全 文 ：海带根中 alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化
及其酶抑制作用动力学研究
卜同1 , 4 ,陈雷1 ,3 , 4 ,王翠翠1 ,4 , 周通2 , 4 ,郑兰红1 ,胡朝欣1 , 林秀坤1＊
(1.中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室 ,山东 青岛 266071;
2.中国科学院上海药物研究所 ,上海 201203;3.哈尔滨工业大学(威海)海洋学院 ,山东 威海 , 264209;
4.中国科学院研究生院 ,北京 100039)
摘　要:目的 研究海带根中 alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化与酶抑制作用动力学。方法 采用 85%乙醇
溶液浸提 、石油醚萃取 、乙酸乙酯萃取 、硅胶柱层析 、Sephadex LH-20柱层析等方法 , 以 alpha-葡萄糖苷酶抑制
活性为导向 ,分离纯化得到了 alpha-葡萄糖苷酶抑制剂活性组分;运用糖尿病小鼠模型探讨了海带根提取物
体内降糖机理;采用双倒数作图法表征了活性组分抑制 a lpha-葡萄糖苷酶的动力学特征。结果 海带根乙醇
提取物能够有效降低糖尿病小鼠的餐后血糖;可显著抑制 alpha-葡萄糖苷酶活性 , IC50为 13.6μg ·m L-1 ;动
力学研究表明酶抑制类型为非竞争性抑制。结论 海带根提取物能够有效降低模型小鼠的血糖含量 , 其活性
组分可显著抑制 alpha-葡萄糖苷酶活性 , 对 alpha-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为非竞争性抑制。
关键词:alpha-葡萄糖苷酶抑制剂;海带根;糖尿病
中图分类号:TQ460.6 , R965　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2009)03-0013-04
Isolation of alpha-glucosidase inhibitors from Laminaria ja-
ponica root and analysis of its enzymatic property
BU Tong1 , 4 , CHEN Lei1 , 3 , 4 , WANG Cui-cui1 , 4 , ZHOU Tong 2 , 4 , ZHENG Lan-hong 1 , HU
Chao-xin1 , LIN Xiu-kun＊
(1.Key Laboratory o f E xperimental Marine B iology , I nst itute of Oceanology , Chinese A-
cademy of Sciences , Qingdao 266071 , China;2.Shanghai Insti tute of Materia Med ica ,
Chinese Academy o f Sciences , S hanghai 201203 , China;3.School o f the Ocean , Haerbin
I nst itute o f Technology (Weihai), Weihai 264209 , China;4.Grad uate S chool o f the Chi-
nese Academy of Sciences , Bei j ing 100039 ,China)
Abstract:Objective To study the hypogly cemic mechanism o f components f rom Laminaria ja-
ponica.Methods Silica gel chromatog raphy , Sephadex LH-20 gel f ilt ration we re explored to
purify the bio active compounds.The iso lation procedure w as guided by alpha-gluco sidase in-
hibi to ry test and the inhibito ry kinetics w as investig ated based on the Linew eaver-Burk plot.
Results The active component show ed significant inhibito ry ef fect on alpha-g lucosidase wi th
IC50 of 13.6μg ·mL-1 .Linew eaver-Burk plo t analy sis that studies the inhibition effect of the
natural inhibito r on alpha-g lucosidase represented a typical non-compe titive inhibi tion.Con-
clusion Effective component f rom Lam inaria japonica ro ot w as ext racted and its inhibi to ry
activi ty against alpha-gluco sidase could be responsible fo r the abi li ty of Laminaria japonica
roo t to reduce blo od gluco se level in mouse.
