全 文 ：蚕豆叶细胞膜膜蛋白的研究 *
王 育东 阎 隆 飞
(北京农业大学生物化学教研室 )
目前 , 人们对动物细胞膜 , 特别是对人红细胞膜的研究相当深人 . 现在已经证明 , 在人红
细胞膜的内侧覆盖着一层浓密的网状结构— 膜骨架 (m e m br an o s ke let on ) . 它主要是由收缩蛋白 ( s p e ct r i n ) 、 连接蛋白 ( a n k y r i n ) 和肌动蛋白 ( a e t i n ) 等组成的以 , , , . 类似的膜骨架蛋白
在其它动物细胞膜的存在也已经得到证明 〔 3 ,41 .
研究植物细胞膜膜蛋白的组成对于了解植物细胞膜的结构和功能是十分重要的课题 . ` 目
前 ,对于植物细胞膜蛋白的研究尚未见有报道 . 我们以蚕豆叶为材料 , 用二相分配分离法得到
了较纯的细胞膜 . 对这种质膜的膜蛋白进行了 SD S 一聚丙烯酸胺凝胶电泳分析 ,表明在植物细
胞膜中也存在着类似动物细胞膜中的 几种膜蛋白 .
一 、 材 料 和 方 法
1
. 材料 田间或温室生长的蚕豆 ( iV ic 口 f ab a) , 采用上部叶片为材料 .
.2 原生质体的制备 取 50 9 新鲜蚕豆叶 , 撕去下表皮 , 浸人 1 50 间 含有 1扮纤维素酶 , ’
0
.
5务 果胶酶 , 0 . s m o l / l 山梨醇和 0 . s tn m o l / 1 C a e l: 的溶液中 。 室温下水解 2一 3 h 。 低速离
心收集原生质体 . 用 0 . s m ol ZI 山梨醇等渗液洗涤 3 次 , 每次都以低速离心收集完整的原生质
体 .
3
. 细胞膜的制备 将完整的原生质体悬浮在 1 0 耐 0 . 25 m ol / l 山梨醇 , l m m ol / 1 E D T A ,
s m m ol / 1吨 50 ; , 1 o m m of / 1 rT is 一 H CI p H 7 . 4 的缓冲液中 . 将原生质体悬浮液吸人装有 8 ·号
针头的注射器内 , 用力挤压 , 使原生质体在经过针头时破裂 . 悬浮液经 9 , 0 0 x g 离心 20 m in ,
去除沉淀 . 上清液再经 30 , 0 0 x g 离心 l h . 收集沉淀 , 并使之悬浮于 10 lm 上述提取液中 , 即
为 质膜的粗提液 . 于 50 ml 离心管内加人二相溶液各 10 时 , 再加人 2耐 质膜粗提液 . 用盖子
盖紧离心管 , 反复倒转 20 次 , 使样品与二相液充分混合 . 混合液用水平转头以 1 0 0 x g 离心
斗m in . 这时在二相液之间形成界面 . 小心吸出上相液 (不可触动界面 ) 注人另一离心管内 , 这
个组分为初步提纯的细胞膜 . 可用重蒸水洗涤三次 , 每次以 30 , 0 0 x g离心 h1 收集沉淀 , 最后
悬浮于 1间 上述提取液内 . 如果向这个组分内加入新的下相液 , 混合后用水平转子 10 0 x g
离心 4 m in , 进行第二次分离 , 所获得的样品为二次纯化的细胞膜 . 按上述方法洗涤后 , 悬浮于
l m l 提取液内置 一 30 ℃ 保存 .
4
. 二相系统的配制 采用 .6 3务 的葡聚糖 T 5 0 ( d xe tr an T s o o ) 和 .6 2多的聚乙二醇
6 0 0 0 ( p E G 6 0 0 0 )
, 配制方法参照 w i d e l l 等「5 , 6 , .
5
.
S D S
一聚丙烯酞胺凝胶电泳 参照 aL e mm il 〔7]的方法并略加修改 . T ~ 7 . 5多 , C ~ 3多 .
本文 1 9 8 6年 1 月 24 日收到 .
* 中国科学院科学基金资助的课题 .
