
种于黄浆水中，在37℃条件下分别培养48、60、72、
84、96h。按1.2.5测定产乳酸量，进而确定培养时间。
1.2.7 正交实验设计 根据上述单因素实验，设计
五因素四水平正交实验[19-21]，确定保加利亚乳杆菌和
嗜热链球菌共同发酵产酸的最优培养基及发酵条
件。实验选取的因素及水平见表1。为验证正交实验
最佳培养条件下的菌株产酸量，做三组平行实验进
行复证。
1.2.8 采用最优组合制作的豆腐理化指标测定 利
用质构仪对豆腐黏聚性及硬度进行测定。采用TPA
模式。测定参数为：探头型号是P50，测试前速度为
2mm/s，测试速度为1mm/s，测试后速度为1mm/s，压缩
水平
因素
A 乳糖
添加量（%）
B 发酵
初始pH
C 接种量
（%）
D 发酵
时间（h）
E 培养
温度（℃）
1 1.5 5.0 4 48 33
2 2.0 5.5 5 60 37
3 2.5 6.0 6 72 41
4 3.0 6.5 7 84 45
表1 L16（45）正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment design L16（45）
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Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2015年第2期
形变量是30%，触发力为5g，同一样品选择5个不同
的部位测定，取平均值[22]。豆腐出品率是每100g干豆
所得成品豆腐的重量。将制得的豆腐样品称量出质
量，根据式（2）计算出豆腐出品率[10]。
F（%）= m豆腐
m干豆
×100 式（2）
式中：F—豆腐出品率，%；m豆腐—成品豆腐质量；
m干豆—干豆的质量。
1.2.9 数据处理 通过Excel做出不同影响因素对乳
酸量影响的曲线，并通过SPSS软件对正交实验结果
进行方差分析（显著水平为0.05），确定各影响因素
的主次顺序及最佳优化条件。
2 结果与讨论
2.1 黄浆水中还原糖、粗蛋白含量的测定
实验所得的标准曲线为：y=0.2969x-0.0091，R2=
0.9969。黄浆水中还原糖通过标准曲线计算出相应
含量为0.580g/100mL。
按GB/T 5511-2008对豆腐黄浆水中粗蛋白含量
进行测定，结果为0.34%。
2.2 单因素实验
2.2.1 乳糖添加量对菌株产酸量的影响 保加利亚
乳杆菌和嗜热链球菌在不同乳糖添加量的黄浆水中
发酵产乳酸，通过测定发酵前后NaOH消耗的体积，
确定黄浆水中不同乳糖添加量对乳酸菌产酸量的影
响，结果如图1所示。
乳糖为乳酸菌代谢的提供碳源，能延长稳定期，
随着乳糖含量的增加，使乳酸菌进入稳定期后代谢
产物积累和生化反应仍继续进行，降低菌体死亡率。
分析图1曲线趋势，乳糖添加量在0%~2%时，乳酸菌
产乳酸量呈上升趋势，在0%~1%时产乳酸量变化显著
（p≤0.05），在1%~2%时变化不显著。在2%~4%范围
内乳酸量变化不显著。当添加量为2%时乳酸含量达
到最大，随着乳糖含量的增加乳酸量逐渐减少。从吸
光值A可知，随着乳糖浓度的增大A值先升高后降低，
A值最大为0.77时乳酸量最大，即乳酸添加量为2%时
达到最大，出现此情况是因为培养基中碳氮比改变，
改变微生物细胞渗透压，不适合菌株的生长及代谢
产物的积累。并且由于乳糖添加量越高发酵液越浑
浊，作为豆腐凝固剂点豆腐会影响豆腐的外观颜色。
所以，选择乳糖添加量在2%左右进行正交实验。
2.2.2 黄浆水初始pH对菌株产酸量的影响 保加利
亚乳杆菌和嗜热链球菌在不同初始pH黄浆水中发酵
产乳酸，通过测定发酵前后NaOH消耗的体积，确定
不同初始pH环境下的产酸量，结果如图2所示。
由图2曲线趋势知，初始pH在4.5~5.5时，乳酸量
呈显著增加趋势（p≤0.05），pH在5.5~6.5范围内乳酸
量显著降低（p≤0.05）。由于有机酸的积累，乳酸菌
代谢多在低pH的酸性环境中进行，当环境pH降低到
一定程度，乳酸菌将停止生长，影响了代谢产物的积
累，所以出现了在pH=4、5条件下乳酸量降低的情
况。在乳糖添加量相同时pH越大，发酵液颜色越深，
作为豆腐凝固剂会影响到豆腐的外观颜色，但又由
于凝固剂应用在豆腐制作过程中要尽量避免酸涩
感，所以，选择pH=5.5左右进行正交实验。
2.2.3 乳酸菌接种量对菌株产酸量的影响 不同接
种量对产酸的影响结果如图3所示。
接种量影响乳酸的积累，随着接种量的增加，培
养环境中乳糖含量降低、pH降低，二者共同制约着乳
酸菌的生长。分析图3曲线可知，接种量在2%~6%时，
乳酸量呈显著增加趋势（p≤0.05），6%~8%变化不显
