全 文 ：中南大学学报(医学版)
J Cen t South Un iv (Med S ci)　 2006, 31(5)
黄花倒水莲皂苷 C抑制 ox-LDL诱导的 LOX-1的表达
柏勇平 1 , 张国刚 1 , * , 石瑞正 1 , 李元建 2 , 谭桂山 3 , 陈　嘉 4
(中南大学　1. 湘雅医院心内科 , 长沙 410 008;2. 药学院药理学系 , 长沙 4 100 78;
3. 药学院药物化学系 , 长沙 41 001 3;4. 湘雅医院放疗科 , 长沙 410 008)
[ 摘要 ] 　目的:观察黄花倒水莲皂苷 C 抑制氧化型低密度脂蛋白 ( oxidized low density lipopp ro te in ,
ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 ( oxidized low desity lipop ro te in recep-
tor-1 , LOX-1)表达的作用 。 方法:培养人脐静脉内皮细胞株 (HUVEC-12), 随机分为:对照组 、 ox-LDL
(5 0 m g /L)组和氧化型低密度脂蛋白 (50 m g /L) +黄花倒水莲皂苷 C(1, 3 , 10 μm o l /L)组 , 通过 RT-
PCR和 W este rn blot蛋白印迹分析检测 LOX-1 mRNA 和蛋白的表达 。 结果:ox-LDL上调 LOX-1 mRNA 和
蛋白的表达 , 黄花倒水莲皂苷 C 明显抑制 ox-LDL诱导的 LOX -1 mRNA 和蛋白的表达 , 且呈浓度依赖性 。
结论:黄花倒水莲皂苷 C 明显抑制 ox-LDL诱导的内皮细胞 LOX -1 mRNA 和蛋白的表达。
[ 关键词 ] 　 黄花倒水莲皂苷 C;　氧化型低密度脂蛋白;　血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体
[ 中图分类号 ] 　R 392. 12　[文献标识码 ] 　A　[文章编号 ] 　 167 2-73 47(200 6)0 5-06 59-0 4
Inhibitory effect of reinioside C on LOX-1 expression induced by ox-LDL
BA I Yong-p ing1 , ZHANG Guo-gang1, * , SHI Ru i-zheng1 ,
LI Yuan-jian2 , TAN Gui-shan3 , CHEN Jia4
(1. D epartm en t of Card io logy , X iangya Hospita l, Centra l Sou th Un iversity , Changsha 410008;
2. D epartmen t of Pharm acology , S chool of Pharm aceutica l S ciences, Cen tra l Sou th Un iversity , Changsha 410078;
3. Departm en t of M ed icina l Chem istry , S chool of Pharm aceutica l S ciences, Centra l Sou th Un iversity , Changsha 410013;
4. Depa rtm en t of Rad ioth erapy , X iangya Hospita l, Cen tral South Un iversity , Chang sha 410008, Ch ina )
Abstract:　Objective　To investigate the e ffec t of reinioside C (RC) on the expre ssion o f lec-
tin-like ox id ized low density lipop ro tein recepto r (LOX)-1 mRNA and LOX-1 p ro tein induced by ox-
id ized low density lipopro tein( ox-LDL ) in cultured human umbilical vein endo thelial cells (HU-
VEC). Methods　HUVEC s w ere cu ltured w ith ox-LDL (50 mg /L) fo r 2 4 h in the absence or
presence o f RC (1 , 3 , and 10 μmo l /L). The exp ressions o f LOX-1 mRNA and LOX-1 prote in
w ere exam ined by RT-PCR andW estern-b lot. Results　 Incuba tion w ith ox-LDL (50mg /L) signif-
ican tly ra ised the expression o f LOX-1 mRNA and LOX-1 prote in , which w as concentration-depend-
ent. Conclusion　RC can inhibit the increased exp ression of LOX-1 mRNA and LOX-1 pro te in in-
duced by ox-LDL in HUVEC s.