1 8 2 6 科 学 通 报 1 9 8 6 年
胶板厚度为 L s m m ·
6
. 辘蛋 白染色法 参照 Fa irba n kS[1 8。
7. 人红细胞膜的制备 用生理盐水洗涤新鲜人血 3次 , 每次以 2 0 0 0 x g 离心 1 , m in ,
收集完整的红细胞 . 用 s m m of l/ p H S 的磷酸缓冲液悬浮红细胞 , 使红细胞胀破 . 再以 l 。 , 0 0
x g 离心 20 m in 收集影泡 . 用上述磷酸缓冲液连续洗涤影泡数次 , 每次都以 10 , 00 x g 离心
20 m in 收集影泡 ,直到影泡呈白色为止 . 具体操作参照 D od ge gt] 的方法 .
二 、 结 果 及 讨 论
最初 ,人们采用蔗糖密度梯度离心法获得细胞膜助 .l1] , 但所得到的细胞膜纯度不高 , 操作
复杂且获得样品量少 . 近年来 , 人们采用二相分配分离法来提取细胞膜 . 这个方法也被引人
到植物细胞膜的纯化中来〔5 ,6] .
我们应用二相分配分离的方法得到了较纯的蚕豆叶的细胞膜 . 该细胞膜用 S D S一聚丙烯
酚胺凝胶电泳分离 , 可以得到 14 条考马斯亮蓝染色的蛋白带 . 按其迁移率由小到大的顺序分
别命名为带 1 到带 14 (图 I A ) . 按照分子量的大小 , 可以把它们大致划分为三组 . 第一组为
高分子量的蛋白带 , 包括带 1 到带 3 . 它们的分子量分别是 24 5 , 0 0 0 、 2 28 , 0 0 和 2 05 ,。0 0 . 第
二组是中等分子量的蛋白带 , 包括带 4 到带 8 . 它 们 的 分 子 量 分 别 是 1 15 ,。 o。 、 1 05 ,。。Q、
那 , 0 。 、 72 , 0 0 和 68 ,。 0 0 . 第三组是低分子量蛋白带 , 包括带 9 到带 1 4 . 它们的分子量分别
是 5 0 , 0 0 0 、 4 7 , 0 0 0 、 4 3 , 0 0 0 、 3 6 , 0 0 0 、 3 0 , 0 0 0 和 2 6 , 0 0 0 .
蚕豆叶细胞膜蛋白带的扫描图和人红细胞膜蛋白带的扫描图见图 2 .
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J Z—」3—14—图 1 蚕豆叶质膜膜蛋白与人红细
胞膜蛋白的 s D s 一 P A G E 图谱比较
A
. 蚕豆叶细胞膜蛋白带 ; .B 人红细胞膜蛋白带
(带 1 s p e e t r i月 “ , 带 2 s p e e t r in 夕, 带 2 . 1一 2 . 3
。 k y r i。 , 带 5 a c t i n )
图 2 蚕豆叶细胞膜蛋 臼和人红细胞膜蛋白
的 s D s一聚丙烯酞胺凝胶电泳光密度扫描 图
.A 蚕豆叶细胞膜蛋白的光密度扫描图 ; .B 人红细抱
膜的光密度扫描图 . 扫描波长 6 。。n m , 参比波长 碍0
n
m
, 扫描速度 2 0 e m l m i。 : 纸速 Z o e m /m i。
第 23 期 科 学 通 报 1 3 21
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图 3 蚕豆叶细胞膜搪蛋白的 s sD 一聚丙
烯酞胺凝胶电泳光密度扫描图
^ 。 完整的扫描图 ; B . 为 A的局部放大扫描图 ,
示籍蛋白带 s : 、 s : 、 s , 和 s二 扫描波长 5 6 o n m ,
参比波长 4 0 0n m , 扫描速度 Z o c : n /m i n , 纸速 2 0
c
m /m i
n 和 4 0 e川 lm i n
经 P A S 试剂染色 , 发现有 4 条糖蛋 白带 . 分
别命名为 s : 到 .5 . 它们的分子 量 分 别是 4 7 , 0 0 0 、
4 6
,
0 0 0
、 4 5
,
0 0 0 和 4 1 , 0 0 0 . 其中 s , 为考马斯亮蓝染
色的带 10 (图 3 ) .
