全 文 ：收稿日期:2003-01-07
基金项目:国家“ 863”资助项目(2001 AA620502)
作者简介:李守玲(1966-),女 ,工程师 ,主要从事多糖研究.
　文章编号:1671-9352(2004)01-0107-02
从海带根中提取纯化褐藻硫酸多糖
李守玲 ,赵　晶 ,张华坤 ,曲爱琴
(山东大学　生命科学学院 , 山东　济南　250100)
摘要:海带根粉碎后 ,经过酶解 , 去除褐藻酸 ,得到酶解液;通过 DE-41 、DE-80 离子交换柱层析 , 得到海带硫酸多糖
(FGS)F1-F8 的 8种不同组分;再用 Sepharose 2B凝胶柱层析纯化 , 获得层析纯 F1-F8 的 FGS.我们初步测定了 8 种
FGS 的分子量 、单糖组分及其摩尔比.FGS 为一类含有鼠李糖 、岩藻糖 、木糖 、甘露糖 、半乳糖以及硫酸根的杂多糖.
关键词:海带根;海带硫酸多糖;纯化;组分
中国分类号:R931.77 ;TQ464.1　　　文献标识码:A
Study on the isolation and purification of the
fucoidan-galactosan sulfate(FGS)of Laminaria japonica root
LI Shou-ling , ZHAO Jing ,ZHANG Hua-kun &QU Ai-qin
(College of Life science , Shandong University , Jinan 250100, Shandong , China)
Abstract:Eight different fractions(F1-F8)of FGS were prepared from thewater solution of enzymolyzed Laminaria japonica root uti-
lizing DE-41 and DE-80 ion exchange chromatography column , and were further purified by gel filtration chromatography on a
sepharose 2B and 4B .We also assayed the molecular weight ,monosaccharide residue constituent and molar ratio of F1-F8.FGS is a
heteroglycan containing rha , fuc , xyl , man , gal , uronic acid and SO42-.
Key words:laminaria japonica root;fucoidan-galactosan sulfate;purification;constituent
　　多糖在生物体内不仅作为能源物质 、结构成分 ,
而且在细胞识别 、信息传递等方面发挥着独特的作
用.近年来研究发现 ,海藻多糖在抗肿瘤 、抗艾滋病
毒 、调节糖脂代谢 、促进免疫[ 1～ 4]等方面显示出独特
的生物活性 ,所以海藻多糖作为药物和药物中间体
的潜在功能引起各国药学界高度重视.本文研究了
从海带根中提取纯化海带多糖(FGS)的方法 ,为海
带根的综和利用提供了实验数据.
1　材料与方法
1.1　试剂与仪器
海带根由山东荣城鸿洋神集团提供;纤维素酶 、
果胶酶 ,山东大学生命学院;CTAB ,上海化学试剂一
厂;DE-41 、DE-80 、Sepharose 2B ,Pharmacia;标准葡聚
糖 、标准单糖 ,Sigma;核酸蛋白检测仪 ,上海沪西仪
器厂;气相色谱分析仪 ,NicoletSDFT-IR.
1.2　实验方法
1.2.1　海带素(FGS)的提取
干海带根洗净 ,浸泡 3 ～ 4 h ,粉碎后加酶水解 ,
去渣收集含 FGS 的酶解液.向酶解液中加入 CaCl2
沉淀褐藻酸 ,离心去除沉淀 ,向上清夜中加入 CTAB
沉淀 FGS ,2000 g 离心 10min ,获得含 FGS的沉淀物
和含中性及碱性的 FGS的上清液 ,备用.
1.2.2　海带硫酸多糖 F1 ～ F4的分离[ 5]
将 1.2.1离心获得的沉淀物 , 加入HCI进行酸
　第 39 卷　第 1期
　Vol.39　No.1 　 　 　 　 　
山　东　大　学　学　报　(理　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
　 　 　 　 　 2004年 2 月　
Feb.2004　
解 ,游离出 FGS ,透析除去 CTAB 和过剩的盐酸 ,透
析液加到氯型 DE-41离子交换柱上 ,用蒸馏水洗脱 ,
收集洗脱峰 I(此为不吸附组分),然后用不同浓度
的NaCI溶液洗脱 ,得到两个峰形流份 ,经透析浓缩
干燥 ,得到 F1、F2两种 FGS.
将洗脱峰 I 加到硼酸型 DE-80离子交换柱上 ,
用不同浓度的 NaCI 溶液洗脱 ,收集到两个峰形流
份 ,经透析浓缩干燥 ,得到 F3 、F4 两种 FGS.
1.2.3　海带硫酸多糖F5 ～ F8的分离
将1.2.1收集的离心上清夜调节 pH =7 ,出现
絮状沉淀 ,2000 g离心10min ,收集上清液和沉淀 ,上
清夜备用.沉淀物用盐酸酸解 ,产生游离的 FGS ,离
心后上清夜上 DE-41 离子交换柱 , 用不同浓度的
NaCI溶液分步洗脱 ,收集峰形洗脱液 ,经透析 、冷冻
干燥得到 F5 和 F6.