Key words:　 re in ioside C;　 oxida tive ly low-density lipoprote ins;　 lectin-like ox id ized low
density lipopro tein receptor-1
[ J Cen t South Un iv (Med S ci), 2006 , 31(5):0659-04]
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收稿日期:2006-08-09　　作者简介:柏勇平(1981-),男 ,湖南永州人 ,硕士研究生 ,主要从事冠心病发病的机制研究。
*通讯作者 , E-m ai l:xyzgg2006@ sina. com
中南大学学报(医学版), 2006, 31(5)　
　　 氧化型低密度脂蛋白 (oxidatively low-dens ity
lipoproteins , ox-LDL)导致的内皮功能障碍在动脉
粥样硬化 (atherosclerosis , AS)病理过程中起着关
键作用 [ 1] ,但 ox-LDL损伤内皮的分子机制仍不明
确 。血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1 ( lectin-
like oxidized low density lipoprotein recepto r-1 , LOX-1)
是近年发现的新型 ox-LDL特异性受体 , 主要存在
于内皮细胞表面 , 研究发现它与以往的清道夫受
体无任何同源性 ,是内皮细胞摄取和代谢 ox-LDL
的主要受体 ,可介导 ox-LDL的生物学活性 , 在 AS
中发挥重要作用 [ 2] 。
黄水 倒水莲 (Po lygala aureocauda Dunn , PAD )
主产于江西 、福建 、两广和云南 ,其味甘 ,微苦 ,性
平 [ 3] 。现代研究证明 ,其根含皂苷 、多糖 、有机酸 、
氨基酸等成分 , 具有降血脂 ,抗炎 ,改善心肌缺血
等作用 [ 4] 。黄花倒水莲皂苷 C( reinioside C , RC)是
从黄水倒水莲中提取的一种单体成份 [ 5] 。本课题
拟通过体外培养内皮细胞 ,检测 RC对 ox-LDL诱
导的 LOX-1 mRNA 及 LOX-1蛋白表达的影响 ,为
开发新的抗动脉粥样硬化药物提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材料 　　人脐静脉血内皮细胞株:HUVEC-12
(湘雅医学院细胞培养中心 ), RC由中南大学药学
院提纯 ,经 HPLC 分析 , 纯度 >90. 0%;DMEM 培
养基 、T rizo l系 G ibco产品 ;小牛血清购自杭州四季
青 ;BCA蛋白浓度测定试剂盒购至于江苏碧云天
生物有限公司 ;RT-PCR试剂均为 MBI产品 ;PCR
M arker购自北京鼎国生物技术有 限公司 ;B land
leader凝胶图像分析软件 ;羊抗人 LOX-1多克隆抗
体和鼠抗羊 IgG 抗体购自 Santa Cruz Bio technology
公司 (美国 )。
1. 2　方法
1. 2. 1　血浆 LDL的提取和 LDL的氧化 　　健康
人新鲜血浆 , 用密度梯度超速 离心法分离制备
LDL(密度为 1. 019 ～ 1. 063 kg /L)。分离的 LDL
置于磷酸缓冲液 (0. 01 mol /L , pH 7. 4)充分透析
24 h, 以 BCA 法测定 LDL蛋 白含量 。将提取的
LDL置于终浓度为 10 μm ol /L的 CuSO4中充分氧化
24 h, 0. 2 mm ol /L EDTA终止氧化 。用硫代巴比妥
法测定脂质过氧化终产物 MDA 的含量 , 以鉴定
ox-LDL的氧化程度 [ LDL:(5. 26 ± 0. 96) mo l /
(L g);ox-LDL:(26. 03 ± 5. 26) mol /(L g)] 。
1. 2. 2　人脐静脉血内皮细胞的培养 　　取 HU-
VEC-12细胞株 ,解冻复苏后加入含 10%小牛血清
的 DMEM 培养基制成细胞悬液 ,接种于培养瓶中
置于 5% CO2培养箱中培养 (37 ℃)。待细胞长满
瓶底 80%左右时将细胞转移至 6孔培养板 (1 ×
10
6
/孔 ),细胞 80%融合时换成含 1%小牛血清的
DMEM 培养基继续培养 24 h , 使细胞达到同步化 ,
