全 文 ：文章编号　 1004-6410 ( 2005) 04-0073-05
利用豆渣黄浆水发酵生产核黄素的研究
宋德贵1 ,卫　军 2 ,杨生玉 3
( 1. 广西师范大学生命科学学院 ,广西 桂林　 541004;
2. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院 河南 郑州　 450052; 3. 河南大学生命科学学院 ,河南 开封　 475001 )
摘　要: 以工业豆渣黄浆为主要原料 ,利用阿氏假囊酵母生产核黄素。对发酵生产核黄素的工艺条件进行优化 ,并对
影响核黄素产率的营养因素及生产核黄素的影响能力进行了研究。 经正交实验得出该阿氏假囊酵母菌种利用豆渣
的最佳培养基 ,在 28℃发酵培养 13 d,核黄素产量达到最高。
关　键　词: 核黄素 ;阿氏假囊酵母 ;发酵 ;正交实验
中图分类号: X787　　　　文献标识码: A
收稿日期: 2005-11-11基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30360013) ;河南省科技攻关项目 ( 124160209)。
作者简介:宋德贵 ( 1954-) ,男 ,广西博白人 ,广西师范大学副教授。
　　核黄素 ( Ribof lavin, RF)又名维生素 B2 ,维生素 G或乳黄素 ,是一种人体必需的水溶性维生素。它对生命
活动也是不可缺少的必要成分 ,直接参与碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢作用。被世界卫生组织 (W HO)列为
评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一。它广泛用于医疗、食品、饲料工业。
　　国际上生产核黄素的工艺方法主要有 4种: 抽提法、化学合成法、微生物发酵法以及半合成法 [1 ]。与其它
方法相比 ,微生物发酵法属于生物化学过程 ,无毒安全 ,且转化率高 ,发展前景十分广阔 ,日益受到世界核黄
素生产商的青睐 [2～ 4 ]。
　　在核黄素发酵生产的原料中 ,采用豆渣或黄浆水生产核黄素不仅效价高 ,而且原料来源广泛 ,价格便宜 ,
且能提高大豆的利用价值。 有广阔的发展前景 ,近年来 ,国外特别是日本对豆制品废水废渣处理和综合利用
方面取得了较大成就 ,并且很多已经应用于实践。我国在这方面的工作还有很大差距 ,需要进一步的深入工
作 ,借鉴国外的成果 ,根据我国豆制品加工企业的特点 ,研究出废水废渣处理的先进工艺和设备 ,以及在废水
废渣的综合利用方面开辟新的思路 ,本实验研究是基于此现状提出的 ,为黄浆水和豆渣的利用提供一个应用
渠道。
1　实验材料和设备
1. 1　实验材料
　　菌株:阿氏假囊酵母 ( Eremothecium ashbyii ) ,中科院微生物研究所提供。
　　培养基: 斜面培养基 (麦芽汁培养基 ): 琼脂 2% ,麦芽汁 98% , pH6. 5,糖度 7波美 , 115℃ ,灭菌 20min;
　　种子培养基: 100% 麦芽汁 , pH 6. 5,糖度 7波美 , 115℃灭菌 20 min;
　　固体发酵培养基: 豆渣 15 g , 水 45 m l混匀 , p H 6. 0, 121℃灭菌 30 min;
　　液体发酵培养基: 黄浆水 40 ml, pH 6. 0, 121℃灭菌 30 min。
1. 2　仪器与设备
　　 DP型微生物多用培养箱 ,电热手提式压力蒸汽灭菌器 ,电热恒温培养箱 , 80- 2离心沉淀器 ,数显恒温
水浴锅 ,电热恒温鼓风干燥箱 ,电器恒温水浴锅 ,电子水平 , HZQ-F160型全温震动培养箱等常规微生物实验
器皿。
第 16卷　第 4期 　　　　　　　　　　广 西 工 学 院 学 报 　　　　　　　　　　　 Vol. 16　 No. 4
2005年 12月 　 JOURN AL OF GUANGXI UNIV ERSITY OF TECHNOLOGY　　　 Dec. 2005DOI : 10. 16375 /j . cnki . cn45 -1395 /t . 2005. 04. 017
2　实验方法
图 1　不同发酵时间对核黄素产量的影响
2. 1　发酵培养
　　固体发酵培养:取干豆渣 15 g于 150 ml三角瓶中 ,再加 45 m l水 ,经 121℃灭菌 30 min后 ,取 5 ml种子
液接种 , 28℃培养 10～ 14天 ,待测 (此温度为酵母菌常规培养温度 )。