将1.2.3 离心上清夜再次调节酸碱度 pH =
8.5 ,出现沉淀 ,2000 g 离心 10min ,沉淀物用 2NHCI
酸化溶解 ,上 DE-80离子交换柱 ,用梯度 NaCI 溶液
分步洗脱 ,收集峰形洗脱液 ,经透析 、冷冻干燥得到
F7和 F8.
1.2.4　海带硫酸多糖F1 ～ F8的纯化
将得到的 8种 FGS 分别进行 Sepharose 2B 凝胶
柱(2.0×80 cm)层析 ,平衡液 、洗脱液均为含 1%Na-
Cl的 30%乙醇水溶液 ,收集主峰形部分 ,透析 、冷冻
干燥得到 F1 ～ F8的纯品.
1.3　分子量测定
用不同分子量的葡聚糖作标准 ,将 MW500 、282
和100KD的葡聚糖分别溶于含 1%NaCl的 30%乙醇
洗脱液中 , 上 Sepharose 2B 柱(2.0 ×80 cm), 以
20mL/h的流速洗脱 ,收集至洗脱峰的洗脱体积 ,利
用 office 97.excel 模块将分子量的对数与洗脱体积
进行线性回归分析 ,制作标准曲线和方程.
1.4　单糖成分分析
1.4.1　FGS 单糖成分纸层析
分别称取 F1 ～ F8 于不同的小试管中 , 加入
1 mol/L HCI ,真空封口后于 100 ℃连续水解 8 h ,除
去HCl后 ,加水溶解点样 ,展层剂为 V正丁醇∶V吡啶∶
V水=6∶4∶3 ,层析温度为 60 ℃,显色剂为苯胺-邻苯
甲酸.
1.4.2　FGS 气相色谱分析
FGS水解同纸层析 ,水解物及标准单糖均制备
成糖腈乙酸酯 ,气相色谱分析条件:内标为肌醇六乙
酸酯 ,分离柱为3mm＊2m 的玻璃柱 ,固定液为 10%
OV-225 , 载气为氮气 , 流速为 15 mL/min , 柱温
220 ℃,检测温度 250-270 ℃,进样量 1-2μL.
1.5　FGS的硫酸基测定
采用比浊法测定 SO2-4 含量 ,以 K2SO4制作标准
曲线[ 6] .
1.6　FGS总糖测定
苯酚-硫酸法 ,以 fuc制作标准曲线[ 6] .
2　结果
2.1　纯度检测
采用 Sepharose 2B 凝胶过滤法 ,F1-F8 均得到单
一洗脱峰 ,醋酸纤维薄膜电泳均为一条带.
2.2　分子量测定
采用 Sepharose 2B 凝胶过滤法 ,F1-F8 分子量分
别为 210 、120 、400 、140 、275 、270 、280和 240KD.
2.3　单糖组成分析
气相色谱层析表明的 F1-F8 单糖成分及摩尔
比 ,见表 1.
表1　F1-F8单糖组成分析
Tab.1　Sugar compositions of the FGS
FGS sugar compositions proportion of the mol/ L
F1 rha fuc man gal 1.00∶16.80∶4.31∶7.34
F2 rha fuc man gal 1.00∶9.55∶1.29∶2.20
F3 — fuc man gal — 4.74∶1.00∶1.33
F4 rha fuc man gal xyl 1.00∶6.88∶0.66∶1.20∶0.39
F5 — fuc man gal — 10.04∶2.14∶1.00
F6 — fuc man gal — 14.75∶1.00∶1.55
F7 rha fuc man gal 5.45∶5.32∶4.68∶1.00
F8 rha fuc — gal 1.00∶2.44∶—∶0.57
2.4　海带根 FGS硫酸基含量测定(见表 2)
表2　F1-F8硫酸基的含量
Tab.2　Determination for SO42- of F1-F8
FGS F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
SO4
2-(%) 12.9 26.4 14.9 24.6 15.4 21.6 14.0 24.5
2.5　海带根 FGS(F1-F8)总糖含量测定(见表 3)
表 3　F1-F8 总糖的含量
Tab.3　Determination for total sugar of F1-F8
FGS F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
total sugar
(%) 59.6 67.4 19.2 48.0 33.2 53.3 59.2 43.0
(下转第 112 页)
　108　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 39卷　
　　从 3个组分的总酶活比较来看 ,组分 1 、2 是主
要组分 ,组分 1的比活力高于组分 2 ,组分 3总酶活
只有组分 1 、2的十分之一左右.SDS-PAGE 显示 ,组
分1和组分 2的分子量约为 17.0kD和 25.0 kD(图
4),目前正对 3种组分进行进一步的纯化.
图 4　组分 1、2 的 SDS-PAGE 图谱
Fig.4　SDS-PAGE of component 1 and 2
1:组分 1 , 2:marker, 3:组分2
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(编辑:于善清)
(上接第 108 页)
　　我国有丰富的海带资源 ,海带硫酸多糖是海带
中的一种活性多糖 ,近几年国内外对其生物活性和
药理功能进行了不断研究 ,进一步研究开发新产品 ,
特别是开发它的药用价值 ,必将推动海带加工业的
发展.
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(编辑:于善清)
　112　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 39卷