著，8%~10%乳酸量显著降低（p≤0.05），接种量在
6%左右产酸量达到最大，因此选择6%左右接种量进
行正交实验。
2.2.4 培养温度对菌株产酸量的影响 在不同培养
温度下菌株产酸情况如图4所示。
温度是乳酸菌生长代谢的重要条件，温度的不
同既影响乳酸菌的生长又影响乳酸的积累。由图4可
图1 不同乳糖添加量对乳酸菌产酸的影响
Fig.1 Lactose added effect on acid production
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
乳
酸
量
（
g/
L）
乳糖添加量（%）
0 1 2 3 4
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
值
A
产酸量 吸光值
图2 不同初始pH对乳酸菌产酸的影响
Fig.2 Initial pH effect on acid production
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
乳
酸
量
（
g/
L）
黄浆水初始pH
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
图3 不同接种量对乳酸菌产酸的影响
Fig.3 Inoculum concentration effect on acid production
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
乳
酸
量
（
g/
L）
接种量（%）
2 4 6 8 10
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生 物 工 程
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Vol . 36 , No . 02 , 2015
因素 离差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 0.081 3 0.103 2.490
B 0.356 3 0.454 2.490
C 0.405 3 0.517 2.490
D 2.349 3 2.996 2.490 *
E 0.729 3 0.930 2.490
误差 3.92 15
表3 正交设计方差分析表
Table 3 Analysis of variance for the experimental results of
orthogonal array design
注：p≤0.05表示该因素的选取对指标有显著性影响。
实验号 A B C D E 产酸量（g/L）
1 1 1 1 1 1 3.6
2 1 2 2 2 2 4.9
3 1 3 3 3 3 4.5
4 1 4 4 4 4 4.9
5 2 1 2 3 4 3.9
6 2 2 1 4 3 4.5
7 2 3 4 1 2 4.1
8 2 4 3 2 1 4.5
9 3 1 3 4 2 5.4
10 3 2 4 3 1 3.4
11 3 3 1 2 4 4.5
12 3 4 2 1 3 4.3
13 4 1 4 2 3 4.3
14 4 2 3 1 4 3.8
15 4 3 2 4 1 4.9
16 4 4 1 3 2 4.3
k1 4.5 4.3 4.2 3.9 4.1
k2 4.3 4.1 4.5 4.6 4.7
k3 4.4 4.5 4.6 4.1 4.4
k4 4.3 4.5 4.2 4.9 4.3
R 0.2 0.4 0.4 1 0.6
优水平 A1 B4 C3 D4 E2
因素主次 D>E>C＝B>A
优组合 A1B4C3D4E2
表2 L16（45）正交实验结果表与极差分析
Table 2 Experimental results of L16（45）orthogonal array design
and range analysis
图4 培养温度对乳酸菌产酸的影响
Fig.4 Incubation temperature effect on acid production
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
乳
酸
量
（
g/
L）
温度（℃）
29 33 37 41 45
知，培养温度为37℃时，乳酸量为3.6g/L达到最大。在
29~37℃范围内，乳酸量变化呈显著增加趋势（p≤0.05），
在37~45℃乳酸量变化显著下降（p≤0.05）。因此，选
择37℃左右的培养温度进行正交实验。该结论与尚
天翠和Betache[23-24]的乳酸菌是中温微生物的结论是
一致的。