　　液体发酵培养: 取黄浆水 40 m l于 500 ml三角瓶中 ,经 121℃灭菌 30 min后 ,取 5 m l种子液接种 ,
28℃ , 162 r /min培养 7天后待测。
2. 2　豆渣发酵生产核黄素的工艺条件的优化
2. 2. 1　发酵时间对产核黄素的影响　发酵时间对核黄素的产量有一定影响 ,为了确定最佳发酵时间 ,对不同时
间周期核黄素产量进行了研究。 将阿氏假囊酵母菌种接种到种
子培养液 ,于 28℃转速 160 r /min的摇床振荡培养 2天 ,然后将
菌液 5 ml接种于由 15 g豆渣、 45 ml水组成的基础培养基中 ,
在 28℃恒温培养 ,定期取样测定菌株生长和其中的核黄素产
量 ,结果见图 1。由图 1可以看出 ,核黄素在发酵 13 d时 ,产量最
高 ,因此发酵时间一般在 12 d或 13 d。 在实际发酵生长中可以
添加所需营养物质 ,以延长生长期和稳定期的时间 ,从而使产量
提高。 本试验采取发酵 13 d中止 ,观察取样 ,等待检测。
2. 2. 2　初始 pH值对核黄素产量的影响　将培养好的种子液 5 m l接
种于不同 pH值的基础培养基中 ,在 28℃恒温培养 13 d时取出烘干 ,测定核黄素的含量 ,结果见图 2。由图 2
可以看出 ,在初始 pH值 6. 5左右核黄素发酵产量最高。当 pH值高于或低于 6. 5,核黄素的产量都迅速下
降 ,核黄素产量随 pH值改变的变化图近似成钟罩型。
2. 2. 3　接种量对核黄素的产量影响　接种量对核黄素的产量也有一定影响 ,采用不同的接种量作平行试验 ,对
其核黄素产量进行比较研究。一般 2%～ 5%接种量最佳。将培养好的种子液按不同的接种量接种于含 15 g
干豆渣、 45 ml水的豆渣基础培养基中 ,在 28℃恒温培养 13 d后 ,取出烘干测定其发酵样品中核黄素产量 ,结
果见图 3。由图 3可知 ,接种量为 5 ml是核黄素最适接种量 ,接种量过高或过低都会使核黄素产量下降 ,接种
量过低会造成营养物质浪费 ,接种量过高会使菌体过量生长 ,从而改变了发酵基质的性质 ,而且由于菌体之
间相互影响 ,不利于核黄素的合成 ,导致核黄素产量下降。综上分析 ,使核黄素产量最高的接种量为 5 ml。
2. 2. 4　添加不同的物质对发酵液中核黄素含量的影响　碳氮源在代谢过程中能否被吸收对核黄素的生成至关重
要 ,豆渣中虽然含有丰富的营养 ,但是纯豆渣中的营养物质不能完全满足阿氏假囊酵母和核黄素生产的需
要。因此以豆渣为基础 ,分别用麸皮 ,玉米糁 ,小米面为添加因子作正交试验。从而得出最佳的培养基成分配
比。为确定本实验碳氮源及各营养因子的成分配比 ,获得以豆渣为基础适合阿氏假囊酵母生长的最佳培养
基 ,本实验决定采用单指标的正交试验 ,用正交表 lg 34来确定 (表 1)。在 9个 500 ml三角瓶中分别称取 15 g
干豆渣 ,加入 45 ml水 ,按下表分别在 1～ 9瓶中加入相应的营养因子 ,经高压灭菌 ,分别接入种子培养物
5 ml, 28℃培养 13 d后 ,经烘箱烘干 ,用 723型分光光度在 445 nm处测吸光值 ,然后计算核黄素产量 ,试验
74 广西工学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷　
表 1　因素水平表
因　　　素
水平 小米面 ( g) 麸皮 ( g) 玉米糁 ( g )
A B C
1 3 3 3
2 3. 75 3. 75 3. 75
3 4. 50 4. 50 4. 50
表 2　培养基成分配比正交试验结果与分析
试验号 A B C 核黄素含量
1 3 3 3 4. 07%
2 3 3. 75 3. 75 4. 56%
3 3 4. 5 4. 15 2. 59%
4 3. 75 3 3. 75 3. 55%
5 3. 75 3. 75 4. 15 4. 13%
6 3. 75 4. 50 3 10. 96%
7 4. 5 3 4. 15 10. 43%
8 4. 5 3. 75 3 7. 605%
9 4. 5 4. 50 3. 75 8. 050%
k1 11. 221% 18. 050% 22. 635%
k2 18. 642% 16. 295% 16. 163%
k3 26. 085% 21. 601% 17. 152%
K1 3. 743% 6. 017% 7. 545%
K2 6. 213% 5. 432% 5. 353%
K3 8. 695% 7. 206% 5. 717%
优水平 A3 B3 C1
Rj 14. 864% 5. 306% 6. 472%
主次顺序 A C B
结果如表 2.
