全 文 ：蚕豆叶细胞质膜中红膜肤的免疫化学鉴定
王 育 东 阎 隆 飞
(北京农业大学生物学院生物化学教研室 , 北京 10 0 0 , 呼)
关桩词 膜骨架蛋白 、 红膜肤 、 免疫亲和层析 、 免疫荧光组织定位 、 质膜
近年来的研究证明 , 红细胞膜上存在一个膜骨架系统 , 由红膜肤 ( s p e ct r in *) 、 连接蛋白
( an k yr in )
、 带 4 . 1 蛋白和肌动蛋白 ( a ct in ) 等组成 . 最近在动物多种器官的细胞内也发现了
嗅骨架蛋白 ,特别是红膜肤的存在1t, ” . 我们在文献 [ 3 , 4] 中用聚丙烯酞胺凝胶电泳方法分析了
蚕豆叶细胞质膜蛋白的组成 , 并与人红细胞膜骨架蛋白作了比较 . 结果表明 , 蚕豆叶细胞质膜
蛋白中的 2朽 和 2 2 8 k D 两种蛋白质可能即是人红细胞质膜上的红膜肤 a 和红膜肤 夕. 本文
目的在于用免疫化学方法鉴定蚕豆叶细胞质膜中的红膜肤 , 进一步证明植物细胞质膜中膜骨
架的存在 . 研究结果表明 , 在植物细胞中确实存在着红膜肤 a 及 风
一 、 材 料 与 方 法
1
. 材料 田间或温室中生长的蚕豆 沙 ic a j a b a ) , 采用上部叶片作材料 .
2
. 蚕豆叶细胞质膜的制备 以差速离心法从蚕豆叶匀浆中分离出质膜的粗提物 . 富含
细胞质膜的组分 ( lL ) 和富含其它非质膜组分 ( L , ) 分离方法详见参考文献 〔 , 〕.
3
. 人红细胞膜的制备 参照 D o d g e 6[] 的方法制备 .
.4 S D S
一 聚丙姗酥胺凝胶电泳 参照 L ae m m h切 的方法并 略 加修 改 .
5
. 人红细胞腆红膜肤的提取 用制备型的 SD S一聚丙烯酸胺凝胶电泳分离人红细 胞膜
蛋白 . 用考马斯亮蓝轻微染色后 , 切取红膜肤 a 和 夕蛋白带 , 冷冻干燥 .
6
. 兔抗人红细胞膜红膜肤血清的制备 从 S D S一聚丙烯酸胺凝胶板上切取红膜肤 a 和
口带 , 与等体积的福 氏完全佐剂混合并研磨成乳剂 . 用纯种新西兰公兔进行免疫 .
7
. 免痊亲和层析法提取人红膜红腆防及蚕豆叶细胞 质 膜 红 膜眯 称取 10 9 (湿 重 )
se p ha or se 4B
, 抽去保护液 , 依次以 0 . 5 m ol / L N o CI 溶液和 蒸馏水洗涤并抽干 . 依次加入
N a o H
、 环氧氯丙烷 、 乙睛 、 使载体活化 . 将抗血清与 N a H C q 缓冲液混合 . 加人活化的
eS hP ar os
e 4 B 中 , 进行偶联 . 用 N o CI 溶液洗去未偶联的蛋 白质 , 用蒸馏水洗净 . 用甲酸 、 K CI
溶液洗涤 , 再经蒸馏水洗涤 , 最后用 P B S 平衡 , 装柱待用 . 取膜蛋白悬浮液分别加入 1多
T ir ot n x
一 1 0 0 过滤 . 取滤液 , 加人层析柱中 , 用含有 T ir t on X 一 1 0 的 P B S 洗去未亲和的蛋
白质 , 用紫外检测仪监测 , 用 K C N S 洗脱与层析柱相结合的抗原蛋白 , 收集蛋白质 .