2.2.5 发酵时间对菌株产酸量的影响 不同发酵时
间对菌株产酸量的情况如图5所示。
随着时间的延长，代谢产物逐步积累，随着环境
因子逐渐被消耗，乳酸量的积累在降低，图5的这种
趋势符合这个解释。发酵时间从48~60h乳酸量呈显
著增加趋势（p≤0.05），从60~96h乳酸量增加缓慢，
变化不显著。在72h时产酸量为6.5g/L，84h时产酸量
为6.6g/L，提高程度不高，浪费时间和资源。因此，选
择发酵时间72h左右进行正交实验。
2.3 正交实验结果与分析
2.3.1 正交实验结果与方差分析 根据以上单因素
实验结果，选择乳糖添加量（A）、发酵初始pH（B）、
接种量（C）、发酵时间（D）、培养温度（E）5个因素进
行正交实验优化，确定各单因素对菌株产酸量的交
互作用。正交实验结果如表2所示，方差分析如表3
所示。
根据正交实验结果分析和方差分析可知，发酵
时间具有显著性，各因素对菌株产酸量的影响主次
顺序依次是：发酵时间、培养温度、接种量、黄浆水初
始pH、乳糖添加量。由正交结果与极差分析表中k值
知，黄浆水初始pH的k3=k4，由于pH=6.5更接近于黄
浆水pH，为节约操作时间，提高效率，故选择pH=6.5
（即B4）。综上各因素对产酸量交互影响最佳方案为：
A1B4C3D4E2，即发酵时间为84h，培养温度为37℃，接
种量为6%，黄浆水初始pH=6.5，乳糖添加量为1.5%。
在该最佳培养条件下保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌
共同发酵黄浆水产酸量可达5.1g/L。
2.4 采用最优组合制作的豆腐理化指标测定
根据2.3所得最佳方案制备豆腐凝固剂并应用于
豆腐制作过程中。对豆腐的出品率、黏聚性、硬度、蛋
白质含量进行测定结果为：出品率为196.43%，黏聚
性为261.42gs，硬度为419.15g，蛋白质含量9.62%。
2.5 不同豆腐凝固剂制备方法比较
不同豆腐凝固剂制备方法比较结果见表4。
图5 不同发酵时间对乳酸菌产酸的影响
Fig.5 Fermentation time effect on acid production
8
7
6
5
4
3
2
乳
酸
量
（
g/
L）
时间（h）
48 60 72 84 96
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Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2015年第2期
表4 不同凝固剂制备方法比较
Table 4 Comparison of different preparation methods of coagulant
方法来源
乳酸含量
（mg/mL） 功能性 可操作性
出品率
（%）
本方法 5.1
Str. thermophilic和Lb. Bulgaricus可有效调节人
体肠道菌群，改善肠道环境，赋予凝固剂一定
的生理功能性及特有乳香味
接种量小，操作简单，但发酵时间稍长 196.43
王璐[10] 2.5（总酸） 从药食两用食物中提取有机酸，赋予凝固剂保
健功能
操作费时 255.38
乔明武等[9] 0.009（总酸） 赋予乳酸菌 凝固剂制备时间短，但接种量大浪费资源 212.22
赵贵丽等[25] 7.81 菌种不纯，存在卫生安全问题 以原始酸浆制备种子液，操作较复杂 -
由表4可知，本方法制备的豆腐凝固剂具有一定
的生理功能，并在应用中赋予豆腐特有的乳香味，且
接种量小、节约资源，制备凝固剂过程较其他方法操
作简便。
3 结论
以豆腐黄浆水为原料，通过保加利亚乳杆菌和嗜
热链球菌共同发酵制备有机酸豆腐凝固剂。经单因素
实验确定各因素正交实验的水平范围，最终通过正交
实验确定最佳培养基及发酵条件。最优方案为：发酵
时间为84h，培养温度为37℃，接种量为6%，黄浆水初
始pH=6.5，乳糖添加量为1.5%。在该最佳培养条件下
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵黄浆水产酸
量可达5.1g/L。通过验证实验验证该培养基及发酵条
件具有一定的可行性与可靠性。通过正交实验验证实
验验证该最佳培养基及发酵条件具有一定的可行性
与可靠性。在此工艺条件下豆腐出品率为196.43%，硬
度为419.15g，黏聚性为261.42gs，蛋白质含量9.62%。
本方法与其他方法相比，具有凝固剂中乳酸含
量高，改善豆腐凝固剂功能性，同时提高了豆腐中蛋
白质含量的优点，但操作较费时。本实验所得数据为
研制新型豆腐凝固剂的研究提供基础数据。
参考文献
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