　　正交实验分析如下:
　　 A因素各水平对实验指标的影响。从表 2中
可看出 A1的作用会反映在 1. 2. 3号实验中 , A2
的作用只反映在 4. 5. 6号 , A3的作用只反映在
7. 8. 9号实验中。 A因素 1水平所对应的实验指
标之和为: kA1= y1+ y2+ y3= 4. 07% + 4. 56%
+ 2. 59% = 11. 22% ,其平均值 KA1= 1 /3kA1
= 3. 74% 。 A因素 2水平所对应的实验指标之和
为: k A2 = y4+ y5 + y6 = 3. 55%+ 4. 13%
+ 10. 96% = 18. 64% ,其平均值 KA2= 1 /3kA2
= 6. 213%。A因素 3水平所对应的实验指标之和
为 KA3= y7+ y8+ y9= 10. 43%+ 7. 605%
+ 8. 05% = 26. 085% ,平均值为 KA3= 1 /3kA3
= 8. 695%。 由表 2还可看出考察 A因素进行的
三组实验中 , B、 C因素各水平都出现一次 ,且由于
B、 C间无交互作用 , B、 C因素的各水平的不同组
合对实验无影响 ,因此 ,对 A1、 A2、 A3来说 ,三组
实验条件是完全一样的。如果 ,因素 A对实验无
影响 ,那么 KA1、 KA2、 KA3应该相等 ,但由上面
计算知道 , KA1、 KA2、 KA3实际上不相等 ,显然
这是由于 A因素变动水平引起的 ,因此 , KA1、
KA2、 KA3大小反映了 A1、 A2、 A3对实验指标的影响的大小。由于 ,产生核黄素越高越好 ,而 KA3> KA2>
KA1,所以可判断 A3为 A因素的优水平。
　　同理 ,可以计算并判断 B3、 C1分别为 B、 C因素的优水平 ,而 A、 B、 C三个因素优水平相合为 A3B3C1,
即为本实验的最优水平组合 ,即用阿氏假囊酵母利用豆渣生成核黄素的最优工艺条件为豆渣 15 g、小米面
4. 5 g、麸皮 4. 5 g、玉米糁 3 g、培养温度 28℃、 pH 6. 0、培养时间 13 d。由表 2可比较出极差 Rj的大小 ,即 RA
> RC> RB,所以因素对实验指标影响的主次顺序是 A→ C→ B,即加小米的量影响最大 ,其次是加玉米 ,而麸
皮的量影响最小。 分析结果见表 2。
2. 3　利用黄浆水发酵生产核黄素的工艺条件优化
　　本试验也可以从发酵时间、初始 pH值、接种量、培养基配比等几个因素来考虑 ,通过试验结果分析找出
最佳发酵时间、最佳初始 pH值、最佳接种量和最优培养基配比。即以黄浆水为基础培养基 , pH 6. 4,发酵时
间 7 d,接种量 5 ml。
2. 4　核黄素含量的计算
　　待测样品在 105℃干燥至恒定后 ,精确称取 0. 015 g,加 3%稀释冰醋酸 800 ml, 50℃～ 70℃加热溶解 ,
冷却后加水定容至 1 000 ml作为检液。用维生素 B2标准品同上制作标准溶液 ,以水为参比溶液 ,用 723型分
光光度计在波长 445 nm处测量检液的吸光度 AT及标准溶液的吸光度 AS之后 ,立即向两种溶液中加亚硫
酸氢钠 0. 020 0g ,充分混合 ,脱色 ,测定此二液的吸光度 AT′及 AS′,依据下式可求出核黄素的含量。 操作在
遮光容器中进行。
公式: 核黄素含量 (% )= 核黄素标准样的采取量 ( mg )试样的采取量 ( mg ) × AT- AT′AS- AS′× 100%
2. 5　利用黄浆水发酵核黄素的产量
　　接种过阿氏假囊酵母的五瓶黄浆水培养 7 d后同样用分光光度计法将发酵液离心 ,取上清液 100 ml,加
3%稀释冰醋酸 800 m l,在 50℃～ 70℃加热溶解 ,冷却后加水定容至 1 000 ml作为检液。另外称取维生素
75　第 4期　　　　　　　　　　　　　宋德贵等: 利用豆渣黄浆水发酵生产核黄素的研究
表 3　利用纯黄浆水发酵核黄素的产量
瓶号 1 2 3 4 5
核黄素产量 ( g /L) 0. 60 0. 58 0. 62 0. 57 0. 63
表 4　核黄素发酵工艺条件
培养温度 (℃ ) 培养时间 ( d) 接种量 ( ml) pH值 核黄素含量 (% )
28 13 5 6. 5 8. 43
表 5　添加物成分及添加量
小米面 ( g) 玉米糁 ( g) 麸皮 ( g ) 核黄素含量 (% )
4. 5 3 4. 5 10. 96
B2标准品 0. 015 0 g ,同上制作标准溶液 ,以水
为对照 ,在波长 445 nm处测定吸去值 AT和
AS及 AT′和 AS′,代入公式 ,算出结果如表 3
所示。
3　结论
　　核黄素的生物合成与积累是一个复杂的代
谢过程 ,影响因素很多。本实验对时间、 pH值、
接种量、碳源、氮源等因素对核黄素的生物合成
进行研究。据试验得知利用豆渣发酵生产核黄
素的工艺条件优化如下:
　　由表 3可知 ,利用黄浆水发酵核黄素效果
较为理想 ,经资料对比 ,利用黄浆水发酵核黄素的产量比之其它液体发酵效果较佳 ,因为黄浆水中营养成分
丰富 ,较利于以阿氏假囊酵母生产核黄素。
　　从试验分析可得:
　　 ( 1)在发酵 13 d时 ,核黄素的合成达到最大值 ,继续发酵则菌体开始解体自溶 ,核黄素合成趋于停滞 ,故
13 d为最适宜发酵时间 ,核黄素产量为 4. 232% ;
　　 ( 2)初始 pH值对菌体生长及核黄素产量均有显著影响。最适 pH值为 6. 5时 ,核黄素产量为 4. 162% .