8
. 用间接酶联免疫吸附法 ( E L I SA ) 对蚕豆叶细胞质膜膜蛋 白中红膜肤的鉴定 将染
色后的人红膜及蚕豆质膜蛋白质凝胶板浸于碳酸盐缓冲液中 , 切取各条蛋白质带 . 使所切取
的蛋白质带凝胶块均含有 0 . 01 m g 蛋白 ,将各凝胶块切碎 , 分别浸于碳酸盐缓冲液中 , 浸提 48
h
. 用不含蛋白带的凝胶块浸提液作对照 . 一抗为兔抗红膜肤血清 , 二抗为过氧化物酶标记的
本文 1 9 8 , 年 1 月 8 日收到 . 1 9 9。 年 l 月 2 日收到修改稿 .
* 采用英汉生物化学 词典的译法 .
! 3 2尽 1 9 9 0 年
羊抗兔 饱 G .
9 .免疫荧光组织定位 使用 D u ke公司生产的荧光共价小球直径为 0. 6解 m.取 1 0斌
小球悬浮液 , 加人 50 川 兔抗人红膜红膜肤血清 , 放置 2一 3 h , 2 0 0 0 X g 离心 15 m in , 收集结
合抗血清的荧光小球 . 用生理盐水洗 3 次 , 使沉淀的荧光小球悬浮于含牛血清白蛋白的磷酸
缓冲液中 ( p H .7 4 ) . 用超声波将小球打散 . 将 3外 聚乙烯醇溶液涂在载玻片上 , 晾干 . 将完
整的人红细胞或蚕豆原生质体悬浮液滴在薄膜上 , 涂平 , 晾干 , 浸人蒸馏水内使之胀破 . 在玻
片上留下内表面暴露的人红膜或蚕豆质膜碎片 . 向碎片上滴加抗体包被的荧光小球悬浮液 .
置 37 ℃ 保温 30 m in . 用生理盐水洗去未结合的小球 , 置 ol y m uP : 荧光显微镜下观察 .
二 、 结 果
1
. 人红细胞膜红膜脸的纯度鉴定 将电泳提纯的人红细胞膜红膜肤进行 S D S一聚丙 赔
酞胺凝胶电泳分析 , 只得到分子量为 24 0和 2 0 k D 的两个蛋白质带 (图 l ) . 它们分别是红凑
肚的 。 亚基和 口亚基 . 这表明人红细胞膜的红膜肤 已经提纯 .
.2 兔抗人红膜红膜肤血清的鉴定 免疫双扩散的结果表明 , 兔抗人红膜红膜肤血清与
人红膜红膜肤或者与人红膜全蛋白之间都只产生一条沉淀线 . 抗 血清 的 效 价 可 达 1 : 16 .
3
. 免疫亲和层析提取蚕豆叶中的红膜肤 在以兔抗人红膜红膜肤血清为配基的亲和层
析柱上 , 对人红膜全嗽白的洗脱曲线如图 ZA 所示 , 对蚕豆叶质膜粗提物的洗脱曲线如图 2林
所示 . 人红膜全蛋白有两个洗脱峰 ,
套默郡 ” 即 ’ “ 和 `玩 其 中峰 ’ · 小于
n ;
. 蚕豆叶膜粗提物也有两 个洗
脱峰 , 即 vI 和 lI v . 但峰 vI 大于
峰 l v . 这表明蚕豆叶质膜粗提物
中有能与兔抗人红膜红膜肤血清发
生免疫反应的植物性抗原 . 将洗脱 .
下来的两种膜蛋白质样品进行透析
脱盐 、 冷冻干燥 , 然后用 S D S 一聚丙
烯酞胺凝胶电泳进行分析 . 正如所
预期的那样 , 经免疫亲和层析分离
后 , 从人红膜全蛋白中得到了红膜
肤 a 和红膜肤夕(分子量分别为 2 4沙
和 2 0 k D ) 两个蛋白带 (图略 ) . 这
两个蛋白质是抗血清的直 接 抗 原 ,
同样 , 从蚕豆叶质膜粗提物中也得
图 1 sD s 一聚丙烯酸胺凝胶电泳鉴定人红细胞膜 ’ 到了两个分子量与前者十分相似的
sP ce itr
” “ 和 夕的纯度 蛋白带 , 我们认为其中分子量较大
.A 提纯后的人红膜 s p ce tr 议 “ 和 出 .B 人红膜全蛋白 的蛋白质为蚕亘叶红膜肤 a , 分子
里较小的为蚕豆叶红膜肤 夕. 它们的分子量在文献 [ 31 中已被确定分别是 2朽 和 2 28 kD .