然后分别加入不同的处理因素 。
1. 2. 3　实验设计 　　随机将 6孔板细胞分为 :
(1)空白对照组 。用含 1%小牛血清的 DMEM 培
养液孵育 HUVEC细胞 24 h;(2)ox-LDL处理组 。
用含 50 m g /L ox-LDL的培养液孵育 HUVEC细胞
24 h;(3)RC +ox-LDL组 。在加入 ox-LDL(50 mg /
L)前 4 h分别加入终浓度为 1 , 3 , 10 μmo l /L的
RC。收集细胞 ,通过 RT-PCR和 W estern blot蛋白
印迹分析检测 LOX-1 mRNA 和蛋白的表达 , RC溶
于双蒸水中 。
1. 2. 4　 RT-PCR 检测 LOX-1 mRNA 的表达 　　
T rizol试剂盒提取总 RNA , 紫外 分光光度计检测
A260和 A280吸光度 ,计算纯度和含量 , A260 /A280均在
1. 8 ～ 2. 0之间 。取 2 μg总 RNA 进行逆转录后取
2. 5 μL行 PCR反应 , β -actin为内参照 。 PCR扩增
LOX-1片断 (193 bpm ),以 β -actin (472 bp)作参
照的 LOX-1上游引物 :5′-TTA CTC TCC ATG GTG
GTG CC-3′;下游引物 :5′-AGC TTC TTC TGC TTG
TTG CC-3′;内参 β -actin 上游引物 :5′-AAA TCG
TGC GT ACA TTA A-3′;下游 引 物 :5′-CTC GTC
ATA CTC CTG CTT G-3′。上述引物由上海生物工
程公司合成 。 PCR 反应体系 50μL , 反应条件为
94℃预变性 5m in , 94 ℃变性 45 s, 57℃退火 40 s,
72℃延伸 1. 5 m in, 共 35个循环 ;72 ℃延伸 10
m in。取 8μL PCR产物于 2%的琼脂糖凝胶电泳并
用成像系统扫描摄片 ,用 Bland leader凝胶图像分
析软件分析电泳条带的积分光密度值 。以目的基
因 /β-actin的比值表示目的基因 mRNA的表达水
平 。
1. 2. 5　W estern blo t分析 LOX-1蛋白表达 　　用
4 ℃预冷的细胞裂解液将内皮细胞裂解 ,测定蛋白
浓度 。取 30 μg总蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离蛋白 , 电转移至硝酸纤维素膜上 。转移后
的硝酸纤维素膜经脱脂奶粉封闭 1 h ,洗涤后置于
1∶1 000稀释的羊抗人 LOX-1多克隆抗体中 4 ℃过
夜 ,经二抗孵育 , DAB显色 , 计算机扫描蛋白条带
后进行灰度扫描分析 。
1. 3　统计学处理 　　所有数据均以均数 ±标准
660
黄花倒水莲皂苷 C抑制 ox-LDL诱导的 LOX-1的表达　柏勇平 ,等
差 (–x ±s)表示 。用 one-w ay ANOVA进行统计学处
理 ,组间差异采用 LSD检验 。双侧 P <0. 05认为
差异有统计学意义 。
2　结 　　果
RC对 ox-LDL诱导的内皮细胞 LOX-1 mRNA
及蛋白的影响 :用含 50 m g /L ox-LDL的培养液孵
育内皮细胞 24 h后 , ox-LDL组 (50 mg /L)与对照
组相比内皮细胞 LOX-1 mRNA 和蛋白表达均明显
增加 ,两者比较差异有统计学意义 (P <0. 01), RC
(1 , 3 , 10 μmo l /L)明显抑制 ox-LDL诱导的 LOX-1
mRNA和蛋白的表达 , 与 ox-LDL组比较差异有统
计学意义 (P <0. 01), 且呈浓度 依赖性 (图 1,
图 2)。
图 1　RC对 ox-LDL诱导的内皮细胞 LOX-1 mRNA表达的影响　A:RT-PCR分析内皮细胞 LOX-1 mRNA表达水平代表图;B:内皮细胞中
LOX-1 mRNA表达水平的灰度分析(n=6, ** P<0. 01 vs cont ro l, +P <0. 05 vs ox-LDL, ++P<0. 01 vs ox-LDL)
F ig. 1 Inf luence of rein iosid e C onLOX-1 mRNA exp ress ion inHUVEC s induced by ox-LDL　A:mRNA band of LOX-1 and β-actin determ ined by RT-