　　 ( 3)接种量过低或过高均影响到发酵时核黄素产量 ,而接种量在 5ml时产量最高 ,核黄素含量为
8. 43% 。接种量过高菌体生长旺盛 ,且不利于核黄素的合成 ,过低则造成营养物质的浪费。
　　 ( 4)向固体发酵培养基中加入不同物质改变其碳氮源组份可以提高其核黄素产量 ,由于其营养成分及含
量不同 ,由正交实验知 ,在小米面 4. 5 g、玉米糁 3. 0 g、麸皮 4. 5 g时效果最佳 ,经优化后取得了较好的效果 ,
产量有了很大提高 ,核黄素含量最高为 10. 96% .
参　考　文　献:
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76 广西工学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷　
Study on production of riboflavin with
waste water or residues of food industry
SON G De-gui, WEI Jun, YANG Sheng-yu
( 1. School of Life Science, Guangxi Normal Universi ty, Guilin 541004, China;
2. Zheng zhou Light Indust ry College, Zheng zhou 450052, China;
3. Henan University, Kai feng 475001, China)
Abstract: In this article, the production of ribof lavin with waste water or residues of food industry by
eremo thecium ashbyii was studied. Results of the orthogonal test show ed that the optimum culture medium
comprises 15 g resides of bean curd production, 4. 5 g wheat bran, 4. 5 g millet , 3. 0g corn and supplemented
w ith 81 m l H2O, pH 6. 5. The optimum ferment temperature w as observ ed at 28℃ . The maximum amount of
Ribof lavin was found approximately on 13th day.
Key words: ribof lavin; eremothecium ashbyii; fermentation; orthogonal test
(责任编辑　赖君荣 )
(上接第 68页 )
follow s: g ravitation sampling , the height is 15cm , the time is 30 sec; running voltage is -18kv; bouncy silica :
75μm i. d. , total length 60 cm, 42 cm from the inlet to UV detection; electrolyte: 50 mmol /L sodium
tetrabora te and 0. 5 mmol /L cety l trimethy l ammonium bromide, pH= 8, solv ent is 30% (V /V) ethyl alcohol
and w ater. The result prov ed to be satisfacto ry.
Key words: capillary zone elect rophoresis; rhizoma picrorhizae; cinnamic acid
(责任编辑　赖君荣 )
(上接第 72页 )
Other material resources are compared for the preparations of CCM. Using the above conditions, it w as found
that the productivity of CCM from oysters is higher than that f rom the clam shells. However, the solubi lities of
both types of CCM are excellent. The amounts of the 29 trace and heavy elements in oyster CCM are in
acco rdance with the criterions of Chinese and US government regulations for calcium additives.
Key words: calcium supplement; oyster shells; clam shells; calcium ci trate-malate; Chinese herb
(责任编辑　赖君荣 )
77　第 4期　　　　　　　　　　　　　宋德贵等: 利用豆渣黄浆水发酵生产核黄素的研究