4
. 间接曲联免痊吸附法 ( E U S A ) 对蚕豆叶细胞质膜各电泳蛋白带中的红膜肚的鉴定
酶联免疫吸附法鉴别结果表明 , 兔抗人红膜红膜肤血清与其直接抗原即人红膜的带 l (红膜胧
第 1 7 期 科 学 通 报 1 3 2 ,
0
.
8
08
O 6(￡占阅 0ù栩侧嗽ǎ E青 0ù脚嗽侧
0
.
2
02
O ` 一 -
目一 -`一一 -~ -一距离 (。 11 )
图 2以兔抗人红膜 s p , ` t r i“
五 . 人红细胞膜蛋白的免疫亲和层析洗脱曲线 ;
距离 ( cm )
血清为配基的免疫亲和层析洗脱曲线
B
. 蚕豆叶细胞质膜粗提物蛋白的免疫亲和层析洗脱曲线
图 3 蚕豆叶细胞质膜 s D s一聚丙烯酸胺
凝胶电泳各蛋白带的 E lL s A 鉴定
人行和 B 行为人红膜各蛋白带 , A I . 对照 , A卜 : p卜
c t r i n “ , A : . o P e c t r i n 产, A一 A一 a n k犷r i n , A , .
·带 今. 1 , A二 带 4 . 2 , A , . a c t i 。 , A 一。 . 带 6 、 B: 、带 7 、
·
C 行和 D 行为蚕豆叶细胞质膜各蛋白带 . c’ . 对照 ,
C
: . 带 1 ( 2 4 5 k D ) , C , . 带 2 ( 2 28 k D ) , C一 C : 。 . 带 3一带 , , D : 一D o . 带 1 一带 “ . 蚕豆叶细胞质膜蛋
白电泳结果参照文献「l ]
图 4 兔抗人红膜 , p ec tr in 血清结合的荧光共
价小球与人红膜内表面 , p e “ t r in 的免疫结合
人 . 明视野下固定在聚乙烯醉薄漠上的 人 红膜 碎 片
(黑箭头 ) ; B . 暗视野下有荧光激 发 时 观察 到 的
。 p 。 。 “ in 抗血清结合的荧光小球与人 红膜 内表 面
发生 免疫结合形成的荧光斑 (白箭头 ) ; C . 人红 膜
内表面先用 兔抗人红膜 : p。口 r in 血 清 处理 后 , 则
不能再与坑体荧光共价 结 合 x 4 20 (激 发 光 波 长
魂5 5 n m )
a) 和带 2 (红膜肤 刃 都呈现强烈的颜色反应 . 与带 2 . 1 和 2 . 2的颜色反应较弱 , 与其它蛋
白带的颜色反应则更弱 (图 3 ) . 蚕豆叶细胞质膜的带 1 ( 2 4 5 k D ) 和带 2 ( 2 2 8k D )均有明显的
颜色反应 , 尤其带 l 的颜色反应最强 . 其余除少数蛋白带外均无明显的颜色反应 。 这表明蚕
13 3 0 科 学 通 报 l , 9 0 年
豆叶细胞质膜带 1 (红膜肤 a) 和带
特性 . 其它各呈颜色反应的蛋白质
尚待研究 .
5
. 免疫荧光组织定位 与兔
抗人红膜红膜肤血清结合的荧光共
价小球能与内表面暴露的人红膜碎
片发生免疫结合 ( 图 4 ) , 形成较小
的荧光斑 . 这种抗体荧光共价小球
同样可被免疫结合到内表面暴露的
蚕豆叶细胞质膜碎片上 , 形成较大
的荧光斑 (图 , ) . 如果这两种膜碎
片预先用兔抗人红膜红膜肤血清处
理 , 就不再发生上述免疫结合反应 .
另外 , 抗体荧光共价小球不能与蚕
豆叶原生质体外表面及其它细胞器
发生类似的免疫结 合 反 应 (图 5 ) .