人红细胞膜和蚕豆叶细胞膜都属于质膜 . 将两种 ,
质膜的膜蛋白的分子量相比较可以发现 , 人红细胞膜
的带 1 、 2 、 2 . 1 、 4 . 2 和 5 的分子量分别与 蚕豆叶 细 胞 .
膜的带 1 、 2 、 3 、 7 和 1 的分子量十分接近或 完全相 、
同 (表 l ) .
人红细胞膜的这 5 个蛋 白质是构成膜骨架的主要
成分 1[J . 带 1是收缩蛋白 “ , 带 2 是收缩蛋白 尹, 带 2 . 1
是连接蛋白 , 带 5是肌动蛋白 . 上述结果表明在蚕豆
叶细胞膜上也存在着类似人红细胞膜的多种 蛋 白 质 ,
特别是收缩蛋白 “ 、 夕, 连接蛋 白及肌动蛋 白 .
蚕豆叶细胞膜中的收缩蛋白及连 接 蛋 白含 量较
少 . 这种现象与动物的非红细胞膜的 收缩蛋 白的含量
很相似 s[, 们 。 为进一步证明植物细胞膜上含有收缩蛋白
“ ,夕, 我们做了免疫化学的研究 ,结果将另文进行讨论
表 l 人红细胞膜蛋白和蚕豆叶细胞膜蛋白分子量的比较
人 红 细 胞 膜 - -一 - 一 { 蚕豆叶细胞膜 分子量相同的
区 带 号 巳 命 名 分 子 量 区 带 号 分 子 量
l S p e c t r i n “ 2 40 , 0 0 0 l 2 4 5 , 0 0 0
2 s p e c t r i n 口 2 2 0 , 0 0 0 2 2 2 8 , 0 0 0
2
。
l A n k y r in 2 10
,
0 0 0 3 2 0 5
,
0 0 0
2
。
2 A e t in 18 3
,
0 0 0 斗 1 1 5 , 0 0 0
2
。
3 16 5
,
0 0 0 5 10 5
,
0 0 0
3 9 5
,
0 0 0 6 8 8
,
0 0 0
4
。
l 8 2
,
0 0 0 7 7 2
,
0 0 0
4
。
2 7 2
,
0 0 0 8 6 8
,
0 0 0
4
。
, 5 9
,
0 0 0一 5 2 , 0 0 0 9 5 0 , 0 0 0
呼。 9 4 8 , 0 0 0 I 0 呼7 , 0 0 0
5 4 3
,
0 00 1 l 4 3
,
0 0 0
` 3 5 , 0 00 l 2 3 6 , 00(]
7 2 9
,
0 00 l 3 3 0
,
0 0 0
糖蛋白 2 9 , 00 0 l 4 2 6 , 0 0 0
P A S I 2 5
,
0 00 塘蛋白 4 7 , 0 0 0
P A S Z S : 4 6
,
0 0 0
P A S 3 S
:
4 5
,
0 0 0
P A S今 S s 4 1 , 0 0 0
S -
1 8 2 8 科 学 通 报 1 9 8 6 年
参 考 文 献
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皿 r an t .。 , D , 伪卜en , c , M . 幼d T , Io r , J , 侧 l , 2气 l始 l) , 2` ~ 3 2 ,
G r a t从 r , w … , iB o e h。脚 . J , 19 8 (一” 1), 几一日.
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l l M o , a’l l’ y , 3 ( 19 8 3) , 6 3 5一6 4 7 .
G o o d口幼 , s · R · e r a l , p r o c . N o : 1 . * a d . isc
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,
C
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W i do l l
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aL 恤功11, U . K , 扣 。 , , r .e 2 2 7( 19 7 0) , 6 80we 6 8 5 ,
F a i r b a n k s
,
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介 y1公 , A . R . .D a n d aH l l , J . L . , A d va n ` e i n P r o t o p l a s t R e a s e r e权 p r o c 一时 i叮: ol : 几` 5`毛 I . r , ,栩沁树 护or : o P I叨
S y娜 P o j i u脚 , S z e g e d H u n g a r了, 19 7 9 , 9一 14 ·
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第 ” 期 科 攀 通 报 t . 29