Key words:alpha-g lucosidase inhibi to rs;Laminaria japonica roo t;diabetes
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中国海洋药物杂志 2009年 6 月第 28 卷第 3期 Chin J Mar Drugs , 2009 June , Vol.28 No.3
＊ 通讯作者:林秀坤 ,男 ,研究员 ,博士生导师　Tel:0532-82898916　E-mail:xiuk unlin@126.com
DOI :10.13400/j.cnki.cjmd.2009.03.004
　　海带(Lam inaria japonica)属褐藻门 、
海带属植物 ,又名昆布 。自 20 世纪 40年代
从日本引入中国以来 ,已成为中国沿海重要
的海洋经济作物 。据联合国粮食及农业组织
(FAO)报道 ,到 2002 年中国海带产量占世
界产量的 98%,达到 450万吨。海带藻体叶
片部分大都用来提炼碘 、甘露醇和藻酸盐 ,但
其假根部分一直被当作工业废料 ,而未得到
有效利用[ 1] 。
在我国沿海 ,海带根作为一种抗糖尿病
的民间药物有悠久的历史 。糖尿病(Diabe-
tes Mellitus)是一种因胰岛素分泌绝对或相
对不足 ,导致以高血糖为特征的内分泌代谢
性疾病 ,患者中 90%以上为 II型糖尿病 。目
前 ,临床上用于 II 型糖尿病治疗的口服药物
主要有双胍类 、alpha-葡萄糖苷酶抑制剂类 、
噻唑烷二酮类和非磺脲类胰岛素分泌促进剂
等[ 2] 。 alpha-葡萄糖苷酶位于小肠上皮细
胞 ,此酶的抑制剂能延缓或抑制葡萄糖在小
肠内的消化 、吸收 ,进而控制餐后高血糖的发
生 ,在临床上可单独或与磺脲类 、双胍类 、胰
岛素联合使用。目前临床上用于治疗糖尿病
的药物中 ,阿卡波糖(Acarbose)和米格列醇
(Mig lito l)都是以小肠上皮的 alpha-葡萄糖
苷酶为靶点的葡萄糖苷酶抑制剂[ 3] 。
本研究首先对海带根粗提物进行了动物
体内实验 ,发现海带根提取物能够有效降低
糖尿病动物体内的血糖含量。进一步以 al-
pha-葡萄糖苷酶抑制活性为导向 ,获得了海
带根中具有较强抑制 alpha-葡萄糖苷酶作用
的活性组分。同时 ,进行了该活性组分对 al-
pha-葡萄糖苷酶的抑制动力学研究。
1　实验材料
海带根状器 ,采自山东省荣成市近海;
Sephadex LH-20(G E Healthcare);薄层层析
硅胶 GF254(青岛海洋化工厂);柱层析硅胶
(青岛海洋化工厂);alpha-D-葡萄糖苷酶(al-
pha-D-gluco sidase EC3.2.1.20 , Sigma 公
司);4-硝 基 苯-alpha-D-吡 喃葡 萄 糖 苷
(PNPG , Merck 公司);还原型谷胱甘肽
(GSH-reduced , Amoresco 公司)。
链脲霉素(Sigma),拜糖平(拜尔医药保
健有限公司),血糖试剂盒(北京中生北控生
物科技有限公司), KNOE PRO 型全自动生
化分析仪(芬兰康艺仪器公司),昆明种小鼠 ,
雄性 ,体重(25土 1)g ,由山东鲁抗医药股份
有限公司动物中心提供。
2　实验方法
2.1　海带根中降血糖粗提物的提取
取海带根 15 kg , 粉碎后以 5 倍体积
85%乙醇提取 3次 ,提取液减压浓缩后 ,以石
油醚萃取 2 次。水相用乙酸乙酯萃取 ,减压
浓缩 、冻干得粗提物样品 。
2.2　海带根乙酸乙酯部位对糖尿病小鼠的
降血糖作用
取昆明种小鼠 60只 ,按 100mg ·kg-1腹
腔注射链脲霉素诱发糖尿病模型 ,正常对照
组给等体积的柠檬酸溶液 ,48h后随机抽取 5
只小鼠测血糖 ,确定造模是否成功 。选取糖