PCR;B:H istogram ofLOX-1 mRNA exp ressing value (n=6, ** P<0. 01 vs con trol, +P<0. 05 vs ox-LDL, ++P<0. 01 vs ox-LDL)
图 2　RC对 ox-LDL诱导的内皮细胞 LOX-1蛋白表达的影响　A:W es tern-B lot分析内皮细胞 LOX-1蛋白表达水平代表图;B:内皮细胞中
LOX-1蛋白表达水平的灰度分析(n=6, ** P <0. 01 vs cont ro l, ++P <0. 01 vs ox-LDL)
F ig. 2 Th e inf luence of rein ios ide C on LOX-1 p rotein exp ression inHUVEC s induced by ox-LDL　A:P rotein band ofLOX-1 and β-actin determ ined by
Western-B lot;B:H istogram of LOX-1 protein exp ressing value (n=6, ** P<0. 01 vs con trol, +P<0. 05 vs ox-LDL, ++P <0. 01 vs ox-
LDL)
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3　讨 　　论
高脂血症是 AS的主要危险因子之一 ,血浆的
主要成分胆固醇 60% ～ 70%以低密度脂蛋白 ( low
density lipoprotein , LDL)形式存在 。当血浆 LDL水
平升高时 ,动脉内膜因为 LDL或其他因素作用 ,可
产生氧自由基及其代谢产物 , 使进入内膜的 LDL
发生氧化 ,成为 ox-LDL。 ox-LDL可改变内皮细胞
表面分子 ,导致内皮通透性增加和内皮功能损伤 ,
使一氧化氮 (nitric oxide , NO )释放减少 、内皮素释
放增加 ,并可表达黏附分子 、分泌化学趋化蛋白 ,
使血流中的单核细胞与内皮细胞黏附并大量进入
内皮下 ,摄取脂质转化为巨噬细胞 ,并进一步摄入
脂质而转化为泡沫细胞 , 从而促进 AS的发生和
发展 [ 6] 。
传统认为 , ox-LDL 通过激活巨噬细胞和平滑
肌细胞表面的清道夫受体发 挥其生物学效应 。
Saw am ura等 [ 7]于 1997年在牛主动脉内皮细胞上
发现一种 新型 的 ox-LDL 特 异受 体 , 即 LOX-1。
LOX-1属于 C型血凝素家族 , Ⅱ型膜蛋白结构 ,和
已知的 ox-LDL的清道夫受体没有任何同源性 ,主
要存在于内皮细胞表面 。近来的研究显示 , LOX-1
可介导 ox-LDL诱导的黏附分子表达 、基质金属蛋
白酶表达及 CD40 /CD40L信号通路的激活等生物
学活性 [ 8] 。而且 , LOX-1在 AS斑块内表达水平明
显升高 ,斑块内可检测到 LOX-1的配体 [ 9] 。这些
研究结果均提示 , LOX-1在 AS 发生 、发展过程中
起着重要的作用 。对 LOX-1的检测以及抗 LOX-1
治疗可能为心血管疾病的防治提供新思路 。
作者在实验中发现 , 在培养的人脐静脉内皮
细胞中 , ox-LDL(50 m g /L)可诱导 LOX-1 mRNA及
LOX-1蛋白的高表达 , 提示 ox-LDL 可能通过上调
受体 LOX-1表达 ,激活细胞内信号传导通路 ,从而
改变内皮细胞的分泌活性 , 推动 AS 发生和发展 ,
这与国内外研究一致 [ 10] 。
PAD 主产于江西 、福建 、两广和云南 。其味
甘 ,微苦 ,性平 ;具有补益气血 , 健脾祛湿 ,活血化
淤等功效 [ 3] 。现代研究证明 , 其根含皂苷 、多糖 、
有机酸 、氨基酸等成分 , 具有降血脂 、抗衰老 、抗
炎 ,改善心肌缺血 , 免疫调节等作用 [ 4] 。有研究表
明 , RC为其主要化学成分之一 [ 5] 。本实验结果表
明 , RC可明显抑制 ox-LDL 诱导的 LOX-1 mRNA
及 LOX-1蛋白表达 ,提示 RC不仅具有降血脂的作
用 ,而且可抑制 LOX-1 ,从而抑制动脉粥样硬化的
发生和发展 。本研究为将其开发为新的抗动脉粥
样硬化药物提供了部分理论依据 。
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(本文编辑　傅希文 )
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