这些结果表明 , 蚕豆叶红膜肤与人
红膜红膜肤一样 , 也是固着在细胞
质膜内表面上的 . 我们用免疫荧光
2 (红膜肤 刃 与人红膜红膜肤 a 和 夕具有相似的免疫
图 , 兔抗人红膜 : eP ct r in 血清结合的荧光共价小球
与蚕豆叶细胞质膜内表面的免疫结合定位
A
. 明视下观察到的固定在聚乙烯醇薄漠上的并被胀破的蚕豆叶原生
质体 ; B . 在有荧光激发的暗视野下观察到的内表面暴露或局 部 泉
露的蚕豆叶原生质膜与抗体荧光共价小球发生免疫结合后形成 的 荧
光斑 . 虽已胀破但内表面尚未暴露的原生质体碎片不能与抗体荧光
共价小球发生免疫结合 ; C . 抗体荧光共价小球不能与蚕豆叶原 生
质体外表面发生免疫结合 , 只与原生质体碎片某些局部发生免座结合
(白色箭头 ) x 4 20 ( 激发光波长 4 , 5 n m )
一法证明在番茄 、 烟草 、 油菜等质膜内表面都有红膜肤的存在 .
三 、 讨 论
近年来 , 越来越多的研究证明 , 除人红细胞膜外 , 在许多种脊推动物的器官的细胞质膜中
都存在着膜骨架蛋白 ,特别是红膜肤 , 如脑细胞 2[] 、 肠刷状缘细胞8t] 、 肝细胞 、 淋巴细胞和成纤
一维细胞 〔` ]等 , 构成一个膜骨架 . 在无脊椎动物如果蝇 ( D r o , o p h i l a o e l a , o g a ; t e r ) 的质膜上也
存在着红膜肤等细胞骨架蛋白 gt] . 由此可见 , 膜骨架并不是脊椎动物红细胞所特有的结构 , 而
是普遍存在于动物界细胞中的 . 组成细胞的蛋白质种类基本上也是相同的 , 例如都有相似的
细胞骨架系统及各种细胞骨架蛋白 . 在细胞质膜的膜骨架系统上 , 动植物细胞也应该是相同
的 . 植物细胞质膜上也应 当有一个膜骨架系统才能维持细胞的形状 , 调节细胞的运动等功能 。
本文的研究结果证明 , 在高等植物细胞的质膜上也存在着红膜肤 , 并定位于质膜的内表面上 。
因此我们相信 , 在植物细胞质膜的内表面上也可能固着一个膜骨架系统 .
参 考 文 献
[ l ] B r
a n : ` J .1 , D
. e t a l
,
C
e
l l M
o , i l i t y
,
3 ( 19 8 3)
,
6之3一 6 3 3 ·
[ 2 ] G l
e n : , e y , J
.
R
.
e : a l , C 亡 11, 3 4 ( 19 8 3)
,
5 0 3一 5 12 ·
[ 3 ] 王育东 、 阎隆飞 ,科学通报 , 3 1 ( 19 8 6 ) , 2 3 : 18 2 6一 1 8 2 9 .
{ 峪 ] B e n n e t t , V
.
, A n o
.
R
e ,
.
B i
o c 人。。 . , 5 4 ( 19 8 5) , 2 7 3一 3 0 4 .
[ 5 ] 王育东 、 阎隆飞 ,植物学报 , 3 1 ( 19 8 9 ) , 4 3 2一 4 4 0 .
{ 6 ] D
o d g e
,
J
.
T
· ,
A
r c人. B i o c 人` 。 . B i o P h厂 , 1 0 0 ( 19 6 3 ) , 1 1 9一 13 0 .
[ 7 ] aL
o m m li
,
U
.
K
· ,
N a , u
r 二 , 2 2 7 ( 1 97 0 )
,
6 8 0一 6 8 5 .
t 8 1 G l
e n n e y , J
.
R
.
e t a l
, p r o c
.
A c a d
.
cS i
.
US A
,
7 9 ( 1 9名2 ) , 4 0 0 2一4 0 0 5·
之9 ] D u b r e i l , R . o t a l 4 , J . C e l l B i口 l , 1 0 5( 19 8 7) , 20 9 弓一 2 20 2 .
第 17 期 科 学 通 报 1 3 3 1