尿病小鼠随机分组如下:模型对照组 、海带根
提取物组(500mg ·kg-1)、阳性对照拜糖平
组(50mg ·kg-1)及空白对照组 ,每组 10只 。
灌胃给药 ,每天 1次 ,连续 3d ,末次给药后禁
食不禁水 2h ,眶内取血用全自动生化仪测空
腹血糖。
2.3　alpha-葡萄糖苷酶抑制剂活性的测定
以 0.7mmol · L-1 PNDG 为底物 ,在含
3.2mmol · L-1 MgCl2 , 0.1mo l · L-1(pH
6.8)K 3PO 4缓冲液体系中加入 alpha-D葡萄
糖苷酶(0.1U), 反应体系体积为 90.4μL ,
37℃反应 20m in , 加入 120μL 甘氨酸溶液
(0.4 mol · L-1 , pH10.4)终止反应 , 于
405nm 处测定在酶催化下释放出硝基酚的
量。在检测体系中以 12μL 待测样品替代同
体积缓冲液以测定其活力 。
酶活力单位:在 37℃、pH6.8 条件下 ,
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Chin J Mar Drugs , 2009 June , Vol.28 No.3 中国海洋药物杂志 2009 年 6 月第 28 卷第 3 期
1min 内水解 PNPG 释放 1μmol 对硝基酚
(PNP)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
alpha-葡萄糖苷酶抑制活性:在相同条
件下降低 1个酶活力单位所需的抑制剂的量
为 1个抑制剂活力。
抑制率=(抑制剂活力/原酶活力)×100%
2.4　海带根中降血糖成分的分离纯化
海带根粗提物样品 ,以 alpha-葡萄糖苷
酶抑制活性为导向 ,通过硅胶(200-300 目)
层析柱分离 ,洗脱剂为极性由小到大的石油
醚:丙酮混合溶液;活性组分通过 Sephadex
LH-20凝胶柱分离 ,洗脱剂为体积比为 1∶1
的丙酮和甲醇混合溶液 ,得活性组分。
2.5　活性组分的浓度对酶抑制活性的影响
在活性组分的浓度分别为 0 、4 、8 、16 、
32 、64和 128μg ·mL-1时 ,测定酶活性抑制
率。
2.6　alpha-葡萄糖苷酶抑制剂动力学研究
在抑制剂量一定的条件下 ,加入 3 、6 、12
和 24 mmol · L-1的 PNPG 溶液 ,测定酶活
力。测定体系中活性组分总量选用 0 、64 和
132 μg ·mL-1 3组 ,得出 3 组在不同底物质
量浓度条件下的酶活力 ,用双倒数作图法确
定抑制类型。
3　实验结果
3.1　海带根中降血糖成分的分离 、提取
海带根经过乙醇提取 、石油醚萃取 、乙酸
乙酯萃取 、冻干后得到乙酸乙酯相粗提物
20g 。
乙酸乙酯相粗提物样品经过硅胶柱 、凝
胶柱分离后得活性组分 ,质量为 8mg 。
活性组分为白色粉末 ,易溶于丙酮 、乙酸
乙酯等有机溶剂 。
3.2　海带根乙酸乙酯部位对糖尿病小鼠的
降血糖作用
使用链脲霉素诱发糖尿病模型后 ,小鼠
血糖含量升高 ,一般状况欠佳 ,出现多饮 、多
尿 、多食等糖尿病症状 ,与空白对照组差异显
著 ,说明糖尿病模型造模成功 。给药过程中 ,
模型对照组小鼠皮毛污秽 ,一般状况较差 ,给
药组和阳性对照组 、正常对照组小鼠状况较
好 ,皮毛较光滑 ,结果见表 1。
表 1　海带根乙酸乙酯部位对糖尿病
小鼠的降血糖实验结果
组别 动物(只)
计量
(mg· kg-1)
血糖
(mmol·mL-1) P值
空白对照 10 - 6.27±1.09 -
模型组 10 - 17.6±5.27 <0.01
海带根提取物 10 500 8.28±2.94 <0.01
拜糖平 10 50 9.40±2.98 <0.01
注:P值:模型组和正常对照组相比 ,各给药组和模型对照
组相比。
由表 1见 ,海带根组在 500mg ·kg -1剂
量时能明显降低糖尿病小鼠血糖 ,与模型组
差异显著 。
3.3　活性组分对 alpha-葡萄糖苷酶的抑制
作用
海带根样品的乙酸乙酯相粗提物体外抑
制 alpha-葡萄糖苷酶的 IC50为 1000μg ·
mL
-1 ;精细分离后的活性组分体外抑制 al-
pha-葡萄糖苷酶的 IC50为 13.6μg ·mL-1(见
图 1)。
图 1　活性组分对 alpha-葡萄糖苷酶活性抑制率曲线
3.4　alpha-葡萄糖苷酶抑制剂动力学研究
3组抑制剂浓度下的抑制双倒数曲线见
图 2 ,反应速度 Vmax 随抑制剂浓度增大而
变小 ,而在不同抑制剂浓度下 alpha-葡萄糖
苷酶的米氏常数(Km)保持不变 ,双倒数曲
线交于横坐标上 ,是典型的非竞争性抑制动
力学曲线 。Km =2.39g/L
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图 2　海带根中具有 alpha-葡萄糖苷酶抑制作用
的活性组分的双倒数酶动力学曲线
4　讨论
目前 ,人们已经从天然产物中分离出许
多抑制活性强 、结构新 alpha-葡萄糖苷酶抑
制剂 ,其来源主要有三个:微生物 、植物和海
洋无脊椎动物。从微生物的次级代谢产物中
分离 alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的研究开始较
早 ,从放线杆菌 Actinop lanes SE 50/110 次
级代谢产物中分离到的假四糖-阿卡波糖
(Acarbose),已在 1995 年得到 FDA 批准用
于治疗 II型糖尿病[ 4]
从植物中提取的具有 alpha-葡萄糖苷酶
抑制活性的化合物主要有生物碱类 、类黄酮
类 、萜类和多酚类等化合物及其衍生物[ 5] 。
海洋中蕴含着丰富的资源 ,其高压 、高盐 、低
温的复杂环境造就了生物种类的多样性和代
谢途径的独特性 ,决定了海洋中次级代谢产
物的丰富多样性[ 6] 。人们已经从海绵中分离
出了多种具有较高 alpha-葡萄糖苷酶抑制活
性的化合物 ,但是对药用海洋植物来源的 al-
pha-葡萄糖苷酶抑制剂的 研究报道较
少[ 7 ～ 9] 。
天然来源的 alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的
抑制作用机理分为竞争性抑制和非竞争性抑
制。目前应用于临床的阿卡波糖 、伏格列醇
等药物作用机理均为竞争性抑制[ 4] 。体外酶
学研究表明 ,许多非竞争性抑制剂对于 al-
pha-葡萄糖苷酶的抑制活性高于竞争性抑制
剂 ,但由于其机理较为复杂 ,尚未应用于临
床。我们实验室由海带根中获得的活性组分
经实验证实为 alpha-葡萄糖苷酶的一种非竞
争性抑制剂。我们正在确证其活性成分的分
子结构 ,并进一步研究其与 alpha-葡萄糖苷
酶的相互作用 ,为发展新型的抗糖尿病新药
奠定基础 。海带根是我国沿海一带治疗糖尿
病的民间药物 ,动物实验表明 ,海带根的乙醇
提取物具有降低糖尿病小鼠餐后血糖的作
用。粗提物进一步经过硅胶柱层析 ,凝胶柱
层析分离后获得具有较强 alpha-葡萄糖苷酶
抑制活性的活性组分。海带根为海带加工过
程中未利用的部分 ,具有丰富的原料资源 ,因
此 ,采用海带根为原料开发降糖药物具有极
高的应用价值 。
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(收稿日期:2008-12-17)
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Chin J Mar Drugs , 2009 June , Vol.28 No.3 中国海洋药物杂志 2009 年 6 月第 28 卷第 3 期